Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản Mã ngành : 62 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. NGUYỄN HỮU DŨNG 2. GS.TS. HEIDRUN I. WERGELAND KHÁNH HÒA - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP KHÁNH HÒA - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi trong suốt thời gian từ năm 2007-2012 dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của Thầy Cô hƣớng dẫn. Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Khánh Hòa, năm 2014 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mô hình hóa ven biển và quản lý sức khỏe cá- NUFUPRO 2007/10086” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và hỗ trợ toàn bộ kinh phí cho tôi thực hiện luận án. Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi muốn dành riêng cho hai Thầy Cô giáo hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Dũng và Giáo sƣ Heidrun I. Wergeland đã định hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam đã cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS. Lê Văn Bé, TS. Phạm Quốc Hùng, TS. Đặng Thúy Bình, ThS. Nguyễn Thị Thoa đã sẵn lòng giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu, chia sẻ kinh nghiệm và động viên tinh thần trong quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch - Khoa sinh học - Trƣờng đại học Bergen: TS. Ragnhild A. Jakobsen, TS. Gyri T. Haugland, TS. Eirin F. Pettersen, NCS Anita Ronneseth và KS. Paul H. Lovik đã tận tình hƣớng dẫn các kỹ thuật phân tích các thông số miễn dịch trong thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại Trƣờng Đại học Bergen, Nauy. Cuối cùng, tự đáy lòng cho phép tôi đƣợc bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu sắc nhất đến những ngƣời thân yêu của tôi: Má, anh chị, chồng tôi Nguyễn Văn Hùng và con gái Nguyễn Anh Thi đã luôn bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn và tri ân tất cả tình cảm và sự giúp đỡ quý báu đó. Khánh Hòa, năm 2014 Nguyễn Thị Thanh Thùy iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides 4 1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu 4 1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam 6 1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi 8 1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển 10 1.2.1. Vi khuẩn Vibrio 10 1.2.2. Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển 15 1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng 17 1.3.1. Miễn dịch tự nhiên 18 1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu 23 1.3.3. Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch ở cá 27 1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá 29 1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi 29 1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi 30 1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam 36 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 40 2.1.1. Đối tƣợng 40 2.1.2. Vật liệu 40 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 41 2.1.4. Thời gian nghiên cứu 41 iv 2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án 42 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 42 2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 42 2.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú chấm cam 45 2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam 50 2.3.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 52 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 56 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 57 3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam 57 3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa 57 3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 59 3.1.3. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với cá mú chấm cam 67 3.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam 70 3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế bào máu của cá mú chấm cam 71 3.2.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú chấm cam 74 3.2.3. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam 77 3.2.4. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam 80 3.2.5. Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam 83 3.3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 86 3.3.1. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam 86 3.3.2. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA 88 v 3.3.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA 89 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 102 Kết luận 102 Đề xuất ý kiến 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có) BA BHI CFU CMI CRP DI ĐƢMD FCA FIA HGNNV HI HRP i-ELISA Ig IgM IL-1 kDa LD 50 LPS MAC MAM MHC II NB NCC NK NTTS Blood agar base Brain Heart Infusion Colony Forming Unit Cell-Mediated Immunity C-reaction protein Direct Immersion Freund’s complete Adjuvant Freund’s Incomplete Adjuvant Humpback grouper nervous necrosis virus Hyperosmotic Immersion Horseradish peroxidase indirect Enzyne Linked Immunosorbent Assay Immunoglobulin Immunoglobulin M Interleukin 1 Kilo Dalton Lethal dose 50 Lipopolysacharides Membrane attacking complex Multivalent Adhesion Molecule Major histocompatibility complex Nutrient Broth Non-specific cytotoxic cell Natural killer cell Môi trƣờng thạch máu Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn Miễn dịch qua trung gian tế bào Protein phản ứng C Ngâm trực tiếp Đáp ứng miễn dịch Chất bổ trợ toàn phần Freund Chất bổ trợ bán phần Freund Loại virus gây hoại tử thần kinh ở cá mú lƣng gù Ngâm trong dung dịch ƣu trƣơng Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme gián tiếp globulin miễn dịch globulin miễn dịch lớp M Đơn vị tính khối lƣợng phân tử protein Liều gây chết 50% Phức hợp tấn công màng Phân tử gắn kết đa trị Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II Môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng Tế bào độc không đặc hiệu Tế bào diệt tự nhiên Nuôi trồng thủy sản vii OD OMP PA PBS RBA RPS RPP SAP SDS- PAGE sIg TCBS TDH TLH αTNF TNGB TSA TSB TRH Vibriosis VNN VSV Optical Density Outer Membrane Protein Phagocytosis activity Phosphate