Đang tải... (xem toàn văn)
Tổng quan tài liệu 8Kết quả nghiên cứu 36I. Chọn dòng thanh hao trên đồng ruộng và in vitro 37.................................................................1. Chọn dòng thanh hao trên vườn ươm và đồng ruộng......................................................... 382. Chọn dòng thanh hao in vitro .......................................................................................................41II. Nuôi cấy tếbào thanh hao .......................................................................................................483. Nuôi cấy phát sinh tếbào mô sẹo thanh hao trên môi trường bán rắn (agar) 504. Nuôi cấy dịch huyền phù tếbào thanh hao trong môi trường lỏng 585. Nuôi cấy dịch huyền phù tếbào thanh hao trong bioreactor ....................................................................................................................................63III. Nuôi cấy rễtơthanh hao .........................................................................................................746. Chọn mô thanh hao nuôi cấy phát sinh rễtơ.....................................................................777. Nuôi cấy chuyển nạp gen rễtơvào mô lá thanh hao .........................................................808. Nuôi cấy rễtơthanh hao trên môi trường bán rắn (agar) 829. Nuôi cấy rễtơthanh hao trong môi trường lỏng ...................................................................8910. Nuôi cấy rễtơthanh hao trong bioreactor............................................................................. 96IV. Phương pháp phân tích và tinh chếartemisinin ...................................................................10211. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 10312. Phương pháp chiết suất và tinh chếartemisinin................................................................. 110Kết luận và Đềnghị118Tài liệu tham khảo 119Phụlục
BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ MALAYSIA – VIỆT NAM ĐỀ TÀI THỰC HIỆN NGHỊ ĐỊNH THƯ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ARTEMISININ BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.) VÀ PHÁT TRIỂN TRÊN QUY MÔ PILOT (GIAI ĐỌAN 2007-2008) Cơ quan chủ quản VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM Cơ quan chủ trì VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI Chủ nhiệm đề tài PGS.TS TRẦN VĂN MINH 8145 Tp Hồ Chí Minh 8-2009 MỤC LỤC Bìa Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh sách bảng Danh sách hình Danh sách đồ thị Nhiệm vụ nghị định thư Sản phẩm khoa học công nghệ Đào tạo Bài báo Tóm tắt Tổng quan tài liệu Kết nghiên cứu I Chọn dòng hao đồng ruộng in vitro Chọn dòng hao vườn ươm đồng ruộng Chọn dòng hao in vitro II Nuôi cấy tế bào hao Nuôi cấy phát sinh tế bào mô sẹo hao môi trường bán rắn (agar) Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hao môi trường lỏng Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hao bioreactor III Nuôi cấy rễ tơ hao Chọn mô hao nuôi cấy phát sinh rễ tơ Nuôi cấy chuyển nạp gen rễ tơ vào mô hao Nuôi cấy rễ tơ hao môi trường bán rắn (agar) Nuôi cấy rễ tơ hao môi trường lỏng 10 Nuôi cấy rễ tơ hao bioreactor IV Phương pháp phân tích tinh chế artemisinin 11 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 12 Phương pháp chiết suất tinh chế artemisinin Kết luận Đề nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục i ii iii iv v 36 37 38 41 48 50 58 63 74 77 80 82 89 96 102 103 110 118 119 TĨM TẮT Chọn dịng hao vườn ươm đồng ruộng Trong điều kiện nhiệt đới (TPHCM), trồng thử nghiệm vào tháng 2/1-20/4/2008 (ngày ngắn), chọn hai dịng TC1.8 TC2.1 có hàm lượng artemisinin tương ứng 0,448% 0,408% Trong điều kiện vùng cao (Đà Lạt), trồng thử nghiệm vào tháng 20/1-30/6/2009 (ngày ngắn), chọn lọc hai dòng TC1.136 TC2.29 có hàm lượng artemisinin tương ứng 1,470% 1,297% Chọn dịng hao in vitro Mơi trường khống LV thích hợp cho q trình chọn dịng in vitro Hai dòng Thanh hao TC1.8 TC2.1 thể chất di truyền thấp so với mẹ vườn ươm Phương pháp chọn dòng in vitro đáp ứng yêu cầu chọn dòng nhanh hao điều kiện nhiệt đới Hai dòng Thanh hao chọn lọc thể khả nhân giống, tạo mô sẹo tái sinh mô sẹo in vitro điều kiện môi trường nuôi cấy Nuôi cấy phát sinh tế bào mô sẹo hao môi trường bán rắn (agar) Thân rễ sử dụng làm mẫu nuôi cấy phát sinh mơ sẹo Mơi trường ni cấy thích hợp phát sinh tăng sinh mô sẹo: LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) Mơi trường thích hợp cho tái sinh mô sẹo LV + BA (3mg/l) + NAA (0,2mg/l) Mơ sẹo có màu trắng để tối có màu xanh để ánh sáng Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hao môi trường lỏng Kết nghiên cứu agar mơi trường lỏng tương thích Mơi trường thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù LV B5 Mơi trường dinh dưỡng khống B5 thích hợp cho tổ hợp NAA+kinetin: B5 + NAA (1mg/l) + kinetin (0,5mg/l) Mơi trường dinh dưỡng khống LV thích hợp cho tổ hợp BA+NAA: mơi trường thích hợp cho tăng sinh mô sẹo tăng sinh dịch huyền phù tế bào LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) + pepton (1g/l) Thời gian cấy truyền thích hợp sau tuần ni cấy có tốc độ tăng sinh tế bào cao (17,2) Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hao bioreactor Kết nghiên cứu cho thấy môi trường nuôi cấy phát sinh mơ sẹo phơi hóa, dạng tế bào tiền phơi nhân sinh khối, có khả tổng hợp artemisinin LV + NAA (0,5mg/l) + BA (0,5mg/l) cần phải điều chỉnh hàm lượng chất khoáng bổ sung như: đường sucrose (30g/l), đạm tổng số (40mM), tỷ lệ NH4+/NO3- (15/60), nồng độ KH2PO4 (200mg/l), GA3 (1mg/l), yeast extract (100mg/l) hay chitosan (150mg/l) cải thiện khả tích tụ artemisinin tế bào 0,432% Chọn mơ hao nuôi cấy phát sinh rễ tơ Môi trường khống B5 thích hợp cho q trình ni cấy phát sinh rễ Sự phát sinh rễ mạnh mẽ với mẫu nuôi cấy nồng độ NAA (0,5mg/l) Cytokinin (BA, kinetin) IAA, IBA khơng thích hợp cho q trình phát sinh rễ Ni cấy chuyển nạp gen tạo rễ tơ vào mô hao Lá từ chồi thực sinh in vitro sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy chuyển gen Phương pháp dùng agrobacterium tỏ hiệu Đã thu nhận mô chuyển gen loại hẳn agrobacterium Rễ tơ hình thành mạnh mẽ môi trường MS không chất sinh trưởng sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu sau Nuôi cấy rễ tơ hao mơi trường bán rắn (agar) Cytokinin khơng kích thích tăng sinh rễ 2iP kích thích tích tụ artemisinin Auxin kích thích tăng sinh rễ khơng kích thích tích tụ artemisinin Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng vào ngày thứ 14 sau cấy có ý nghĩa kích thích tăng sinh rễ tích tụ artemisinin với tổ hợp TH1 [B5+ GA3 (0,01mg/l) + ABA (0,1mg/l) + NAA (5mg/l)] Nuôi cấy rễ tơ hao môi trường lỏng Mơi trường MS cải tiến có đạm nitrate (30mM), tỷ lệ NH4+/NO3(1/5), đường sucrose 50g/l, KH2PO4 (1,5mM), GA3 (5mg/l), NAA (0,5mg/l) cải thiện khả tích tụ artemisinin (1,468%) 10 Nuôi cấy rễ tơ hao bioreactor Môi trường MS cải tiến, 26+2oC, 16 chiếu sáng /ngày, pH=6 cải thiện khả tích tụ artemisinin (1,982%) kết hợp với bioreactor bán chìm theo chế độ ngập/nổi (15/45) nâng cao hiệu tích tụ artemisinin rõ rệt (2,088%) Yeast extract chitosan kích thích tích tụ artemisinin có hiệu 11 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Đã xây dựng phương pháp phân tích điều chế artemisinin từ mẫu Thanh hao cấy mô, mơ sẹo soma, mơ sẹo phơi hóa, dịch huyền phù tế bào (nuôi cấy máy lắc bioreactor), rễ (nuôi cấy máy lắc bioreactor) TỒNG QUAN TÀI LIỆU Muỗi truyền bệnh sốt rét Có khoảng 2.500 lồi muỗi có lồi Anophele truyền ký sinh trùng sốt rét Plasmodium cho loài hầu, khỉ, người (primate) động vật có vú Có 60 loài, khoảng 400 loài Anophele biết, vector truyền Plasmodium ; lồi khác coi vector phụ tùy địa phương Vòng đời: Trứng muỗi mặt nước, hình thon dài khoảng 1mm, có hai phao hai bên, nở sau 2–3 ngày thành bọ gậy Bọ gậy ăn hạt hữu nhỏ Ở vùng nhiệt đới, từ trứng nở tới muỗi trưởng thành khoảng 11 – 13 ngày Tập tính: Muỗi Anophele hoạt động từ mặt trời lặn đến mặt trời mọc Mỗi loài khác đốt mồi cao điểm địa điểm đốt mồi (trong nhà hay nhà) Muỗi thường nghỉ suốt thời gian cần thiết để tiêu máu phát triển trứng nhà hay bụi Chúng thường đẻ trứng vũng, rãnh, ruộng nước, nơi nước lặng suối nước chảy chậm Các loài Anophele khác mức độ thích đốt người hay đốt súc vật Một số loài đốt người súc vật; số chủ yếu đốt súc vật, số khác đốt người Các loài đốt người loài truyền sốt rét nguy hiểm Những điểm phân biệt muỗi Anophele với lồi muỗi khác • Chiều dài pan chiều dài vịi • Ở tư nghỉ, vòi thân muỗi thường hợp thành với mặt phẳng muỗi đậu góc nhọn Góc thay đổi tùy loài, từ nhọn đến gần 900 Ngoại trừ loài Anophele culicifacies, thân song song với mặt muỗi đậu (www.bio.ioit-hcm.ac.vn) Bệnh có triệu chứng nguy hiểm, người bệnh chết 12 sau có biểu triệu chứng Biểu lâm sàng bệnh với dấu hiệu: sốt rét run vã mồ hơi, thiếu máu, gan to, lách to Có nhiều thể lâm sàng: sốt cách nhật P vivax (hay P ovale Châu Phi), tái phát sau rời khỏi vùng dịch; sốt cách nhật ác tính P falciparum, khơng tái phát rời vùng dịch; sốt cách hai ngày P malariae, tái phát sau rời vùng dịch Sốt rét P falciparum thường có nhiều biến chứng nặng: sốt rét ác tính, sốt nơn mật, đái hemoglobin gây tử vong cao Cơ thể người bị bệnh sốt rét nhiều lần xuầt hệ thống miễn dịch lại vi khuẩn Tuy nhiên, hệ thống tồn hay hai năm sau nhiễm bệnh Vì thế, người ta khơng thể miễn dịch với vi khuẩn sốt rét dù nhiều lần bị bệnh Hiện chưa có vaccin phịng ngừa bệnh (http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn) Ở Việt Nam xác định có 60 loài Anophele Các loại muỗi Anophele minimus, A dirus, A sundaicus mang hai ký sinh trùng sốt rét, P falciparum P vivax Các loại muỗi có nhiều Ðơng Nam Á Ký sinh trùng P vivax xuất giới hạn khu vực đồng sơng Cửu Long, P falciparum thường có vùng núi cao nguyên Tây nguyên, Hoàng Liên Sơn, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Tĩnh nơi xảy nhiều dịch sốt rét thập niên 1980 đến đầu năm 1990 Một số loài muỗi khác nghi ngờ truyền gây sốt rét Việt Nam A campestris, A culicifacies, A lesteri Bệnh sốt rét nghiên cứu bệnh sốt rét Cách 10.000 năm, bệnh sốt rét có Châu Phi Cách khoảng 5.000 – 10.000 năm, bệnh có Mesopotamia, bán đảo Ấn Độ Đông Nam Á Từ kỷ 19, bệnh sốt rét có mặt khắp giới Đến đầu kỷ 20, hàng triệu người khắp giới chết loại bệnh Tuy nhiên, vào năm đầu thập niên 1950, bệnh sốt rét biến khỏi Bắc Mỹ Châu Âu, nạn nhân sốt rét chủ yếu Châu Phi (www.malariasite.com) Năm 1880, thầy thuốc người Pháp Alphonce Laveran (1845–1922) phát vi trùng gây bệnh sốt rét (giải Nobel Năm 1907) – bệnh làm chết người nước nhiệt đới Á nhiệt đới nhiều bệnh khác Năm 1897, Ronald Ross (1857 – 1932), bác sĩ người Anh nghiên cứu côn trùng học nghiên cứu muỗi truyền bệnh sốt rét, phát ký sinh trùng bệnh muỗi Anophele Năm 1902, ông trao giải Nobel thành tựu Sốt rét ký sinh trùng sốt rét thuộc giống Plasmodium gây nên Ở người, loài Plasmodium falciparum, P vivax, P malariae P ovale Trong đó, P falciparum loại gây sốt rét ác tính, có tỉ lệ tử vong cao, trẻ em ; P vivax P ovale gây sốt cách nhật lành tính Đơi khi, P vivax gây sốt rét ác tính Plasmodium sống quanh năm thể muỗi Tuy nhiên, quần thể muỗi Anophele lại phát triển theo mùa (phụ thuộc nhiệt độ lượng mưa) nên sốt rét có điểm cao vào đầu cuối suốt mùa mưa Bệnh lây truyền nơi có nhiệt độ trung bình 14,5oC Nước ta thuộc vùng nhiệt đới, nhiệt độ trung bình cao nhiệt độ trên, bệnh lan truyền quanh năm Do nhiệt độ lượng mưa dao động theo chu kỳ mùa (mùa mưa mùa khô) nên bệnh phát triển không tháng mà thường có đỉnh cao năm, đỉnh đầu năm (tháng đến tháng 6), đặc biệt đỉnh cuối năm vào mùa mưa: từ tháng đến tháng 11 Hình 1: Ký sinh trùng Plasmodium falciparum xâm nhập vào tế bào hồng cầu 10 Nhiệt độ tốt để ký sinh trùng sốt rét phát triển thể muỗi từ khoảng 28–30oC Nếu nhiệt độ trung bình 28oC P falciparum cần ngày, P.vivax cần ngày; nhiệt độ trung bình 30oC P falciparum cần ngày, P vivax cần ngày để hoàn thành giai đoạn phát triển thể muỗi từ thể giao bào (gametocytes) dày đến thể thoa trùng (sporozoites) tuyến nước bọt có khả truyền bệnh Muỗi đốt máu người truyền ký sinh trùng sốt rét sang cho người lành để gây bệnh (Theo Sức Khỏe & Đời Sống: http://www.netcenter.com.vn) Hình 2: Chu trình bệnh sốt rét (http://www.dpd.cdc.gov) Hình 3: Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum phá vỡ hồng cầu 11 Bệnh sốt rét trở thành vấn đề toàn cầu, bệnh thường thấy 105 quốc gia, phổ biến nhiều vùng thuộc châu Á, châu Phi, Trung Mỹ Nam Mỹ Hàng năm, có 300 – 500 triệu người khắp giới bị nhiễm bệnh triệu người chết loại bệnh Tình trạng mắc bệnh tử vong, đặc biệt trẻ em thai phụ sốt rét gây nên báo động mạnh Du khách dân nhập cư mang bệnh sốt rét nguyên nhân khiến bệnh sốt rét lan truyền khắp giới Mỗi ngày châu Phi có đến 3.000 trẻ em tử vong sốt rét (thống kê năm 2003), nghĩa 30 giây lại có em chết bệnh Hai loại muỗi A gambiae A funesus xem “vô địch” lĩnh vực truyền bệnh cho người Bệnh gây thiệt hại khoảng 12 tỷ USD/năm cho châu Phi, chiếm đến 40% ngân sách phục vụ sức khỏe cộng đồng (Thanh Vân - theo Eurekalert) Hình 4: Bản đồ tình trạng bệnh sốt rét giới Việt Nam nằm khu vực sốt rét nặng giới Khoảng 60 năm trước, năm nước ta có gần triệu người mắc bệnh, chiếm 5% dân số (Morin, 1926), tỉ lệ tử vong đến 20% Chương trình Thanh tốn sốt rét tiến hành từ năm 1960 có khoảng 45 triệu dân ta 12 Thiết bị sử dụng nghiên cứu Hình 1: Hệ thống bioreactor BioFlo110 Hình 2: Hệ thống bioreactor bán chìm RITA (Taiwan, ROC) Hình 3: Máy lắc cơng nghiệp Cây hao chọn dịng vườn ươm Hình 4: Cây hao chọn dòng 15 ngày tuổi vườn ươm VSHNĐ Hình 5: Cây hao chọn dịng 30 ngày tuổi vườn ươm VSHNĐ Chọn dòng hao đồng ruộng Đà Lạt Hình 6: Gốc hao chọn dịng tháng tuổi Hình 7: Cây hao chọn dịng TC1.8 Hình 8: Cây hao chọn dịng TC2.1 Hình 9: Thu hoạch dịng hao chọn lọc Dịng hóa hao in vitro Hình 10: Dịng hóa hao mơi trường MS Hình 11: Dịng hóa hao mơi trường LV Hình 12: Dịng hóa hao TC1.8 mơi trường MS Hình 13: Dịng hóa hao TC2.1 mơi trường MS Ni cấy tạo mơ sẹo (lá, thân, rễ) Hình 14: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ hao in vitro Hình 15: Ni cấy tạo mơ sẹo từ thân hao in vitro Hình 16: Ni cấy tạo mô sẹo từ rễ hao in vitro Mô sẹo phơi hóa Hình 17: Mơ sẹo trắng ngà Hình 18: Mơ sẹo phơi hóa Hình 19: Mơ sẹo xanh Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào máy lắc Hình 20: Ni cấy dịch huyền phù tế bào hao môi trường lỏng máy lắc công nghiệp Hình 21: Dịch huyền phù tế bào hao Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào bioreactor Hình 22: Hệ thống bioreactor BioFlo110 Hình 23: Bình ni cấy lít Hình 24: Tế bào dịch huyền phù bắt đầu vào giai đoạn phân chia sau ngày ni cấy Hình 25: Tế bào dịch huyền phù vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối sau 25 ngày nuôi cấy Rễ tơ chuyển gen tái sinh từ hao Hình 26: Rễ tơ chuyển gen phát sinh từ mô sau 20 ngày nuôi cấy Hình 27: Sơ khởi rễ tơ chuyển gen Hình 28: Rễ tơ chuyển gen phát sinh từ mô sau 30 ngày ni cấy Hình 29: Rễ tơ chuyển gen phát sinh từ mô sau 40 ngày nuôi cấy Nuôi cấy rễ tơ chuyển gen máy lắc lạnh Hình 30: Hệ thống ni cấy định ơn Hình 31: Rễ tơ nuôi cấy nhân sinh khối Hình 32: Sinh khối rễ tơ sau 20 ngày ni cấy Hình 33: Sinh khối rễ tơ sau 30 ngày nuôi cấy 10 Nuôi cấy rễ tơ bioreactor bán chìm Hình 34: Hệ thống ni cấy bán chìm Hình 35: Rễ tơ chuyển gen sau ngày ni cấy Hình 36: Rễ tơ chuyển gen sau ngày ni cấy Hình 37: Rễ tơ chuyển gen sau ngày nuôi cấy 11 Thu họach mẫu bột khô hao Hình 38: Mẫu sấy khơ Hình 39: Mẫu sấy khơ dạng bột (mơ sẹo ngà) Hình 40: Mẫu sấy khô dạng bột (mô sẹo xanh) 12 Cơ quay chân khơng cột phân đọan Hình 41: Hệ thống quay Hình 42: Cột phân đoạn Hình 43: Tinh thể hao sau cô quay chưa qua cột phân đoạn 13 Phân đọan phát artemisinin (15-23) Hình 44: Phân đoạn 1-45 Hình 45: Phân đoạn phát artemisinin 15-23 14 Mẫu tinh thể artemisinin Hình 46: Tinh thể artemisinin Hình 47: Tinh thể artemisinin ... bào hao môi trường l? ??ng Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hao bioreactor III Nuôi cấy rễ tơ hao Chọn mô hao nuôi cấy phát sinh rễ tơ Nuôi cấy chuyển nạp gen rễ tơ vào mô hao Nuôi cấy rễ tơ hao môi... vào nuôi cấy mô sẹo môi trường LV + NAA (0-0,5-1 mg /l) + BA (0-0,1-0,5-1 mg /l) Bảng 2.3 cho thấy môi trường LV + NAA (0,5 mg /l) + BA (0,5 mg /l) thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo tối, tạo tế bào mô. .. tích l? ??ng tế bào) Động thái sinh trưởng dịch huyền phù tế bào Môi trường nuôi cấy tế bào dịch huyền phù LV + BA (0,5mg /l) + NAA (0,5mg /l) + pepton (5g) + CW (10 %) + sucrose (30g /l) Thể tích ni cấy