Đang tải... (xem toàn văn)
Một bài tiểu luận phân tích mang tính tham khảo cho các bạn học kỹ thuật hoá học, phân tích, các học viên cao học, bài trình bày các phương pháp phân tích protein.
Page 1 Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh Trường Đại Học Bách Khoa Đề tài: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PROTEIN SỬ DỤNG HPCL VÀ LC-MS GV: TS. Huỳnh Khánh Duy HV: Nguyễn Thị Kim Liên MSHV: 130505189 TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2014 Page 2 MỤC LỤC I. Khái niệm về kĩ thuật sắc kí…………………………………………… 3 II. Phương pháp HPCL…………………………………………………… 4 1. Khái niệm HPLC……………………………………………………… 4 2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột…………………………….7 3. Phân loại sắc ký ………………………………………………………….8 4. Ưu – nhược điểm của HPLC……………………………………………9 5. Phân tích protein bằng HPLC………………………………………….10 6. Phân tích AMINO ACID bằng phương pháp HPLC…………………12 7. Ứng dụng của phương pháp HPLC trong công nghệ thực phẩm…….13 III. PHƯƠNG PHÁP LC-MS………………………………………………16 1. Khái niệm LC-MS……………………………………………………… 16 2. Nguyên lý chung………………………………………………………….17 4. Nguồn ion hóa trong đầu dò khối phổ………………………………… 19 5. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ……………………… 23 6. Ứng dụng………………………………………………………………… 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Page 3 CC PHNG PHP PHN TCH PROTEIN S DNG HPLC v LC-MS. I. Khỏi nim v k thut sc kớ Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích ( xác định ) các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hoá học,vật lý và hoá lý của các chất trong những điều kiện nhất định. Các tính chất đó có thể là: Tính chất hấp phụ của chất rắn, Tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion, Sự rây phân tử theo kích thớc của chúng Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử, Sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau, Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha động khi tiến hành tách sắc ký. Đó là Kỹ thuật phân tích sắc ký khí và 2. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng. Trong kỹ thuật sắc ký lỏng lại đợc chia thành hai nhóm, đó là: + Sắc ký lỏng áp suất thờng ( sắc ký cổ điển), và + Sắc ký lỏng hiệu suất cao ( áp suất cao: (HPLC). Page 4 Và hiện nay ( sau năm 2000 ) đã có sắc ký lỏng siêu áp, loại này làm việc với áp suất cao từ 900-1500 bar ( UHPLC: 900-1500 bar ). Trong sắc ký cột ( có dạng rắn-lỏng hay lỏng-lỏng ), kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất thờng đã ra đời và đợc ứng dụng từ lâu ( đã trên 60 năm ). Nhng hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng nh dung môi để chạy sắc ký. Ngợc lại kỹ thuật HPLC tuy mới ra đời và phát triển khoảng trên chục năm lại đây, nhng hiện nay đang đợc phát triển rất nhanh và đã ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học, sản xuất và công nghệ. Vì kỹ thuật tách sắc ký HPLC này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao và tốn ít thời gian cũng nh tốn ít mẫu. Nói chung trong khoảng 15 năm qua, kỹ thuật phân tích HPLC đã chiếm đến gần 70 tổng số các công trình nghiên cu và ứng dụng về sắc ký. Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: Sắc ký lớp mỏng áp suất cao ( HPTLC ). Sắc ký cột lỏng áp suất cao hay sắc ký lỏng hiệu suất cao ( HPLC ). Trong nhóm HPLC, tuỳ theo bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách mà ngời ta chia thành: 1. Sắc ký phân bố ( PC ) của chất tan giữa hai pha không tan ( trộn) vào nhau. 2. Sắc ký hấp phụ pha thờng ( NP-HPLC ), 3. Sắc ký hấp phụ pha ngợc hay pha đảo ( RP- HPLC ), 4. Sắc ký trao đổi ion ( IE X -HPLC ) và cặp ion ( IP-HPLC ), 5. Sắc ký rây phân tử ( FG-HPLC ). II. Phng phỏp HPCL Page 5 1. Khái niệm HPLC Sắc ký (Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký. Sắc ký là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Page 6 HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thực phẩm . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thực phẩm cho phép kiểm định tính và định lượng. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút. Số lượng mẩu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20microlit. Page 7 2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột: Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký . Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion . Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết . Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử . Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác. Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) và ngược lại . Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết Page 8 định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn . Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột. (như hình dưới đây ) 3. Phân loại sắc ký Sắc ký hấp phụ : Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loại như sau : Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ : Page 9 - Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực - Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi. Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP ) Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau : - L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm - L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm - L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH 2 , CN . . vv 4. Ưu – nhược điểm của HPLC 4.1 Ưu điểm của HPLC - Tốc độ nhanh (nhiều phân tích <30 phút) - Độ phân giải cao (nhiều loại pha tĩnh) - Độ nhạy cao (kết hợp nhiều loại Detector) - Tái sử dụng cột Page 10 - Hữu ích trong việc phân tích các cấu tử có phân tử lượng lớn hoặc ion hóa (có độ bay hơi thấp) - Mẫu dễ thu hồi (nên cũng có thể sử dụng để phân tách hỗn hợp) 4.2 Nhược điểm của HPLC Thiết bị đắt tiền, đầu tư ban đầu cao 5. Phân tích protein bằng HPLC [...]... ca Protein tng lờn khi cỏc phõn on Protein c chy qua nhiu ct sc ký khỏc nhau thụng thng mt ct sc ký n l khụng tinh sch c mt loi phõn t Protein mong mun no ú dự quỏ trỡnh sc ký c lp i lp li nhiu ln thay vo ú ngi ta thng phi ỏp dng mt chui cỏc bc k thut cú th thu c phõn on cha mt lng ln loi phõn t Protein c hi lu trong dung dch mui m c t ct tớch in dng (i vi Protein tớch in õm) hoc c hi lu sc ký lc. .. trung hũa cỏc vựng mang in tớch phi cho phộp cỏc phõn t Protein c gii phúng ra khi ct).Bng vic tng dn nng mui trong cỏc dung dch m thu hi mu, cỏc phõn t Protein khỏc nhau hoc gn ging nhau u c tỏch thnh phõn on khỏc nhau khi chỳng c hi lu t ct Phng phỏp ny cho phộp phõn tỏch cỏc loi Protein trờn c s c im khỏc Phng phỏp sc ký lc gel : nhau ca cỏc loi Protein v hỡnh dng v kớch thc Khỏc vi trong phng phỏp... mu thuc ú khụng cú hot cht cn phõn tớch hay mu thuc ú l gi - Bờn cnh vic kim tra thuc Labo cũn ng dng HPLC trong cỏc nghiờn cu th nghim lõm sng thuc st rột mi nh Artekin (dihydroartemisinine + piperaquine), Artequick (artemisinine + piperaquine) v ỏnh giỏ hiu lc ca thuc st rột hin dựng - Ngoi ra HPLC cũn c ng dng rng rói trong ngnh