Buffered Saline Respiratory burst activity Relative Percent Survival Relative Percent Protection Serum Amyloid Protein Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis Surface immunoglobuline Thiosulphate citrate bile salt agar Thermostable direct haemolysin Thermolabile haemolysin alpha Tumor Necrosis Factor Trypticase Soya Agar Trypticase Soya Broth tdh-related hemolysin Viral Nervous Necrosis Mật độ quang Protein ngoại mạc Hoạt tính thực bào Dung dịch đệm muối photphat Hoạt tính bùng nổ hô hấp Hệ số sinh tồn tƣơng đối Hệ số bảo vệ tƣơng đối Protein huyết thanh dạng sợi Điện di trên gel polyacrylamide có SDS Phân tử globulin miễn dịch bề mặt Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Vibrio Độc tố gây dung huyết bền nhiệt Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt Yếu tố anpha gây hoại tử khối u Tác nhân gây bệnh Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tổng hợp Môi trƣờng lỏng dinh dƣỡng tổng hợp Độc tố gây dung huyết liên quan tdh Bệnh do vi khuẩn Vibrio Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút Vi sinh vật viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi 9 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 60 Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides 72 Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau 2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan 74 Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam khi đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau 77 Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides 99 [...]... cho phép của Trƣờng Đại học Nha Trang, đề tài Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton ,1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đã đƣợc thực hiện Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là làm rõ đặc điểm đáp ứng miễn dịch (ĐƢMD) ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V parahaemolyticus 3 Nội dung nghiên cứu: 1 Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V parahaemolyticus. .. loài các chủng vi khuẩn Vibrio 63 Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng Vibrio parahaemolyticus 66 Hình 3.6: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 68 Hình 3.7: Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá mú chấm cam Epinephelus coioides khi bị cảm nhiễm bởi Vibrio parahaemolyticus với các chủng và mật độ vi khuẩn khác nhau 68 Hình 3.8: Hình ảnh các... parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam 2 Nghiên cứu ĐƢMD không đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V parahaemolyticus và ảnh hƣởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến đáp ứng này 3 Nghiên cứu ĐƢMD đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án: 1 Về khoa học: Kết quả của luận án đóng góp những thông... sản lƣợng cá mú nuôi cao nhất thế giới và đối tƣợng đƣợc nuôi phổ biến nhất là cá mú chấm cam Tại Vi t Nam, nghề nuôi cá mú bắt đầu hình thành từ năm 1988, đƣợc duy trì và phát triển đến ngày nay Vùng nuôi cá mú tập trung ở Hải Phòng, Quảng Ninh, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu Các đối tƣợng nuôi chủ yếu bao gồm cá mú chấm cam E coioides, cá mú chấm đen E malabaricus, cá mú chấm đỏ E akaara, cá mú 8 sỏi... máu cá mú chấm cam Epinephelus coioides 72 Hình 3.9: Chỉ số thực bào của bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides 78 Hình 3.10: Hình ảnh thực bào của các tế bào bạch cầu mô thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides 79 Hình 3.11: Hoạt tính RB của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides 81 Hình 3.12: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm. .. Vibiosis cho cá biển nuôi và đặc biệt là cá mú chấm cam tại Vi t Nam Tính mới của luận án 1 Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học ở cá biển nói chung và cá mú nói riêng tại Vi t Nam 2 Luận án là một trong số ít công trình đầu tiên tại Vi t Nam nghiên cứu về ảnh hƣởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến ĐƢMD không đặc hiệu của cá mú chấm cam thông qua... TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides 1.1.1 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu Hệ thống phân loại: Ngành động vật có xƣơng sống Vertebrata Lớp cá xƣơng Osteichthys Bộ cá vƣợc Perciformes Họ cá mú Serranidae Giống cá mú Epinephelus Loài cá mú chấm cam: Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) [163] Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides Tên tiếng Anh: Orange-spotted... ngƣời nuôi 1.2 Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển 1.2.1 Vi khuẩn Vibrio Hệ thống phân loại: Khóa phân loại của Bergey [90] Ngành : Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ : Vibrionales Họ: Vibrionaceae Giống: Vibrio Loài: V parahaemolyticus Đặc điểm hình thái cấu tạo, sinh thái, sinh lý và sinh hóa Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae có đặc điểm chung là vi khuẩn. .. chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở ngày thứ nhất (a) và ngày thứ 15 (b) sau khi ngừng cho ăn β-glucan 83 x Hình 3.13: Kết quả phân tích phân tử globulin miễn dịch (IgM) của cá mú chấm cam bằng các kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot .86 Hình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. .. bƣớc sóng 490 nm 88 Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam Epinephelus coioides với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật Western Blot 90 Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides sau khi gây miễn dịch bằng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 đã bất hoạt bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật . miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú chấm cam 45 2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam 50 2.3.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn. THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy. loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa 57 3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 59 3.1.3. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với cá mú chấm cam