Đang tải... (xem toàn văn)
BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI………………IPHẦN I. MỞ ĐẦU……………………………………………………..11. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI .......................................................................... 21.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới ....................................................... 21.2. Tình hình bệnh ĐTĐ ở Việt Nam ........................................................ 31.3. Thuốc điều trị bệnh ĐTĐ ..................................................................... 41.4. Cấu trúc, sự hình thành và tác dụng của insulin .................................. 51.5. Sản xuất insulin điều trị bệnh ĐTĐ ..................................................... 72. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ........................................................................ 123. LUẬN GIẢI VỀ VIỆC ĐẶT RA MỤC TIÊU VÀ NHỮNG NỘI DUNG CẦN NGHIÊN CỨU ........................................... 143.1. Tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin ................................................... 143.2. Nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh khối và đồng nhất sinh khối E. coli iitái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men .............................................. 183.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI ............................................................................ 193.4. Nghiên cứu công nghệ tinh chếinsulin người tái tổ hợp ...................................................................... 223.5. Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp ............................................. 233.6. Nghiên cứu đặc tính và kiểm soát chất lượng insulin tái tổ hợp .............................................................. 233.7. Bước đầu nghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin điều trị ĐTĐthực nghiệm trên mô hình chuột ......................................................... 24PHẦN II. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆĐÃ THỰC HIỆN…………………………………………...25CHƯƠNG 1. TẠO DÕNG BIỂU HIỆN MINI-PROINSULIN ................ 261.1. Tạo dòng mang gen mã hóa MPI ....................................................... 261.2. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng thể vùi trong tế bào chất ........................................................... 671.2A. Tạo dòng E. coli biểu hiện 6xHis-MPI dạng thể vùi trong tế bào chất ................................................. 701.2B. Tạo dòng E. coli biểu hiện 10xHis-MPI dạng thể vùi trong tế bào chất ................................................. 921.3. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng tan trong tế bào chất .............................................................................. 1151.4. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng tan trong chu chất .................................................................................. 150iiiCHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN, THUSINH KHỐI, ĐỒNG NHẤT SINH KHỐI E. coliTÁI TỔ HỢP QUY MÔ 100 LÍT DỊCH LÊN MEN ....... 1842.1. Nghiên cứu công nghệ lên men và cảm ứngtổng hợp MPI ................................................................................... 1852.2. Khảo sát phương thức thu sinh khối tế bào (Quy mô 1 lít – 100 lít lên men) ...................................................... 2742.3. Khảo sát phương thức phá tế bào tạo dịch đồng nhất hoặc phân đoạn chu chất ................................................. 289CHƯƠNG 3. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TẠO INSULIN CÓ HOẠT TÍNH TỪ MPI ................................ 3073.1. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI dạng thể vùi .......................................................... 3093.1A. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 6xHis-MPI dạng thể vùi ................................... 3163.1B. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 10xHis-MPI dạng thể vùi ................................. 3373.2. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 6xHis-FTNh-MPI dạng tan .......................................... 3623.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ DsbA-6xHis-MPI dạng tan ........................................... 375CHƯƠNG 4. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TINH CHẾMPI TÁI TỔ HỢP ............................................................... 3874.1. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ6xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm ............................................. 387 iv4.2. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ6xHis-MPI quy mô pilot .................................................................. 4074.3. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ10xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm ........................................... 4204.4. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ10xHis-MPI quy mô pilot ................................................................ 426CHƯƠNG 5. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH INSULIN TÁI TỔ HỢP .............................................................................. 4325.1. Giới thiệu chung ............................................................................... 4325.2. Nội dung thực hiện ........................................................................... 4355.3. Vật liệu và phương pháp .................................................................. 4355.4. Kết quả và biện luận ......................................................................... 4365.5. Kết luận ............................................................................................ 441CHƯƠNG 6. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ KIỂM SOÁTCHẤT LƯỢNG INSULIN TÁI TỔ HỢP ............................. 4426.1. Xác định trình tự axít amin của MPI và insulin bằng phương pháp khối phổ MS/MS, TOFMS ........................................................ 4426.2. Xác định cấu hình lập thể của MPI và insulinbằng ELISA và phương pháp phổ CD ...................................... 4546.3. Xác định hàm lượng insulin so với insulin chuẩn bằng HPLC và RP-HPLC .............................................. 4616.4. Xác định hoạt tính riêng của insulin theo Dược điển Hoa Kỳ USP ........................................................... 473 v6.5. Xác định dư lượng của nội độc tốvi khuẩn bằng phương pháp LAL ............................................ 4816.6. Thử nghiệm tính an toàn trên chuột ......................................... 4896.7. Đánh giá chất lượng insulin theo tiêu chuẩn quốc tế .................................................................... 495CHƯƠNG 7. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHẾ PHẨMINSULIN ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNGTHỰC NHGIỆM TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT……………5147.1. Nghiên cứu tạo mô hình thực nghiệm chuột bị đái tháo đường……………………………………………...5147.2. Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính làm giảm đường huyết củainsulin trên mô hình chuột bị ĐTĐ thực nghiệm…………………….5217.3. Đánh giá tồn lưu hoạt tính của chế phẩm insulin theo thời gian……..531PHẦN III. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC, KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................... 539TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 548PHỤ LỤC .................................................................................................... 565PHỤ LỤC 1. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy trình tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin ......................... 566PHỤ LỤC 2. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinhkhối và đồng nhất sinh khối E. coli tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men ................................... 594 viPHỤ LỤC 3. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy trình công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI ..................... 629PHỤ LỤC 4. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy trình tinh chế insulin tái tổ hợp từ MPI .................................. 642PHỤ LỤC 5. Vật liệu và phương pháp sử dụng trongthử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp ................................... 649PHỤ LỤC 6. Vật liệu và phương pháp sử dụng trongnghiên cứu đặc tính và kiểm soát chất lượng insulin tái tổ hợp ................................................... 653PHỤ LỤC 7. Vật liệu và phương pháp sử dụng trongnghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin nguyên liệu điều trị bệnh ĐTĐ ............................................... 655PHỤ LỤC 8. Dược điển Anh ........................................................................ 657DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 2 (Tập tài liệu đính kèm). DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 3 (Tập tài liệu đính kèm).KẾT QUẢ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC (Tập tài liệu đính kèm).viiQUY TRÌNH TỔNG QUÁT SẢN XUẤT INSULIN
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG MÃ SỐ KC.04.09/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài/dự án: Trƣờng ĐH Khoa học Tự Nhiên Chủ nhiệm đề tài/dự án: PGS.TS Phạm Thành Hổ TP Hồ Chí Minh – 2010 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG MÃ SỐ KC.04.09/06-10 Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì đề tài/dự án: PGS.TS Phạm Thành Hổ PGS.TS Trần Linh Thƣớc Ban chủ nhiệm chương trình: Bộ Khoa học Cơng nghệ: GS.TSKH Trần Duy Quý TP Hồ Chí Minh - 2010 MỤC LỤC Trang Mục lục……………………………………………………………………… i Quy trình tổng quát sản xuất insulin…… ……………………………….vii Danh mục hình…………………………………………………………… xii Danh mục bảng………………………………………………………… xxxi Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt……………………………………… .xxxvi Danh mục chủng E coli sử dụng………………………………… xxxix Danh mục vector sử dụng…………………………………………… xlii BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI………………I PHẦN I MỞ ĐẦU…………………………………………………… 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Tình hình bệnh ĐTĐ giới 1.2 Tình hình bệnh ĐTĐ Việt Nam 1.3 Thuốc điều trị bệnh ĐTĐ 1.4 Cấu trúc, hình thành tác dụng insulin 1.5 Sản xuất insulin điều trị bệnh ĐTĐ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 12 LUẬN GIẢI VỀ VIỆC ĐẶT RA MỤC TIÊU VÀ NHỮNG NỘI DUNG CẦN NGHIÊN CỨU 14 3.1 Tạo dòng biểu mini-proinsulin 14 3.2 Nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh khối đồng sinh khối E coli i tái tổ hợp quy mơ 100 lít dịch lên men 18 3.3 Nghiên cứu cơng nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI 19 3.4 Nghiên cứu công nghệ tinh chế insulin người tái tổ hợp 22 3.5 Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 23 3.6 Nghiên cứu đặc tính kiểm sốt chất lượng insulin tái tổ hợp 23 3.7 Bước đầu nghiên cứu hiệu chế phẩm insulin điều trị ĐTĐ thực nghiệm mơ hình chuột 24 PHẦN II NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN………………………………………… 25 CHƯƠNG TẠO DÕNG BIỂU HIỆN MINI-PROINSULIN 26 1.1 Tạo dịng mang gen mã hóa MPI 26 1.2 Tạo dòng E coli biểu MPI dạng thể vùi tế bào chất 67 1.2A Tạo dòng E coli biểu 6xHis-MPI dạng thể vùi tế bào chất 70 1.2B Tạo dòng E coli biểu 10xHis-MPI dạng thể vùi tế bào chất 92 1.3 Tạo dòng E coli biểu MPI dạng tan tế bào chất 115 1.4 Tạo dòng E coli biểu MPI dạng tan chu chất 150 ii CHƯƠNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN, THU SINH KHỐI, ĐỒNG NHẤT SINH KHỐI E coli TÁI TỔ HỢP QUY MÔ 100 LÍT DỊCH LÊN MEN 184 2.1 Nghiên cứu công nghệ lên men cảm ứng tổng hợp MPI 185 2.2 Khảo sát phương thức thu sinh khối tế bào (Quy mơ lít – 100 lít lên men) 274 2.3 Khảo sát phương thức phá tế bào tạo dịch đồng phân đoạn chu chất 289 CHƯƠNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TẠO INSULIN CĨ HOẠT TÍNH TỪ MPI 307 3.1 Nghiên cứu cơng nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI dạng thể vùi 309 3.1A Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 6xHis-MPI dạng thể vùi 316 3.1B Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 10xHis-MPI dạng thể vùi 337 3.2 Nghiên cứu cơng nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 6xHis-FTNh-MPI