Bộ y tế viện dinh dỡng ZY báo cáo tổng kết đề tài xác định d lợng penicillin g và v trong thực phẩm bằng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Chủ nhiệm đề tài: ThS. Trần quang thủy 7106 16/02/2009 Hà Nội - 2008 1 MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức khoẻ con người. Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên, do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiệm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới. Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ. Penicillin là kháng sinh thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn. Ban đầu, nó được hoan nghênh như một thứ thuốc thần kì và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ hai. Mặc dù Penicillin đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật, nhưng việc lạm dụng nó trong chăn nuôi có thể dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc, giảm khả năng kinh tế của vật nuôi, gây thiệt hại cho người chăn nuôi. Hơn thế nữa tồn dư Penicillin trong sản phẩm chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như: ngộ độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dung hoặc làm cho người tiêu dung cũng bị kháng thuốc… Việc phát triển các kĩ thuật xác định lượng tồn dư Penicillin trong thực phẩm phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước sẽ trở thành công cụ hữu hiệu giúp các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm Penicillin 1.1.1 Đại cương Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện một nấm mốc thuộc giống Penicillium ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Fleming gọi chất kháng khuẩn chưa được biết tới này là Penicillin. 10 năm sau, một nhóm các nhà khoa học thuộc trường Đại học Oxford bắt đầu nghiên cứu chất này trên chuột thí nghiệm. Penicillin được hoan nghênh như một thứ thuốc thần kỳ và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ II [5] Penicillin là kháng sinh thể hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn. Penicillin được chiết ra từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum. Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dưng Staphylococcus, Diplococcus nhưng hầu như không có tác dụng chống vi khuẩn gram âm và nấm men. Vài thập niên trở lại đây đã phát hiện ra nhiều loại pencillin mới trong đó một số có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm và nấm men như Saccharomyces cerevisae đơn bội và E.coli [5] 1.1.2 Phân loại Pencillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm một vòng tiasolidin, một vòng β-lactam, một nhóm amino có gắn với CO 2 và một mạch bên (R). Hai loại Penicillin được tổng hợp đầu tiên là benzylpenicillin(PenicillinG; R = C 6 H 5 CH 2 -) và Phenoxymethylpenicillin (PenicillinV; R = C 6 H 5 OCH 2 -). Và một số loại bán tổng hợp: Amoxycillin, Ampicillin, Oxacillin, Cloxacillin [5] Hình 1: Cấu trúc chung của các penicillin Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phổ hoạt động của chúng. Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và amoxicillin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram dương và một số vi khuẩn kỵ khí. Các chất này dễ bị beta-lactamase phá huỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase. Ampicillin và amoxicillin có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm. Amoxicillin đã thay thế penicillin V làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó. M ¹ ch bªn Vßn g thiazolindine Vßng β-lactam 3 1.1.3 Tác dụng của Penicillin Giống như các họ kháng sinh khác, penicillin có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh. Cơ chế tác dụng chung như sau: Peptidoglycan là thành phần cơ bản tạo nên tính vững chắc của vách tế bào vi khuẩn. Quy trình tổng hợp peptidoglycan được thực hiện nhờ enzym D-alanin transpeptidase. Do là axit, các penicillin có khả năng acyl hoá các D-alanin transpeptidase, làm cho các enzym này không thể tham gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan. Sinh tổng hợp vách tế bào bị gián đoạn, vi khuẩn không thể tồn tại. Mặt khác, các penicillin còn hoạt hoá enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân huỷ vách tế bào vi khuẩn, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. 