Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Bước đầu nghiên cứu bệnh nấm trên cá tầm (Acipenser sp.) nuôi tại Thừa Thiên - Huế được thực hiện nhằm xác định loài vi nấm nhiễm trên cá tầm nuôi tại Thừa Thiên - Huế và xác định nồng độ diệt nấm của formalin và NaCl để ứng dụng trong phòng trị bệnh nấm.
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU BỆNH NẤM TRÊN CÁ TẦM (Acipenser sp.) NUÔI TẠI THỪA THIÊN - HUẾ Nguyễn Ngọc Phước1*, Nguyễn Thị Huế Linh1, Nguyễn Thị Thu Giang2, Nguyễn Thị Xuân Hồng1 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm xác định loài vi nấm nhiễm cá tầm nuôi Thừa Thiên - Huế xác định nồng độ diệt nấm formalin NaCl để ứng dụng phòng trị bệnh nấm Từ mẫu cá tầm bị lở loét 10 mẫu cá khơng có dấu hiệu điển hình phân lập chủng vi nấm nuôi cấy môi trường PDA nhiệt độ 28oC ngày Các chủng nấm định danh dựa đặc điểm hình thái mơi trường PDA, q trình sinh sản vơ tính nấm phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự đoạn gen its) Kết định danh cho thấy chủng vi nấm phân lập cá tầm nấm thủy mi Achlya bisexualis Formalin NaCl có khả kháng nấm điều kiện in vitro Formalin với liều lượng 75-150 ppm NaCl với nồng độ 2-2,5% có khả ức chế phát triển chủng nấm nghiên cứu ngâm sau Từ khóa: Cá tầm, Acipenser sp., Achlya, Thừa Thiên - Huế MỞ ĐẦU3 Cá tầm (Acipenser sp.) lồi cá có dinh dưỡng cao có giá trị kinh tế, đặc biệt trứng cá tầm loại thực phẩm ưa chuộng thị trường quốc tế Cá tầm du nhập vào Việt Nam từ năm 2005 khu vực miền núi, nơi có khí hậu ơn đới Sa Pa, Đà Lạt, Yên Bái, Tuyên Quang, Hoà Bình,… trở thành đối tượng ni nước có giá trị kinh tế cao cho người dân tỉnh Nhằm đa dạng hoá đối tượng cá nước phát triển kinh tế cho vùng miền núi, năm 2019 cá tầm nuôi thử nghiệm huyện A Lưới, huyện miền núi nằm khu vực địa hình phía Tây dãy Trường Sơn Bắc, có độ cao trung bình 600800 m so với mặt nước biển thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế A Lưới nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, chịu ảnh hưởng khí hậu chuyển tiếp miền Bắc miền Nam Nhiệt độ trung bình năm khoảng 22°C- 25°C, khoảng nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi cá tầm Thực tế cho thấy, sau 18 tháng ni, cá tầm giống với kích cỡ 80-100 g/con đạt tới 3-4 kg, cá biệt có đạt tới kg (Trung tâm Khuyến nông tỉnh Thừa Thiên - Huế, 2020) Kết bước đầu cho thấy, điều kiện khí hậu huyện A Lưới hồn tồn phù hợp cho việc nuôi cá tầm mở triển vọng cho việc phát triển kinh tế nông Khoa Thuỷ sản, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Email: nguyenngocphuoc@huaf.edu.vn Trung tâm Khuyến nông tỉnh Thừa Thiên - Huế * 98 nghiệp vùng núi A Lưới nói riêng xã, huyện miền núi thuộc địa bàn tỉnh Thừa Thiên - Huế Tuy nhiên, cá tầm đối tượng nuôi tỉnh Thừa Thiên - Huế nên chưa có nghiên cứu dịch bệnh xảy cá tầm Trong năm 2019, có số cá tầm chết với dấu hiệu bệnh lý nấm gây lở loét phần đuôi xuất búi sợi màu trắng Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập định danh nấm gây bệnh cá tầm