dạng tan 362 3.3 Nghiên cứu cơng nghệ tạo insulin có hoạt tính từ DsbA-6xHis-MPI dạng tan 375 CHƯƠNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TINH CHẾ MPI TÁI TỔ HỢP 387 4.1 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ 6xHis-MPI quy mơ phịng thí nghiệm 387 iii 4.2 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ 6xHis-MPI quy mô pilot 407 4.3 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ 10xHis-MPI quy mơ phịng thí nghiệm 420 4.4 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ 10xHis-MPI quy mô pilot 426 CHƯƠNG THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH INSULIN TÁI TỔ HỢP 432 5.1 Giới thiệu chung 432 5.2 Nội dung thực 435 5.3 Vật liệu phương pháp 435 5.4 Kết biện luận 436 5.5 Kết luận 441 CHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ KIỂM SỐT CHẤT LƯỢNG INSULIN TÁI TỔ HỢP 442 6.1 Xác định trình tự axít amin MPI insulin phương pháp khối phổ MS/MS, TOFMS 442 6.2 Xác định cấu hình lập thể MPI insulin ELISA phương pháp phổ CD 454 6.3 Xác định hàm lượng insulin so với insulin chuẩn HPLC RP-HPLC 461 6.4 Xác định hoạt tính riêng insulin theo Dược điển Hoa Kỳ USP 473 iv 6.5 Xác định dư lượng nội độc tố vi khuẩn phương pháp LAL 481 6.6 Thử nghiệm tính an toàn chuột 489 6.7 Đánh giá chất lượng insulin theo tiêu chuẩn quốc tế 495 CHƯƠNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHẾ PHẨM INSULIN ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG THỰC NHGIỆM TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT……………514 7.1 Nghiên cứu tạo mơ hình thực nghiệm chuột bị đái tháo đường…………………………………………… 514 7.2 Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính làm giảm đường huyết insulin mơ hình chuột bị ĐTĐ thực nghiệm…………………….521 7.3 Đánh giá tồn lưu hoạt tính chế phẩm insulin theo thời gian…… 531 PHẦN III CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC, KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 539 TÀI LIỆU THAM KHẢO 548 PHỤ LỤC 565 PHỤ LỤC Vật liệu phương pháp sử dụng cho quy trình tạo dịng biểu mini-proinsulin 566 PHỤ LỤC Vật liệu phương pháp sử dụng nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh khối đồng sinh khối E coli tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men 594 v PHỤ LỤC Vật liệu phương pháp sử dụng cho quy trình cơng nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI 629 PHỤ LỤC Vật liệu phương pháp sử dụng cho quy trình tinh chế insulin tái tổ hợp từ MPI 642 PHỤ LỤC Vật liệu phương pháp sử dụng thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 649 PHỤ LỤC Vật liệu phương pháp sử dụng nghiên cứu đặc tính kiểm sốt chất lượng insulin tái tổ hợp 653 PHỤ LỤC Vật liệu phương pháp sử dụng nghiên cứu hiệu chế phẩm insulin nguyên liệu điều trị bệnh ĐTĐ 655 PHỤ LỤC Dược điển Anh 657 DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG (Tập tài liệu đính kèm) DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG (Tập tài liệu đính kèm) KẾT QUẢ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC (Tập tài liệu đính kèm) vi QUY TRÌNH TỔNG QT SẢN XUẤT INSULIN vii viii chuỗi, việc tìm điều kiện tối ưu để tạo dạng proinsulin gấp cuộn tự nhiên trước xử lý protease để thu nhận insulin có hoạt tính quan trọng, có tính định Đó mục tiêu nghiên cứu để sản xuất insulin Một số nghiên cứu triển khai theo mục tiêu là: + Làm tăng tính tan proinsulin tế bào chất E coli (tránh việc tạo thể vùi) cách tạo proinsulin dạng dung hợp với protein khác dung hợp với interleukin-2; + Gắn proinsulin với trình tự tiết E coli để proinsulin tiết vào chu chất màng (periplasm) thay nằm tế bào chất tăng cường hiệu suất độ xác việc hình thành cầu nối disulfide proinsulin chu chất tế bào E coli cách đồng biểu với enzyme oxidase DsbA ; + Chang cộng chứng minh thay đoạn C proinsulin đoạn mini C ngắn có axít amin (thay 35 axít amin) bao gồm Arg-Arg, trình tự mini (Tyr-Pro-Gly-Asp-Val) Lys-Arg, phân tử mini-proinsulin (MPI) có hiệu gấp cuộn tăng 20-40% so với proinsulin Trong MPI, trình tự mini C tạo nên cấu trúc -turn nằm axít amin kiềm tính Arg-Arg Lys-Arg nhận diện phân cắt trypsin carboxypeptidase B Cấu