1.1.4 Tác hại của penicillin khi tồn dư trong thực phẩm Phần lớn các kháng sinh an toàn khi sử dụng đúng. Tuy nhiên dù ít hay nhiều chúng đều có thể gây ra các tác dụng không mong muốn và tai biến. Penicillin là kháng sinh ít độc, ít tác dụng không mong muốn, ngoại trừ phản ứng dị ứng. Các sản phẩm phân huỷ kết hợp với protein tạo thành các kháng nguyên là nguyên nhân của dị ứng và tuỳ theo cơ địa từng người phản ứng ở mức độ nào. ¾ Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm như sau: Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi + Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc. + Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh + Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh gia súc. + Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để bảo quản súc sản lâu hư. + Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi. Hai là, có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm. Do vận chuyển sản phẩm đi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bảo quản. Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm chăn nuôi, thủy sản tồn dư kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ. 1.2 Giới thiệu về Penicillin G và Penicillin V 1.2.1 Thông tin chung 4 Bảng1: Thông tin chung về penicillin G và V Penicillin (KLPT) Danh pháp (IUPAC) Cấu trúc hóa học pKa T 1/2 Penicillin G (334,4) (2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7- oxo-6-[(2- phenylacetyl)amino]-4- thia-1- azabicyclo[3.2.0]heptane-2- carboxylic acid 2,76 Penicillin V (350,39) (2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7- oxo-6-[[2- (phenoxy)acetyl]amino]-4- thia-1- azabicyclo[3.2.0]heptane-2- carboxylic acid 2,73 30 - 40 phút 1.2.2 Tính chất và tác dụng Penicillin G và Penicillin V là hai penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi cấy nấm penicillium chrysogenum. Chúng được chỉ định trong bệnh nhiễm khuẩn thông thường: nhiễm khuẩn đường hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết… Penicillin G và V có độc tính thấp, nhưng cũng giống như các penicillin khác dễ gây dị ứng thuốc: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban, hội chứng Stevens- johnson và Lyell, nguy hiểm nhất là shock phản vệ. Ngoài ra có thể gây viêm t ĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu. 1.2.3 Tình hình sử dụng Penicillin Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài gia súc, gia cầm cũng như các loài thủy sinh, nhưng việc sử dụng bừa bãi trong chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị kháng thuốc. Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu Pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh 5 nhóm Lonophore và Arsen chiếm nhiều nhất (47,5%) Tetracycline (15,67%), Penicillin (4,26%), và các loại khác (32,57%). Theo một báo cáo của Uỷ ban sử dụng dược phẩm trong thức ăn chăn nuôi trực thuộc Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia( NRC) (Mỹ), thiệt hại do lệnh cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi có thể lên tới 2,5 tỷ USD mỗi năm. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã cảnh báo những hiểm hoạ mà loài người có thể phải đối mặt do sự kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh gây ra và WHO đang thúc đẩy một chương trình khuyến cáo tất cả các nước tiến tới cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh như chất kích thích sinh trưởng. Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra sơ bộ của Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam cho thấy: có tới 75% số mẫu thịt và 66,7% số mẫu gan của gia súc, gia cầm bán ở các chợ có mức tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng cho phép. 1.2.4 Giới hạn cho phép Trước tình hình các chất kháng sinh được sử dụng tràn lan dẫn đến tồn dư trong thực phẩm có nguy cơ gây hại cao cho sức khỏe người tiêu dùng, nhiều nước trên thế giới đã đưa ra giới hạn cho phép của dư lượng penicillin trong các loại thực phẩm như sau: Bảng 2: Giới hạn cho phép tồn dư penicillin G và V trong thực phẩm Quốc gia EU Việt nam [6] (46/2007/QĐ-BYT) TCN thuỷ sản Sũa Gan, bầu dục Thịt Thịt Gan Thận Sũa Penicillin G (ppb) 4 50 50 50 50 50 4 50 Thịt Penicillin V (ppb) 25 1.3 Các phương pháp xác định Penicillin 1.3.1 Trong nước Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 [9] đã qui định phương pháp gián tiếp sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và sản phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này dựa vào phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử phenaltrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ hấp thụ 6 nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy pha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp này phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin. Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi n ền mẫu bằng dung dịch đệm phosphat, pH 9, làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất hoá và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA. Qui trình này trải qua quá trình dẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản. 1.3.2 Thế giới a) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS Tác giả Titus A.M.Msagati [13] và cộng sự đã xác định dư lượng các β -lactam trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng - khối phổ. Các tác giả đã chiết và làm sạch mẫu sử dụng hỗn hợp đệm phosphat, tetraethylammonium clorua Et 4 NCl và acetonitril. Sau đó, các β-lactam sẽ được tách và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với Penicillin G và penicillin V trong gan và bầu dục là 1 ng/kg ; trong sữa là 0,7 µg/L. b) Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion với detector UV Tác giả Yuko Ito [14] và cộng sự thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản) đã ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin: Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong thịt. Các penicillin được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bò với NaCl 2%, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc ký lỏng cặp ion với detectơ tử ngoại. Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 73 - 95%. Giới hạn phát hiện của phương pháp cho các penicillin là 0,02 mg/kg. c) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nă ng cao Tác giả E.Benito-Pena [11] và cộng sự thuộc trường đại học Madrid (Tây Ban Nha) đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại – diot aray (UV-DAD) để xác định đồng thời các kháng sinh nhóm beta-lactam (Penicillin G, amoxicillin, ampicillin, Penicillin V, axacillin, dicloxacillin, và nafcillin) trong nước thải. Hai kĩ thuật SPE được so sánh cho quá trình làm sạch và làm giàu mẫu: cột silica pha đảo C18 và cột trao đổi anion hỗn hợp MAX. Các penicillin được định lượng bằng sắc ký lỏng sử dụng cột tách C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện với detectơ tử ngoại tại bước sóng 220nm. Cột MAX cho hiệu suất thu hồi cao hơn, nằm trong khoảng 82 – 97% và giới hạn phát hiện từ 8 – 24 ng/L 7 Tác giả Lambert K. Sorensen [12] và cộng sự ( Đan Mạch ) đưa ra quy trình xác định đồng thời 7 penicillin trong thịt, gan, bầu dục gia súc và lợn bằng phương pháp HPLC. Các penicllin được tách ra khỏi mẫu bằng H 2 O, loại các tạp chất hữu cơ với hỗn hợp acid sulphuric và natri tungstat. Dịch chiết được làm sạch qua cột chiết pha rắn Oasis HLB, được dẫn xuất hoá với anhydric benzoic, 1, 2, 4 - triazole và HgCl 2 . Các penicillin được tách và định lượng trên cột C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện bằng detectơ tử ngoại tại bước sóng 323nm. Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp là từ 8,9-11,1 µg/kg đối với amoxicillin, penicillin G, ampicillin, oxacillin, nafcillin và 18,3- 20,9 µg/kg cho đicloxacillin. 8 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh học, nhằm làm vật nuôi mau lớn. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ. Mục tiêu của đề tài là: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ nhạy và độ chính xác cao. Phân tích một số mẫu thực tế để thẩm định lại qui trình. 2.2 Phương pháp nghiên cứu Việc phát triển các kỹ thuật xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm là rất cần thiết giúp cho các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Để phù hợp với điều kiện của hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại để phát hiện và định lượng penicillin G và V. Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây: 2.2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn)[4].Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do v ậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Hình 2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 9 Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính: - Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích. - Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ. - Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuếch đại, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu. • Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết. 2.2.2 Phân tích định tính và dịnh lượng trong HPLC Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu. Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào. Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phương pháp là phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định l ượng. Việc dùng phương pháp nào trong hai phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích H i = k 1. C i S i = k 2 . C i H i , S i là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i C i là nồng độ chất i K 1 , k 2 là các hằng số thực nghiệm Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành [...]