giống nuôi Thừa Thiên - Huế, khảo sát tác động số hoá chất đến chủng nấm phân lập điều kiện in vitro nhằm cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu sâu tác nhân gây bệnh làm tiền đề đưa phương pháp phòng trị bệnh nấm hiệu nhằm phá triển nghề nuôi cá tầm Thừa Thiên Huế PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thu mẫu Mẫu cá bệnh thu trực tiếp ao nuôi cá tầm huyện A Lưới 15 cá có dấu hiệu bệnh lý xuất huyết lở loét vùng bụng, da cá tối sẫm, bơi lội chậm, đầu Cá thu đóng túi nilon 15 L có sục khí vận chuyển Phịng thí nghiệm Bệnh học thuỷ sản, Khoa Thuỷ sản, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế để phân tích mẫu Những mẫu cá bệnh quan sát dấu hiệu bệnh lý bên dấu hiệu bệnh tích bên thể trước ni cy v phõn lp nm Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 7/2021 KHOA HC CÔNG NGHỆ 2.2 Phương pháp phân lập xác định đặc điểm hình thái nấm Phân lập nấm từ cá tiến hành sau: dùng dao mổ tiệt trùng cồn 90oC cắt phần bị xuất huyết lở loét thể cá, rửa qua nước cất lần sau đặt mơi trường potato dextrose agar (PDA) có bổ sung kháng sinh ampicilin streptomycin với liều lượng 500 µg/l loại để hạn chế phát triển vi khuẩn [2] Dùng parafin bao kín lại ủ nhiệt độ 20oC 48 Sau đầu sợi nấm phân lập kính hiển vi đặt vào đĩa chứa môi trường PDA Vi nấm nuôi cấy nhiệt độ 20oC 72 quan sát kính hiển vi với độ phóng đại 100x 200x khuẩn ty chồi, độ phóng đại 400x túi túi bào tử 1000 x với động bào tử [2] 2.3 Phương pháp định danh nấm DNA chủng nấm phân lập chiết xuất từ sợi khuẩn ty Khuẩn ty từ đĩa thạch thu kẹp, sau sử dụng kit DNeasy (Quiagen, Đức) để chiết xuất DNA từ sợi khuẩn ty theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho vi nấm bậc thấp ITS1-O [1] LR -0 [3] để khuếch đại gen its DNA Sản phẩm sau khuếch đại gửi giải trình tự Cơng ty Mecrogen Inc., Seoul, Hàn Quốc Kết giải trình tự so sánh với chủng Aclya GenBank Sử dụng mô hình TamuraiNei thực 1000 boostrap phần mềm MEGA 6.0 để xây dựng phả hệ 2.4 Phương pháp xác định ảnh hưởng NaCl formaline (38%) lên phát triển nấm điều kiện in vitro Phương pháp xác định ảnh hưởng NaCl formaline (38%) lên phát triển nấm điều kiện in vitro thực theo phương pháp Oono Hatai (2007) [8], mô tả Nguyễn Ngọc Phước cộng (2008) [6] Phạm Minh Đức Đặng Ngọc Tuấn (2012) [11] cụ thể sau: 2.4.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế Thí nghiệm bố trí 24 giếng nhựa chứa 20 ml dung dịch môi trường giàu dinh dưỡng Glucose Yeast Extract (GY) có bổ sung nồng độ formalin 1200, 600, 300, 150, 75 30 ppm 0,5; 1; 1,5; 2,5% NaCl Mỗi nồng độ lặp lại lần Cắt khối thạch có nấm phát triển với đường kính 5,5 mm đưa vào giếng nuôi cấy nhiệt độ 20oC 24 Sau lấy khối thạch ra, rửa với nước cất lần đặt lên môi trường GY agar nuôi cấy nhiệt độ 20oC 72 quan sát phát triển khuẩn lạc nấm Các khối nấm nuôi cấy giếng chứa môi trường GY không bổ sung formalin NaCl sử dụng làm nghiệm thức đối chứng 2.4.2 Phương pháp xác định nồng độ tiêu diệt Từ kết thí nghiệm trên, nồng độ thấp ức