trúc -turn hình thành hai chuỗi phiến (sheet) đối song song, cần cho gấp cuộn protein Trong trường hợp MPI, -turn gập đôi cấu trúc MPI, điều giúp cho hai chuỗi A B tiếp xúc với tốt nên dễ dàng hình thành cầu nối disulfide xác Ngồi ra, cơng ty nắm quyền sản xuất insulin tích cực nghiên cứu theo hướng biến đổi insulin để thay đổi hoạt tính insulin qua tạo thuốc có quyền 1.5 Mục tiêu đề tài Mục tiêu chung: - Tạo vector chủng biểu gen tạo mini-proinsulin cao - Xây dựng công nghệ sản xuất insulin từ chủng vi sinh tái tổ hợp Mục tiêu cụ thể: - Tạo số dòng E coli tái tổ hợp có khả tổng hợp mini-proinsulin cao - Quy trình lên men chủng E coli tái tổ hợp biểu mini-proinsulin qui mơ 100 lít - Quy trình cơng nghệ tách chiết, tinh chế mini-proinsulin - Quy trình tạo insulin có hoạt tính - 200mg insulin đạt độ tinh khiết 95%, có hoạt tính mơ hình động vật, an tồn, chất chí nhiệt tố, tương đương sản phẩm thương mại loại 1.6 Các nội dung khoa học đƣợc thực đề tài Nội dung Tạo dòng biểu mini-proinsulin Nội dung Nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh khối đồng sinh khối E coli tái tổ hợp qui mơ 100 lít dịch lên men Nội dung Nghiên cứu cơng nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI Nội dung Nghiên cứu công nghệ tinh chế insulin người tái tổ hợp Nội dung Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp Nội dung Nghiên cứu đặc tính kiểm sốt chất lượng insulin tái tổ hợp Nội dung Bước đầu nghiên cứu hiệu chế phẩm insulin điều trị bệnh ĐTĐ thực nghiệm mơ hình chuột PHẦN PHƢƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU VÀ TRANG THIẾT BỊ ĐÃ SỬ DỤNG 2.1 Phƣơng pháp nguyên cứu - Các phương pháp vi sinh - Phương pháp dịng hóa, biểu hiện, ly trích protein tái tổ hợp E coli - Phương pháp điện di SDS-PAGE, lai Western, xác định % protein biểu Quantity-One - Phương pháp lên men Jar fermentor 1, 5, 50 lít - Phương pháp lọc tiếp tuyến, ly tâm thu sinh khối tế bào - Phương pháp phá tế bào áp lực cao - Phương pháp sắc ký trao đổi cation, lọc gel, RP-HPLC - Phương pháp tủa mẫu, cô mẫu, tinh chế sơ màng lọc có kích thước giới hạn - Phương pháp tái gấp cuộn protein - Phương pháp phản ứng enzyme, chất - Phương pháp ELISA, khối phổ MS/MS, TOFMS - Phương pháp tạo chuột đái tháo đường - Phương pháp bảo quản mẫu - Phương pháp xác định dư lượng nội độc tố LAL test - Phương pháp xác định độ Quantity-One RP-HPLC - Phương pháp xác định hoạt tính riêng RP-HPLC - Phương pháp giải trình tự DNA phân tích DNA, protein 2.2 Trang thiết bị Ngoài dụng cụ phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh học Phân tử micropipette, đầu típ, eppendorf, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy … cịn có số thiết bị sau: máy phá tế bào sóng siêu âm (Ultrasonic Cell Disruptor, Mỹ), máy quang phổ chuyên dụng GeneQuant pro- (Amersham Biosciences), tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ), máy li tâm lạnh Mikro 2R (Hettich, Đức), máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh), máy đo pH (ORION, Anh), máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh), tủ ấm vi sinh vật Memmert (Đức), tủ sấy Memmert (Đức), nồi hấp Tomy (Nhật), tủ lạnh sâu -80oC (Sanyo, Nhật), tủ lạnh -30oC (Medical Class, Nhật), tủ mát 4-10oC (Nhật), cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), cân phân tích Precica (Thụy Sỹ), máy vortex (IKA, Mỹ), điện di protein (Bio-Rad), hệ thống lên men 1, lít BioTron –LiFlusGX(Mỹ), hệ thống lên men bán tự động x 50 lít , phần mềm Quantity-One (Bio-Rad), máy phá tế bào Microfluidizier Processor, máy ly tâm dung tích lớn, hệ thống tinh chế AKTA explorer, hệ thống HPLC, máy đông khô, máy lọc tiếp tuyến, máy đo đường huyết, máy đo nồng độ DNA (Nanodrop), máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences) PHẦN DANH MỤC KẾT QUẢ, SẢN PHẨM KHCN ĐẠT ĐƢỢC 3.1 Sản phẩm Dạng I Đề tài hoàn thành sản phẩm Dạng I đăng ký Thuyết minh mô tả Bảng 3.1, sản phẩm thứ 3, có chất lượng sản phẩm vượt so với đăng ký Đặc biệt, sản phẩm 3, “Chủng E coli biểu MPI dạng thể vùi tế bào chất” vượt số lượng chủng đăng ký 01 chủng Đề tài tạo nguyên liệu insulin tái tổ hợp có