... thấy phương pháp HPLC phù hợp cho việc xác định dư lượng Penicillin G v V trong thực phẩm Đồng thời cũng mở ra một hướng mới trong việc dùng phương pháp này xác định các chất còn lại của nhóm kháng sinh Penicillin: Amoxicillin, ampicillin, cloxacillin, nafcillin… Chúng tôi hi v ng kết quả thu được từ đề tài này sẽ được hoàn chỉnh thành thường qui xác định dư lượng penicillin G v V trong thực phẩm, g p... dẫn xuất v i hỗn hợp 1,2,4-triazole v thuỷ ngân (II) clorid, phát hiện v định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao v i detectơ tử ngoại 2 Phạm vi áp dụng Phương pháp này áp dụng cho thịt, gan, thận gia súc, gia cầm, thuỷ hải sản 3 Thiết bị,dụng cụ v hoá chất 3.1 Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC v i detectơ PDA hoặc UV-VIS - Cột sắc ký C18 (250mm × 4,6mm × 5µm) - Hệ chiết... using liquid chromatography with ultraviolet detection, Journal of Chromatography A, 855 247-253 34 Thường quy kĩ thuật Xác định dư lựơng penicillin G v V trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1 Nguyên tắc Penicillin G v V được tách ra khỏi nền mẫu bằng nước cất, loại các tạp chất hữu cơ bằng hỗn hợp acid sulphuric v natri tungstat, làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE, dẫn xuất v i... C ' .V m H= (Cm+c − Cm ) × m × 100 mc Trong đó: C: nồng độ Penicillin xác định được ( g/ g) C': nồng độ Penicillin tính từ đường chuẩn ( g/ ml) V: thể tích định mức trước khi bơm v o HPLC ( V = 1ml) 28 m: khối lượng mẫu (g) Cm+c : nồng độ Penicillin xác định được trong mẫu thêm chuẩn ( g/ g) Cm: nồng độ Penicillin có trong mẫu ( g/ g) mc: lượng Penicillin thêm v o ( g) Bảng 11: Hiệu suất thu hồi pen G ở... tích.ĐHKHTN [8] TCN 197-2004: Penicillins trong sản phẩm thuỷ sản: Phưng pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [9] TCVN 5147-90: Thịt v sản phẩm thịt Phương pháp xác định dư lượng Penicillin [10] Trần Tứ Hiếu, Từ V ng Nghi, Nguyễn V n Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003) Hoá học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ [11] E Benito-Pena, A.I Partal-Rodera (2006), Evaluation of mixed mode... dung dịch chuẩn v dung dịch thử 2.3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin G - Dung dịch chuẩn g c Penicillin G 1000mg/l: cân chính xác 0, 1g chuẩn Penicillin G, hoà tan v định mức bằng nước cất đến 100 ml - Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn g c penicillin G 1000 mg/l cho v o bình định mức 100ml v định mức đến v ch bằng nước cất 2.3.3.2 Chuẩn bị dung... chuẩn Penicillin V - Dung dịch chuẩn g c Penicillin V 1000mg/l: cân chính xác 0, 1g chuẩn Penicillin V, hoà tan v định mức bằng nước cất đến 100 ml - Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn g c penicillin V 1000 mg/l cho v o bình định mức 100ml v định mức đến v ch bằng nước cất 2.3.3.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 2 penicillin 2 g/ ml: hút chính xác. .. Tetracylines trong thức ăn gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoá luận tốt nghiệp, 2006 [4] Nguyễn V n Ri (2004), Chuyên đề các phương pháp tách chất.ĐHKHTN [5] Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị áng (1999), Hoá sinh học NXB Giáo dục [6] QĐ 46/2007/QĐ-BYT, Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học v hoá học trong thực phẩm [7] Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hoá phân... PenG 13.088 12755 1.0 1.0 0.0 0.5 mAU 1.5 KẾT LUẬN V KHUYẾN NGHỊ Trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, v i mục đích xây dựng được phương pháp HPLC để xác định dư lượng Penicillin G v V trong thực phẩm, kết quả chúng tôi thu được như sau: - Đã khảo sát v chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký: chọn cột tách, chọn bước sóng phát hiện, pH pha động, thành phần pha động, chương... Đường chuẩn của penicillin G v V 3.3.2 Xác định giới hạn phát hiện LOD v giới hạn định lượng LOQ - Giới hạn phát hiện được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn g p 3 lần tín hiệu đường nền (S/N = 3) [7] Sử dụng nền mẫu thịt không phát hiện penicillin, thêm chuẩn hỗn hợp 2 penicillin (bắt đầu từ giới hạn dư i của đường chuẩn), dẫn xuất v tiến hành chạy sắc ký . toàn thực phẩm. Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc v . của phương pháp này đối v i Penicillin G v penicillin V trong gan v bầu dục là 1 ng/kg ; trong sữa là 0,7 g/ L. b) Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion v i detector UV Tác giả Yuko Ito [14] v . phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao v i detectơ tử ngoại để phát hiện v định lượng penicillin G v V. Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dư i đây: 2.2.1 Nguyên tắc chung v phương pháp