cụng ngh thc phm Xỏc nh axit hu c trong lỏ, v qu ba khụ c bng phng... trờn 2D Gel thng l thuc v mt Page 25 protein Nu cn bit nh danh ca protein ú, thỡ cú th xem xột vt gel ú Khi peptit kt qu t tỏc ng ca enzym lờn protein cú th c xỏc nh bng khi ph dựng ly du khi peptit Nu thụng tin ny khụng cho phộp xỏc nh danh tớnh ca protein mt cỏch chớnh xỏc, cỏc peptit ca nú cú th xem l thuc v o ph khi tandem Cú 2 cỏch chớnh trong khi ph xỏc nh protein Ly du khi peptit (PMF) dựng... mt lng ln loi phõn t Protein c hi lu trong dung dch mui m c t ct tớch in dng (i vi Protein tớch in õm) hoc c hi lu sc ký lc gel (i vi Protein kớch thc nh), cỏc kớch thc ny n l thng khụng thu c 1 sn phm Protein c tinh sch hon ton 6 Phõn tớch AMINO ACID bng phng phỏp HPLC Sc ký lng l phng phỏp phõn tớch amino acid ph bin nht hin nay Sau hn 50 nm k t khi cụng trỡnh phõn tớch amino acid t ng u tiờn c cụng... ngn ngi cht vỡ thuc gi v thuc kộm cht lng gúp phn vo chin dch ny, Labo kim nh hoỏ cht v thuc ca Vin ó ng dng k thut sc ký lng cao ỏp (HPLC) kim tra hot cht chớnh cú trong 2 loi thuc sot rột l Artesunate v Chloroquine Page 14 - c tin hnh trờn mỏy sc ký lng cao ỏp (HPLC) hiu Agilent 1100 vi u dũ UV-VIS, cht chun c mua ti Vin kim nghim cú tinh khuyt trờn 99% Cõn mu v chun mt liu lng nh nhau v chy trờn... kớch thc khỏc nhau Cỏc phõn t Protein cng nh cng cú nhiu kh nng thõm nhp vo tt c cỏc l, vỡ vy thi gian chy qua ct di hn v thi gian hi lu mun hn Ngc li cỏc phõn t Protein kớch thc cng ln cng cú thi gian hi lu sm hn i vi loi ct, cỏc phõn on sc ký c thu cỏc nng mui khỏc nhau hoc cỏc thi gian hi lu khỏc nhau thu c tng loi Protein c quan tõm nghiờn cu Cỏc phõn on hot tớnh Protein c quan tõm cao nht s tớch... cỏc c s kim nghim ti Vit Nam 6.2 Phõn tớch protein Protein m cỏc nh nghiờn cu sinh hc quan tõm thng l s kt hp phc tp ca nhiu protein v phõn t khỏc nhau, cựng tn ti trong mt mụi trng sinh hc iu ny t ra hai vn chớnh Th nht, hai k thut ion húa dựng cho cỏc phõn t ln ch lm vic tt khi m hn hp t cỏc thnh phn cú cu to gn ging, trong khi trong cỏc mu sinh hc, cỏc protein khỏc nhau thng l cú lng khỏc bit nhau... ion hay MALDI, thỡ nhng protein dng m d tha nhiu cú xu hng gim tớn hiu so vi nhng cỏi ớt d tha hn Vn th hai, quang ph khi t hn hp phc tp l rt khú nghiờn cu do cú quỏ nhiu thnh phn phc hp ú l vỡ vi tỏc ng ca enzym, mt protein to ra hng lot sn phm peptit Phng phỏp c s dng rng rói phõn mnh protein, hay cỏc sn phm peptit t s tỏc ng ca enzym Phng phỏp u tiờn s phõn mnh ton b protein v c gi l in chuyn...Cỏc protein c chy qua ct nhi bng cỏc ht aganose hoc polyacrylamit nh c ci bin phự hp Cú 2 phng phỏp khỏc nhau trong vic s dng ct tỏch chit v tinh sch protein Phng phỏp sc ký trao i ion: Cỏc phõn t Protein c phõn lp da trờn din tớch ion húa b mt ca chỳng bng vic s dng cỏc vt liu lm ct l cỏc ht mang cỏc nhúm chc tớch in õm hoc dng (pha tnh) Cỏc phõn t Protein tng tỏc yu vi cỏc ht . nhược điểm của HPLC …………………………………………9 5. Phân tích protein bằng HPLC ……………………………………….10 6. Phân tích AMINO ACID bằng phương pháp HPLC ………………12 7. Ứng dụng của phương pháp HPLC trong công nghệ. phù hợp. Có 2 phương pháp khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein. Phương pháp sắc ký trao đổi ion: Các phân tử Protein được phân lập dựa trên diện tích ion hóa bề. phụ pha thờng ( NP -HPLC ), 3. Sắc ký hấp phụ pha ngợc hay pha đảo ( RP- HPLC ), 4. Sắc ký trao đổi ion ( IE X -HPLC ) và cặp ion ( IP -HPLC ), 5. Sắc ký rây phân tử ( FG -HPLC ). II. Phng phỏp