chế phát triển nấm dùng cho thí nghiệm xác định nồng độ tiêu diệt Cắt khối thạch có nấm phát triển với đường kính 5,5 mm ngâm vào giếng chứa môi trường GY hoá chất 10, 20, 30 phút và 24 Sau lấy khối thạch ra, rửa với nước cất lần đặt lên môi trường GY agar nuôi cấy nhiệt độ 20oC 72 quan sát phát triển khuẩn lạc nấm Thí nghiệm lặp lại lần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập định danh vi nấm Từ 15 mẫu cá tầm bị bệnh thu hộ nuôi cá lồng Thừa Thiên - Huế phân lập chủng vi nấm môi trường nuôi cấy đặc trưng PDA ký hiệu TTH001 đến TTH005 Có 12/15 mẫu cá có dấu hiệu bơi lội chậm, bỏ ăn, màu sắc thể tối sẫm (Hình 1A), 5/15 mẫu cá xuất vết loét màu đỏ vùng bụng vây ngực quan sát kính lúp có thấy sợi nấm màu trắng (Hình 1B), dấu hiệu đặc trưng cảm nhiễm vi nấm cá nước [6, 8, 9, 10, 11] chủng vi nấm phân lập từ mẫu cá A B Hình Cá tầm màu sắc thể tối sẫm (A) xuất đốm đỏ kèm theo sợi nấm màu trắng (vòng tròn) phần bụng gốc vây mang (B) Các chủng vi nấm phát triển môi trường PDA có đặc điểm hình thái tốc độ phát triển khuẩn lạc q trình sinh sản vơ tính giống Sau ngày nuôi cấy nhiệt độ 25oC, chủng vi nấm tạo khuẩn lạc màu trắng, xốp nh bỳi bụng Nông nghiệp phát triển nông thôn - KỲ - TH¸NG 7/2021 99 B KHOA HỌC CƠNG NGHỆ gịn có đường kính 80 mm (Hình 2A) Đây lồi nấm bậc thấp có sợi khuẩn ty dày, phân nhánh, phát triển thành hệ sợi chằng chịt (Hình 2B) Hình Khuẩn lạc màu trắng nuôi cấy môi trường PDA (A) nhiẹt độ 25oC ngày hình dạng khuẩn ty (B) Theo dõi q trình sinh sản vơ tính cho thấy: vi nấm hình thành ống phóng bào tử đầu khuẩn ty (Hình 3C) Các động bào tử có dạng hình cầu tồn thành đám, hình trụ hình thức bào tử nảy mầm (Hình 3A) Bảo tử nảy mầm có cuống dài, cong, từ cuống phát triển thành hệ khuẩn ty (Hình 3D) Hình dạng khuẩn ty, ống phịng bào tử, động bào tử chủng phù hợp với mô tả chủng Achlya nấm ký sinh động vật thuỷ sản nước [2, 8, 9, 10] Đặc biệt, khơng thấy có xuất nỗn bào tử chủng vi nấm phân lập mầm bào tử có dạng hình cầu hình lê nỗn phịng đặc điểm phân biệt lồi Achlya bisexualis [1, 2] Hình (A) Bào tử hình cầu (mũi tên) nảy mầm có dạng hình lê (vịng trịn); (B) Động bào tử phóng thích khỏi túi tập trung đầu khuẩn ty (mũi tên); (C) Ống phóng bào tử hình thành đầu khuẩn ty (mũi tên); (D) Động bào tử nảy mầm hình thành sợi nấm (mũi tên) 3.2 Kết định danh chủng vi nấm phân lập Kết giải trình tự acid nucleic gen its Choi cộng (2019) [2] sử dụng để định danh nấm Achlya Hàn Quốc, nghiên cứu kết giải trình tự acid nucleic gen its chủng vi nấm phân lập cá tầm cho thấy chủng vi nấm TTH001, TTH002, TTH003, TTH004, TTH005 thuộc nhóm gồm chủng vi nấm chi Achyla 100 Kết giải trình tự gen its so sánh Genbank, xây dựng phả hệ thể hình Theo Choi cộng (2019), để định danh xác đến lồi cần sử dụng đoạn mồi cox1 cox2 ty thể [1], nghiên cứu sử dụng đoạn gen its kết xây dựng phả hệ dựa vào mô hình Tamurai-Nei Kết cho thấy chủng vi nấm TTH001, TTH002, TTH003, TTH004, TTH005 phân lập cá tầm ni Thừa Thiên Huế giống đến 100% lồi Achlya