hoạt tính làm giảm đường huyết chuột bệnh đái tháo đường, cho thấy triển vọng cung cấp nguồn nguyên liệu để tiếp tục hồn thiện cơng nghệ hướng nghiên cứu triển khai thành thương phẩm insulin dược dùng cho người Bảng 3.1 Danh mục sản phẩm Dạng I đề tài KC.04.09/06-10 đăng ký hoàn thành TT Tên sản Số lượng chất Số lượng chất Ghi phẩm lượng đăng ký lượng đạt Insulin tái tổ 200 mg 200 mg Đạt hợp tương Độ tinh khiết Độ tinh khiết 95đương 95%, 24IU/mg 96%, 27 IU/mg thương phẩm protein, không chứa protein, không chứa Sigma (Mỹ) 10IU nội độc 10 IU nội độc tố/mg tố/mg Chủng E coli (01 chủng) (02 chủng), đó: Vượt biểu Biểu 10% tổng 01 chủng hiểu mức MPI protein 6xHis-MPI chiếm 16,8% tổng protein 01 chủng biểu 10xHis-MPI chiếm 13,9% tổng protein tế bào chất Chủng E coli (01 chủng) (01 chủng) Đạt 10 biểu FTNh-MPI Chủng E coli biểu DsbA-MPI Biểu 10% tổng protein (01 chủng) Biểu 10% tổng protein Biểu 12,8% tổng protein tế bào chất (01 chủng) Biểu 33,5% tổng protein chu chất Đạt 3.2 Sản phẩm Dạng II Đề tài hoàn thành đầy đủ sản phẩm Dạng II đăng ký trình bày Bảng 3.2 Trong sản phẩm này, đưa quy trình cơng nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp từ MPI dạng thể vùi tế bào chất E coli Bảng 3.2 Danh mục sản phẩm Dạng II đề tài KC.04.09/06-10 đăng ký hoàn thành Số Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Ghi TT Theo kế hoạch Thực tế đạt Quy trình tạo 03 chủng 04 chủng Vượt dịng E coli (Đủ chi tiết kỹ (Đủ chi tiết kỹ biểu MPI thuật thiết kế, đặc thuật thiết kế, đặc điểm vector tạo điểm vector tạo dòng, vector biểu dòng, vector biểu hiện, đặc điểm hiện, đặc điểm tế tế bào chủ, điều kiện bào chủ, điều kiện biến nạp, điều kiện biến nạp, điều kiện tuyển chọng dòng tuyển chọng dòng mục tiêu để biểu mục tiêu để biểu hiện dạng MPI ) dạng MPI ) Quy trình công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp 01 quy trình (Đủ thơng số kỹ thuật tối ưu bước sau: bước lên men tổng hợp MPI quy mơ 1- 100 lít; bước thu nhận sinh khối phá tế bào; bước xử lý MPI để thu nhận MPI có 11 01 quy trình (Đủ thơng số kỹ thuật tối ưu bước sau: bước lên men tổng hợp MPI quy mô 1- 100 lít; bước thu nhận sinh khối phá tế bào; bước xử lý MPI để thu nhận MPI có hoạt Đạt hoạt tính; bước tinh chế insulin) Báo cáo kết 01 báo cáo thử nghiệm (Đánh giá hoạt tính hoạt tính insulin phương insulin tái tổ pháp miễn dịch hợp mơ hình chuột bị đái tháo đường) tính; bước tinh chế insulin) 01 báo cáo (Đã đánh giá hoạt tính insulin phương pháp miễn dịch mơ hình chuột bị đái tháo đường) Báo cáo kết 01 báo cáo 01 báo cáo phân tích (Phân tích cấu trúc, (Đã phân tích cấu cấu trúc đặc cấu hình insulin tái trúc, cấu hình insulin tính insulin tổ hợp so với insulin tái tổ hợp so với chuẩn phương insulin chuẩn pháp phương phương pháp pháp phổ MS/MS phương pháp phổ phổ CD) MS/MS phổ TOFMS) Báo cáo bước 01 báo cáo 01 báo cáo đầu nghiên cứu (Tạo mơ hình (Đã tạo mơ hình hiệu chế thực nghiệm chuột thực nghiệm chuột bị phẩm insulin bị bệnh đái tháo bệnh đái tháo đường; điều trị đái tháo đường; thử nghiệm thử nghiệm hoạt đường thực hoạt tính làm giảm tính làm giảm đường nghiệm đường huyết chế huyết chế phẩm phẩm insulin insulin mô hình mơ hình chuột bị chuột bị bệnh đái bệnh đái tháo tháo đường; đánh đường; đánh giá tồn giá tồn lưu hoạt tính lưu hoạt tính của chế phẩm insulin chế phẩm insulin theo thời gian) theo thời gian) Tiêu chuẩn 01 01 sở insulin tái tổ (Đề xuất tiêu chí (Đã đề xuất tiêu hợp độ tinh khiết, chí độ tinh khiết, hoạt tính riêng, dư hoạt tính riêng, dư lượng nội độc tố) lượng nội độc tố) 12 Đạt Đạt Đạt Đạt 3.3 Sản phẩm Dạng III Qua việc thực đề tài thu sản phẩm Dạng III có cơng trình nước (3 báo báo cáo khoa học toàn quốc) báo cáo khoa học quốc tế Những sản phẩm vượt xa tiêu so với đăng ký mô tả Bảng 3.3 Bảng 3.3 Danh mục sản phẩm Dạng III đề tài KC.04.09/06-10 đăng ký đạt TT Tên sản phẩm đăng ký Yêu cầu khoa học cần đạt, số lƣợng Báo cáo khoa học Trong nước: 3-4 Ngoài nước: TT Tên báo, tên tạp chí (hội nghị) đăng Trong nước Tạo dòng biểu mini-proinsulin tái tổ hợp E coli, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Tập 3, 155-160, 