BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC THÁI LAN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Lê Thanh Hòa ThS. NCS. Đoàn Thị Thanh Hương 9191 Hà Nội, 2011 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC THÁI LAN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Lê Thanh Hòa ThS. NCS. Đoàn Thị Thanh Hương Hà Nội, 2011  i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn:  Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí thực hiện.  Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Kế hoạch tài chính - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để đề tài thực hiện đúng tiến độ̣.  Phòng Miễn d ịch học - Viện Công nghệ sinh học  Phòng virus học - Viện Công nghệ Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan (BIOTEC).  Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học.  Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện Công nghệ sinh học.  Trại sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế - Viện Công nghệ sinh học.  Các đơn vị trong Viện Công nghệ sinh học đã hợp tác, giúp đỡ để hoàn thành đề tài. Chủ nhiệm đề tài PGS. TS. Lê Thanh Hòa TS. Đoàn Thị Thanh Hương   ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt bp base pair Cặp bazơ Ck Chicken Gà cDNA Complementary DNA DNA bổ sung Da Dalton Đơn vị khối lượng dalton Dk Duck Vịt ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate Deoxy Nucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate dideoxy Nucleotide Triphosphate Gs Goose Ngỗng HA Hemagglutinin Kháng nguyên HA HI Hemagglutination Inhibition Phản ứng ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao kb Kilo base Kilo base LB Luria-Bertani medium Môi trường LB LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Phân tích di truyền tiến hoá phân tử NA Neuraminidase Kháng nguyên NA NEP Nuclear Export Protein Nuclear Export Protein NP Nucleoprotein Nucleoprotei NS Non-structural protein Protein không cấu trúc PA Polymerase acidic protein Protein PA PB1 Polymerase basic protein 1 Protein PB1 PB2 Polymerase basic protein 2 Protein PB2 RT- PCR Revertranscription Polymerase Chain Reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi PCR ngược ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic RNP Ribonucleoprotein Ribonucleoprotein SPF Specific Pathogen Free Sạch mầm bệnh (-) ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Acid ARN sợi đơn âm   iv DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI STT Họ và tên Trách nhiệm trong đề tài Học hàm, học vị Số tháng làm việc 1 Lê Thanh Hòa Chủ nhiệm giai đoạn một PGS.TS. NCVCC 36 tháng 2 Đoàn Thị Thanh Hương Chủ nhiệm giai đoạn hai TS 36 tháng 3 Hoàng Thị Minh Châu Thư ký ThS 36 tháng 4 Nguyễn Thị Bích Nga Tham gia ThS. NCS 24 tháng 5 Trương Nam Hải Tham gia PGS.TS. NCVCC 9 tháng 6 Đỗ Thị Huyền Tham gia TS 9 tháng 7 Nguyễn Bá Thành Tham gia TS 12 tháng 8 Lê Thị Kim Xuyến Tham gia TS 12 tháng 9 Trần Ngọc Linh Tham gia BSTY 12 tháng 10 Vũ Thị Tiến Tham gia ThS 24 tháng Và một số người khác   v MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn……………………………………………………………………… i Danh mục các từ viết tắt……………………………………………………… ii Danh sách cán bộ tham gia thực hiện đề tài………………………………… iv Mục lục……………………………………………………………………… v Danh mục bảng………………………………………………………………… viii Danh mục hình……………………………………………………………… ix MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………… 4 1.1. Bệnh cúm và virus cúm A/H5N1………………………………………… 4 1.2. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam………………………… 7 1.2.1.Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam…………………………… 7 1.2.2. Tình hình nghiên cứu virus H5N1 và biện pháp phòng chống………… 8 1.3. Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao 9 1.4. Sự hình thành genotype c ủa virus cúm A/H5N1 12 1.5. Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) 13 1.6. Sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 14 1.7. Vaccine và biện pháp phòng chống dịch cúm A/H5N1 16 1.8. Tổng quan về virus Newcastle…………………………………………… 17 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 19 2.1. Nguyên liệu……………………………………………………………… 19 2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 20 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 20 2.2.2. Hóa chất………………………………………………………………… 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… 21 2 3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1…………. 21 2.3.1.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng s ố 21 2.3.1.2. Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR………………………… 23   vi 2.3.1.3. Phương pháp chuyển đổi cDNA………………………………………… 23 2.3.1.4. Phương pháp thôi gen và tinh sạh sản phẩm thôi gen………………… 24 2.3.1.5. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen………………………… 25 2.3.1.6. Phương pháp giải trình trình tự …………………………………………… 26 2.3.1.7. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………………… 27 2.3.2. Phương pháp tạo kháng nguyên HA 1 tái tổ hợp sử dụng cho chẩn đoán . 27 2.3.2.1. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ………………………………… 28 2.3.2.2. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp………………………………. 28 2.3.2.3. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 29 2.3.2.4. Phương pháp tinh chế HA 1…………………………………………………………………………… 29 2.3.2.5. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên ……………………. 30 2.3.2.6. Phương pháp kiểm tra độ sạch của protein HA 1 ………………………… 31 2.3.3. Phương pháp tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 ……… 31 2.3.3.1. Phương pháp thu nhận hệ gen virus Newcastle chủng LaSoTa……… 32 2.3.3.2. Phương pháp thiết kế plasmid vector ……………………………………. 32 2.3.3.3. Phương pháp gắn gen H5 (cúm A/H5N1) vào plasmid vector 33 2.3.3.4. Phương pháp nuôi cấy giống vaccine LaSoTa tái tổ hợp 33 2.3.3.5. Phương pháp kiểm tra đáp ứng miễn dịch với 34 2.3.3.6. Phương pháp thực hiện phản ứng HA và HI 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………… 37 3.1. Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1…………………………… 37 3.1.1. Kết quả thu nhận gen H5 và N1 37 3.1.2. Kết quả lưu giữ gen H5 vào plasmid…………………………………… 39 3.1.3. Kết quả lưu giữ gen N1 vào plasmid…………………………………… 41 3.1.4. Kết quả giải mã hệ gen đại diện virus cúm A/H5N1 ……………………. 42 3.1.5. Kết quả phân tích gen H5 và so sánh với các chủng của thế giới……… 42 3.1.6. Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc …………………… 51 3.1.7. Kết quả xác định các phân nhóm kháng nguyên xuất hiện mới tại VN…. 55 3.2. Thiết kế vector biểu hiệ n và thu nhận protein kháng nguyên 56   vii 3.2.1. Kết quả thu nhận gen HA1 và dòng hóa vào vector pET22trx…………. 56 3.2.2. Kết quả biểu hiện gen HA 1 trong tế bào E. Coli………………………… 59 3.2.3. Kết quả tinh chế TrxHa1 và nghiên cứu khả năng nhận biết TrxHA1 …. 61 3.2.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên……………………… 62 3.2.5. Kết quả tạo kit ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) …… 62 3.2.4.1. Kết quả tạo kit ELISA………………………………………………… 62 3.2.5.2. Thử nghiệm kit ELISA 65 3.