bisexualis, với hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty, bào t v noón phũng ging Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 7/2021 KHOA HC CƠNG NGHỆ với mơ tả nấm A bisexually [1, 2, 9, 10] Kết cho thấy chủng vi nấm A bisexualis Achlya thuộc nhóm nấm nỗn Oomycetes, nhóm nấm gây bệnh phổ biến trứng cá nước [14] Ở Việt Nam, Achlya phân lập cá lóc trứng cá tra [4, 11] Có tương đồng đặc điểm hình thái, trình sinh sản vơ tính dấu hiệu bệnh lý chủng thuộc loài Achlya bisexualis phân lập cá lóc giống từ nghiên cứu Nguyễn Văn Đức Trần Ngọc Tuấn (2012) [11] với chủng vi nấm nghiên cứu này, nhiên cần nghiên cứu sâu định danh xác tên lồi chủng vi nấm phân lập Hình Cây phả hệ chủng nấm phân lập cá tầm với mơ hình Tamurai-Nei thực phần mềm MEGA 6.0 3.3 Ảnh hưởng formalin NaCl lên phát sau ngâm 24 nồng độ 2% NaCl trở lên triển chủng vi nấm phân lập điều (Bảng 1) Tất chủng nấm phát triển nghiệm thức đối chứng nghiệm thức mà khối kiện in vitro nấm ngâm nước muối sinh lý Từ kết bảng 1, 3.3.1 Nồng độ ức chế tối thiểu formalin nồng độ formalin 75, 150, 300 ppm nồng độ NaCl lên phát triển chủng vi nấm NaCl: 2; 2,5% 3% sử dụng cho nghiên cứu xác Nồng độ ức chế tối thiểu formalin lên định nồng độ tiêu diệt tối thiểu phát triển chủng nấm 300 ppm (Bảng 1) Các chủng nấm khơng có khả phát triển trở lại Bảng Nồng độ ức chế tối thiểu formalin NaCl lên chủng vi nấm phân lập Sự phát triển chủng nấm Loại hoá chất Nồng độ TTH001 TTH002 TTH003 TTH004 TTH005 1200 ppm 600 ppm 300 ppm Formalin 150 ppm 75 ppm 30 ppm + + + + + 3% 2,5% 2% NaCl 1,5% + + + + + 1% + + + + + 0,5% + + + + + Đối chứng (nước muối sinh + + + + + lý 0,86% NaCl) Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 7/2021 101 KHOA HC CÔNG NGHỆ 3.3.2 Nồng độ tiêu diệt formalin NaCl lên phát triển chủng vi nấm điều kiện in vitro Kết xác định nồng độ tiêu diệt nấm formalin NaCl trình bày bảng bảng Chủng nấm TTH001 TTH002 TTH003 TTH004 TTH005 Chủng nấm TTH001 TTH002 TTH003 TTH004 TTH005 Bảng Nồng độ tiêu diệt tối thiểu formalin lên chủng vi nấm Sự phát triển nấm sau ngâm nồng độ formalin Nồng độ (ppm) 10 phút 20 phút 30 phút giờ 300 150 75 + + + + + 300 150 75 + + + + + 300 150 75 + + + + + 300 150 75 + + + + + 300 150 75 + + + + + Bảng Nồng độ tiêu diệt tối thiểu NaCl lên chủng vi nấm Sự phát triển chủng nấm sau thời gian ngâm Nồng độ (%) 10 phút 20 phút 30 phút giờ + + + 2,5 + + + + + + + + + + + 2,5 + + + + + + + + + + + 2,5 + + + + + + + + + + + 2,5 + + + + + + + + + + + 2,5 + + + + + + + + Tất chủng nấm bị tiêu diệt ngâm dung dịch NaCl nồng độ 2,5% trở lên sau Ở nồng độ thấp (2%), NaCl khơng có khả tiêu diệt nấm sau ngâm 102 formalin nồng độ 150 ppm có khả tiêu diệt phát triển chủng nấm sau 20 phút Ở nồng độ 300 ppm trở lên, formalin có khả tiêu diệt hồn tồn phát triển chủng nấm sau 10 phút ngâm Từ kết bảng bảng 3, nồng độ ức chế tiêu diệt formalin NaCl trình bày bảng N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 7/2021 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Bảng