2005 Thu nhận mini-proinsulin có cấu hình gấp cuộn từ protein tái tổ hợp dạng thể vùi biểu E coli; Hội nghị khoa học toàn quốc lần 4: Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ, nông , sinh, y học công nghiệp thực phẩm, 15-17/10/2008, Hà Nội, 673-676, 2008 Biểu mini-proinsulin tái tổ hợp dạng tan tế bào chất E coli thu nhận insulin có cấu hình gấp cuộn; Hội nghị khoa học tồn quốc lần 4: Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ, nông , sinh, y học công nghiệp thực phẩm, 15-17/10/2008, Hà Nội, 677-679, 2008 Dịng hóa biểu mini-proinsulin dung hợp ubiquitin E coli; Hội nghị khoa học toàn quốc lần 4: Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ, nông , sinh, y học công nghiệp thực phẩm, 15-17/10/2008, Hà Nội, 751-754, 2008 Cấu trúc chủng Escherichia coli tái tổ hợp biểu mini-proinsulin dung hợp với Ecotin dạng tan chu chất; Hội nghị Công nghệ Sinh học tồn quốc 2009: Cơng nghệ Sinh học phục vụ Nông-Lâm nghiệp, Thủy sản, Công nghiệp, Y-Dược Bảo vệ Môi trường, 26-27/11/2009, Thái Nguyên, 721-724, 2009 Cấu trúc chủng Escherichia coli BL21(DE3) biểu protein dung hợp DsbA-miniproinsulin dạng tan chu chất để tạo insulin tái tổ hợp, 13 tạp chí Cơng nghệ Sinh học (đang viết) Chọc lọc môi trường lên men mật độ cao để sản xuất mini-proinsulin Escherichia coli BL21(DE3), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (đang viết) Quốc tế Study on medium component and condition to synthesize the recombinant human mini-proinsulin in E coli at pilot scale fermentation, Regional Symposium on Chemical Engineering (2005)New trends in Technology towards sustainable development, Proceedings, pp 336-340 Studying on high density cell cultivation of E coli BL21(DE3)/pET43Ins by fed-batch, Journal of Biotechnology, Volume 136, Supplement 1, October 2008, Pages S516-S517 3.4 Đào tạo sau đại học Đề tài đạo tạo 01 tiến sĩ Thạc sĩ mô tả chi tiết Bảng 3.4 Những số cho thấy đề tài vượt tiêu việc đào tạo sau đại học Những nghiên cứu sinh thạc sĩ đề tài tham gia công tác nhiều quan khác nước học nước Bảng 3.4 Chỉ tiêu đào tạo sau đại học đề tài KC.04.09/06-10 đăng ký đạt Cấp đào tạo, chuyên ngành đào tạo đăng ký Số lƣợng đăng ký TT TT Thạc sĩ 02 Nghiên cứu sinh 01 Danh sách Thạc sĩ, Nghiên cứu sinh đào tạo thông qua đề tài Họ tên học viên, nghiên cứu sinh Tên luận văn, Luận án Năm bảo vệ/Nhận Thạc sĩ Thu nhận insulin người tái tổ hợp từ mô hình mini-proinsulin biểu Escherichia coli Lê Trần Thanh Nghiên cứu tạo dòng tạo insulin Nhật tái tổ hợp mơ hình miniChu Kỳ Nam 14 2007/nhận 2008 2009/nhận 2009 proinsulin Escherichia coli Lê Ngọc Hiếu Nghiên cứu sản xuất miniproinsulin dung hợp với DsbA tan chu chất Escherichia coli Nguyễn Tiến Đạt Nghiên cứu thu nhận tinh chế insulin tái tổ hợp từ mini-proinsulin dạng thể vùi tế bào E coli Mai Hương Trà Tạo dòng vi khuẩn biểu protein dung hợp Ecotin-miniproinsulin dạng tan chu chất Nghiên cứu sinh Hoàng Văn Quốc Nghiên cứu công nghệ sản xuất Chương insulin tái tổ hợp 15 2010/nhận 2010 2010/nhận 2010 2010/nhận 2010 2009/đã nhận 2010 PHẦN TÌNH HÌNH ĐĂNG KÝ BẢO HỘ BẢN QUYỀN Do thời gian thực đề tài có hạn, qui trình đăng ký sở hữu thường kéo dài 1-2 năm nên chưa kịp thực nội dung 16 PHẦN TÁC ĐỘNG ĐỐI VỚI KINH TẾ XÃ HỘI VÀ MÔI TRƢỜNG 5.1 Hiệu khoa học cơng nghệ - Về trình độ khoa học: Sản phẩm đề tài protein tái tổ hợp dùng làm nguyên liệu để phát triển thuốc điều trị bệnh người Mặc dù sản phẩm phát triển thương mại hóa từ thập niên 80 kỷ 20, nhiên công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp dùng làm thuốc xếp vào loại công nghệ mũi nhọn, tiên tiến giới tính phức tạp tinh tế bước quy trình trình cơng nghệ Do vậy, việc đề tài xây dựng quy trình công nghệ sản xuất insulin bao gồm đủ bước tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp gen, lên men, thu nhận tiền thân insulin MPI, tái gấp cuộn, xử lý MPI thành insulin, tinh chế insulin đạt mức độ tương đương với insulin thương phẩm chứng minh insulin có hoạt tính chuột bi ĐTĐ bước phát triển vượt bậc mặt khoa học cơng nghệ - Về trình độ (cơng nghệ): đạt trình độ cơng nghệ tương tự giới - Về đào tạo nâng