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất vaccine LaSoTa TTH gắn gen H5… 68 3.3.1. Kết quả thiết kế plasmid vector chứa hệ gen virus LaSoTa (pLST)……. 68 3.3.1. 1. Nguyên liệu và phương pháp tạo plasmid vector LaSoTa…………… 68 3.3.1.2. Kế t quả thu nhận phân đoạn gen F1 và chuyển nạp vào vector………. 69 3.3.1.3. Kết quả thu nhận đoạn gen F2 và chuyển nạp vào vector tách dòng…. 71 3.3.1.4. Kết quả thu nhận plasmid tái tổ hợp chứa toàn bộ hệ gen chủng virus vaccine LaSoTa……………………………………………………………………… 71 3.3.2. Kết quả lắp ghép virus LaSoTa TTH mang gen H5 virus cúm A/H5N1 73 3.3.3. Kết quả kiểm tra giống virus tái tổ hợp…………………………………. 73 3.3.3.1. Bố trí thí nghiệm 73 3.3.3.2. Kết quả chuẩn độ virus tái tổ hợp của giống virus vaccine …………… 74 3.3.3.3. Kết quả kiểm tra an toàn, vô trùng của giống virus vaccine …………… 76 3.3.3.4. Kiểm tra tính ổn định của giống vaccine tái tổ hợp ……………………… 77 3.3.3.5. Kết quả kiểm tra virus vaccine LaSoTa tái tổ hợp chứa gen H5 ……… 77 3.3.4. Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của giống virus vaccine tái tổ hợp 78 3.3.4.1. Bố trí thí nghiệm …………………………………………………………… 78 3.3.4.2. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 … 79 3.3.4.3. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng Newcastle……………… 80 K ẾT QUẢ HỢP TÁC QUỐC TẾ VIỆT NAM-THÁI LAN………………… 81 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………… 85 PHỤ LỤC……………………………………………………………………… 90   viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Danh sách 14 chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu đã được phân lập và giải trình tự…………………………………………… 20 Bảng 2.2: Danh sách các mồi sử dụng trong thu nhận, lưu giữ và giải mã gen H5 và N1…………………………………………………………………… 23 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA trong nghiên cứu……… 24 Bảng 3.1: Danh sách các biến chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh……………………………. 43 Bảng 3.2: Các vị trí nucleotide sai khác trong gen H5 giữa 14 chủng c ủa Việt Nam và 18 chủng của thế giới………………………………………… 45 Bảng 3.3: Xác định liều gây nhiễm 50% trên phôi trứng gà (EID 50 ) của giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 của virus cúm A/H5N1………. 75 Bảng 3.4: Quy trình thực hiện phản ứng HA……………………………… 77 [...]... 1708-1735 N1P24N ACCGGCAATTCATCTCTTTGTCC 23 276-298 N1M13N2 ATTCAACCCAGAAGCAAGGCC 21 1275-1296 N1F1 AGCAAAAGCAGGAGATTAAAATG 23 1-23 N1R1 CTTGGTCCATCAGTCATTACAG 22 739-760 N1F2 GGAGGAACAACATACTGAGAACTC 24 690-713 N1R2 AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 21 1460-1480 N1R3 CTACTTGTCAATGGTGAATGG CCGGAATTCAAAATGAATCCAAATCAGAAG ATAATAACCATT (Đầu 5’ gen N1 có EcoRI) ATAAGAATGCGGCCGCTCACTACTTGTCAAT GGTGAATGGCAA (Cuối 3’ gen... CCATTGGAGTTTGACACTTGG 21 903-923 H3F1 CATCAACACTGAACCAGAGATTGG 24 681-704 H3R1 ACGATCCATTGGAGCACATCC 21 1682-1712 H3F2 GCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGC 25 716-740 H3R2 GCACATCCATAAAGATAGACCAGC 24 CCGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAAAATAG 9+27 TGCTT (Đầu 5’ gen H5 có BamHI) ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATGCAAAT 16+27 TCTGCATTGTAACGA (Cuối 3’ gen N1 có NotI) GEN NA (N1) (NEURAMINIDASE) H5BAMF H5NOTR H5F1-H5R1: 0,77kb H5F2-H5R2:... phê duyệt c a Bộ Khoa học và Công nghệ, chúng tôi hợp tác với Viện Công nghệ Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan (BIOTEC) thực hiện nhiệm vụ: Nghiên cứu virus cúm A/ H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau: 2   Mục tiêu nghiên cứu: 1 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus cúm A/ H5N1 qua giải mã... nguyên H5 và N1 c a các chủng virus phân lập tại Việt Nam 2 Nghiên cứu tạo chế phẩm protein HA1 tái tổ hợp cho mục đích chẩn đoán 3 Nghiên cứu tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 c a cúm A/ H5N1 Nội dung nghiên cứu: 1 Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/ H5N1 - Thu thập mẫu bệnh phẩm cúm A/ H5N1 tại các vùng khác nhau c a Việt Nam từ năm 2004 - 2011 - Giải mã gen HA (H5) và gen NA (N1) c a các... 2004) Ví dụ: A/ VietNam/1194/04 (H5N1) (Hình 1.4B) 6   1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÚM H5N1 Ở VIỆT NAM 1.2.1 Tình hình bệnh cúm A/ H5N1 tại Việt Nam Virus cúm A/ H5N1 chính thức được công bố xuất hiện ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003, đã nhanh chóng gây nên đại dịch cúm gia cầm lớn trong cả nước Đây là lần đầu tiên dịch cúm A xảy ra, ch a có một cơ sở nghiên cứu nào ở nước ta tiến hành nghiên cứu một cách... lan sang người Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5N1 nói riêng có nhiều loại vaccine đang được sử dụng và nghiên cứu, trong đó có vaccine bất hoạt (inactivated vaccine) và vaccine nhược độc (attenuated vaccine) được tạo ra bằng các phương pháp truyền thống và hiện đại, sử dụng cho uống, tiêm hoặc qua đường hô hấp (Tamura et al., 2005) Nhóm vaccine truyền thống phòng chống virus cúm. .. truyền c a gen HA đã chỉ ra là, đến thời điểm hiện nay, tại Việt Nam, clade 1.1 đã thay thế cho clade 1 ở ph a Nam và clade 2.3.2 và phân nhánh 2.3.2.1 đã thay thế clade 2.3.4 ở ph a Bắc, lưu hành trước đây (WHO, 2011; WHOFAO-OIE, 2011) Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại Việt Nam, virus cúm gia cầm A/ H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm và cộng đồng và là mối nguy cơ lại càng gia tăng... 2011), còn ở các tỉnh ph a Nam thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long vẫn lưu hành chủ yếu clade 1 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ c a virus cúm gia cầm A/ H5N1 thuộc clade 1 tại Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1 Clade 1.1 đã được phát hiện ở gia cầm c a Việt Nam tại ph a Nam; ở gia cầm và người tại Campuchia gây chết 9/9 người từ cuối 2010 đến nay (WHO-FAO-OIE, 2011) Phân tích... thể nhiễm Sử dụng các vaccine phòng cúm là nhằm vô hiệu h a vai trò c a HA(H5) trong quá trình lây nhiễm c a A /H5N1, qua đó phòng chống dịch cúm A/ H5N1 ở gia cầm, và ngăn chặn đại dịch cúm trên người Virus cúm A/ H5N1 luôn có sự biến đổi hệ gen Sự tích lũy các đột biến điểm nội gen (antigenic drift) , hoặc trao đổi các gen (antigenic shift) c a virus A/ H5N1 với các chủng virus cúm A đã thích nghi lây... gen HA - quyết định tính kháng nguyên c a virus) - Tạo protein HA1 tái tổ hợp cho mục đích chẩn đoán 3 Tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 c a cúm A/ H5N1 - Thu nhận toàn bộ hệ gen chủng virus LaSoTa - Thiết kế plasmid vector tái tổ hợp mang toàn bộ hệ gen virus LaSoTa - Gắn gen HA (H5) c a chủng virus cúm A/ H5N1 DkNA-114 phân lập tại Việt Nam thuộc dòng Phúc Kiến vào plasmid vector LaSoTa Chuyển . gia Thái Lan (BIOTEC) thực hiện nhiệm vụ: Nghiên cứu virus cúm A/ H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống . Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và. VƯƠNG QUỐC THÁI LAN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Nghiên cứu virus cúm A/ H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống . CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Nghiên cứu virus cúm A/ H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