Nồng độ ức chế nồng độ tiêu diệt tối thiểu formalin NaCl chủng nấm phân lập Loại hoá Nồng độ ức chế Nồng độ tiêu diệt chất tối thiểu tối thiểu Formalin 75 ppm 150 ppm NaCl 2% 2,5% Formalin NaCl hai loại hoá chất thường sử dụng việc điều trị bệnh nấm động vật thuỷ sản, tác động trực tiếp đến áp suất thẩm thấu sợi khuẩn ty [12, 13, 14] Theo nghiên cứu Rasowo (2007), nồng độ 250, 500 1000 ppm formalin NaCl có khả tiêu diệt vi nấm tăng khả nở trứng cá trê châu Phi Clarias gariepinus [12] Khi thử nghiệm khả ức chế nấm trứng cá hồi vân, Schreier cộng (1996) cho formalin NaCl có khả ức chế phát triển vi nấm, nhiên dùng formalin nồng độ 100150 ppm cho khả kháng nấm tốt so với NaCl nồng độ 3% [13] Trong nghiên cứu này, formalin nồng độ 75-150 ppm NaCl nồng độ 2,5-3% có khả kháng nấm A bisexualis phân lập cá tầm Thừa Thiên - Huế Kết cho thấy formalin NaCl có khả sử dụng phòng trị bệnh nấm cá tầm nuôi Thừa Thiên - Huế, nhiên kết bước đầu phịng thí nghiệm, cần nghiên cứu sâu thử nghiệm điều trị cá tầm để xác định yếu tố ảnh hưởng formalin NaCl lên phát triển cá KẾT LUẬN Kết nghiên cứu phân lập chủng nấm Achlya bisexualis mẫu cá tầm nuôi Thừa Thiên - Huế Formalin với nồng độ 75-150 ppm NaCl với nồng độ 2,5-3% cho thấy có khả ức chế tiêu diệt chủng vi nấm điều kiện in vitro Cần thử nghiệm điều trị điều kiện in vivo để đưa phác đồ điều trị xác cho phòng trị bệnh vi nấm gây cá tầm TÀI LIỆU THAM KHẢO Barksdale, A W (1962) Concerning the species, Achlya bisexualis Mycologia 54, 704–712 Choi, Y J., Lee, S H., Thuong T T N, Nam B., Hyang Burm Lee H B (2019) Characterization of A chlyaamericana and A isexualis (Saprolegniales, Oomycota) isolated from freshwater environments in Korea Mycobiology, 47 (2), 135142 Lartseva, L V and Dudka, I A (1990) Dependence of the development of Saprolegniaceae on the reproductive quality of the eggs of the sturgeon and white salmon Mikol Fitopatologia, 24,112–116 Loan, L T T., Phuong, V H., Thanh T P, Huyen, N T (2006) Experimental screening of some harmaceutical chemical compounds affecting Achlya sp isolated from Catfish eggs Proceedings of International Agriculture Workshop on Biotechnology in Moncalvo, J M., Wang, H H., Hseu, R S (1995) Phylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25s ribosomal DNA sequences Mycologia, 87, 223–238 Nguyễn Ngọc Phước, Phạm thị Phương Lan, Nguyễn Quang Linh, Kishio Hatai (2007) Nghiên cứu khả kháng nấm dịch chiết trầu (Piper betel L.) Tạp chí Thuỷ sản, 4, 31-34 O’Bier, A H (1960) A study of the aquatic Phycomycetes associated with diseased fish and fish eggs Blacksburg (VA): Virginia Polytechnic Institute Oono, H and Hatai, K (2007) Antifungal activities of bronopol and 2-methyl-4-isothiazolin-3one (MT) against Saprolegnia Biocontrol Science, 12, 145-148 Panchai, K., Hanjavanit, C., Kitacharoen, N (2007) Characteristics of Achlya bisexualis isolated from eggs of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) KKU Research Journal, 12, 195–202 10 Panchai, K., Hanjavanit, C., Rujinanont N, Wada., S, Kurata, O., Hatai, K (2014) Freshwater oomycete isolated from net cage cultures of Oreochromis niloticus with water mold infection in the Nam Phong river, Khon Kaen province Thailand AACL Bioflux,7, 529–542 11 Phạm Minh Đức, Trần Ngọc Tuấn (2012) Định danh nấm thuỷ mi (Achlya bisexualis) khảo sát hố chất kháng vi nấm Tạp chí Khoa học - Đại học Cần Thơ, 22,165-172 12 Rasowo J., Okoth O E., Ngugi C C (2007) Effects of formaldehyde, sodium chloride, potassium permanganate and hydrogen peroxide on hatch rate of African catfish Clarias gariepinus eggs Aquaculture 269: 271–277 Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 7/2021 103 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ 13 Schreier T M, Rach J J., George E H (1996) Efficacy of formalin, hydrogen peroxide, and sodium chloride on fungal-infected rainbow trout eggs Aquaculture,140 (4), 323-331 14 Yanong, R P E (2003) Fungal diseases of fish Veterinary Clinics: Exotic Animal Practic, 6, 377400 PRELIMINARY STUDY ON THE FUNGAL INFECTION IN FARMED STURGEON (Acipenser sp.) IN THUA THIEN - HUE PROVINCE Nguyen Ngoc Phuoc, Nguyen Thi Hue Linh, Nguyen Thi Thu Giang, Nguyen Thi Xuan Hong Summary This study was aimed to determine the fungus infected in farm sturgeon (Acipenser sp.) and to evaluate the fungicidal concentration of formalin and NaCl on the isolated fungi in the in vitro condition Five fungal isolates were recovered in PDA at 28oC for days from sampling fish with ucerative syndrome and fungal infection on the body and 10 fish without clinical signs were examined The identification and characterization of these five fungal isolates was based on the morphological characteristics, asexual preproductive process of fungi and using of expressed sequence tag of its gene The results of this study showed that all of five fungal isolates were Achlya bisexualis Formalin and NaCl inhibited the growth of these fungal isolates in vitro condition Formalin (75-150 ppm) and NaCl (2.5-3%) against to these fungal isolates after exposing to the chemical for hour Keywords: Sturgeon, Acipenser sp., Achlya, Thua Thien - Hue Người phản biện: TS Bùi Quang Tề Ngày nhận bài: 16/4/2021 Ngày thông qua phản biện: 17/5/2021 Ngày duyệt đăng: 24/5/2021 104 N«ng nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 7/2021 ... bisexualis phân lập cá tầm Thừa Thiên - Huế Kết cho thấy formalin NaCl có khả sử dụng phòng trị bệnh nấm cá tầm nuôi Thừa Thiên - Huế, nhiên kết bước đầu phịng thí nghiệm, cần nghiên cứu sâu thử nghiệm... trị cá tầm để xác định yếu tố ảnh hưởng formalin NaCl lên phát triển cá KẾT LUẬN Kết nghiên cứu phân lập chủng nấm Achlya bisexualis mẫu cá tầm nuôi Thừa Thiên - Huế Formalin với nồng độ 7 5-1 50... nuôi cấy nhiệt độ 20oC 72 quan sát phát triển khuẩn lạc nấm Thí nghiệm lặp lại lần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập định danh vi nấm Từ 15 mẫu cá tầm bị bệnh thu hộ nuôi cá lồng Thừa Thiên -