cao trình độ nhân lực KHCN: Đề tài góp phần nâng cao tiềm lực nội sinh nghiên cứu, phát triển ứng dụng công nghệ công nghệ sinh học công nghệ gen, công nghệ lên men, công nghệ protein-enzyme, phát triển sản phẩm công nghệ sinh học có giá trị cao, có nhu cầu thị trường lớn góp phần phát triển cơng nghiệp sinh học nước nhà, tiếp cận trình độ khu vực giới Đã đào tạo 17 01 tiến sỹ, 06 thạc sỹ 18 cử nhân liên quan đến công nghệ nêu ứng dụng trường hợp sản xuất insulin 5.2 Hiệu kinh tế xã hội Đề tài chứa có sản phẩm thương mại hóa tạo sản phẩm nguyên liệu insulin để công ty dược phát triển thành biệt dược insulin điều trị bệnh ĐTĐ, phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh nguy hiểm có chiều hướng ngày gia tăng nước ta, chăm sóc sức khỏe nhân dân, đồng thời đóng góp cho phát triển cơng nghiệp dược phẩm, tạo điều kiện để có tiềm lực sản xuất thuốc điều trị cao cấp phát triển công nghiệp sinh phẩm dược (Biopharmaceuticals) - Đề tài góp phần nâng cao tiềm lực nội sinh nghiên cứu, phát triển ứng dụng công nghệ công nghệ sinh học công nghệ gen, công nghệ lên men, công nghệ protein-enzyme, phát triển sản phẩm công nghệ sinh học có giá trị cao, có nhu cầu thị trường lớn góp phần phát triển cơng nghiệp sinh học nước nhà, tiếp cận trình độ khu vực giới - Đối với tổ chức chủ trì, đề tài góp phần nâng cao trình độ nghiên cứu cán bộ, đào tạo phát triển đội ngũ cán nghiên cứu; nâng cao chất lượng đào tạo sau đại học, nghiên cứu khoa học - chuyển giao công nghệ đơn vị 18 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6.1 Kết luận Đề tài thực hoàn thành đầy đủ mục tiêu, nội dung sản phẩm đăng ký, tiến độ bị chậm tháng so với đăng ký Việc chậm tiến độ nội dung đăng ký nhiều thân nhóm nghiên cứu chưa lường hết khó khăn mặt khoa học trình nghiên cứu Tuy nhiên, với nỗ lực thành viên nhóm nghiên cứu giúp đỡ, tạo điều kiện Ban chủ nhiệm Chương trình, Văn phịng Các chương trình Bộ Khoa học Công nghệ việc chấp thuận gia hạn thêm thời gian thực đề tài, chúng tơi hồn thành nội dung đăng ký sau: (i) Nội dung 1, tạo dòng biểu mini-proinsulin; (ii) Nội dung 2, nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh khối đồng sinh khối E coli tái tổ hợp qui mơ 100 lít dịch lên men; (iii) Nội dung 3, nghiên cứu cơng nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI; (iv) Nội dung 4, nghiên cứu cơng nghệ tinh chế insulin người tái tổ hợp; (v) Nội dung 5, thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp; (vi) nội dung 6, nghiên cứu đặc tính kiểm soát chất lượng insulin tái tổ hợp; nội dung 7, bước đầu nghiên cứu hiệu chế phẩm insulin điều trị đái tháo đường thực nghiệm mơ hình chuột Mặc dầu Việt Nam có số nhóm nghiên cứu liên quan tới insulin kết đạt nhóm nghiên cứu trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh kết hoàn thiện Việt Nam từ khâu tạo dòng, lên men sau lên men để thu insulin tái tổ hợp dạng hoàn chỉnh để làm nguồn nguyên liệu sản xuất insulin dược dùng cho người tương lai Việt Nam Những kinh nghiệm mà nhóm 19 thu từ khó khăn đề tài giải khó khăn học quý báu cho việc thực đề tài 6.2 Kiến nghị Đề nghị Bộ Khoa học Công nghệ tiếp tục đầu tư cho đề tài theo hướng nghiên cứu phát triển với chiến lược sau: - Nghiên cứu nâng cao hiệu suất quy trình cơng nghệ nâng cao hiệu suất tái gấp cuộn MPI, hiệu suất cắt chuyển MPI tái gấp cuộn thành insulin, mở rộng tế bào chủ sản xuất miniproinsulin làm nguồn nguyên liệu tạo insulin tái tổ hợp - Nghiên cứu chế tạo thuốc insulin dùng cho người nghiên cứu thành phần tá dược, công thức phối trộn, thử nghiệm lâm sàng, phương thức bảo quản thuốc insulin - Công nghệ insulin để tăng độ tồn lưu hoạt tính in vitro in vivo 20 ... Tên đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ điều trị bệnh đái tháo đường Mã số đề tài: KC.04.09/06-10 Thuộc: Chương trình ? ?Nghiên cứu, phát triển ứng dụng công nghệ sinh... 19 3.4 Nghiên cứu công nghệ tinh chế insulin người tái tổ hợp 22 3.5 Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 23 3.6 Nghiên cứu đặc tính kiểm sốt chất lượng insulin tái tổ hợp ... VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC