Đang tải... (xem toàn văn)
Cải tiến phương pháp bán tổng hợp artesunat, bào chế và đánh giá tác dụng sinh học viên nén artesunat - piperaquin
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Nguyễn Văn Hân CẢI TIẾN PHƯƠNG PHÁP BÁN TỔNG HỢP ARTESUNAT, BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC VIÊN NÉN ARTESUNAT - PIPERAQUIN Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm Mã số: 62 73 01 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2010 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Hữu Nghị TS Nông Thị Tiến Phản biện 1: GS.TS Đào Văn Phan Phản biện 2: GS.TSKH Phan Đình Châu Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Văn Minh Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước, họp Trường Đại học Dược Hà Nội, vào hồi 00 ngày 09 tháng 04 năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN ASU CP DĐVN HPTR IP IR KST LD50 MS NMR p SD USP X β-CD : Artesunat : Dược điển Trung Quốc (Chinese Pharmacopoeia) : Dược điển Việt Nam : Hệ phân tán rắn : Dược điển Quốc tế (International Pharmacopoeia) : Phổ hồng ngoại (Infra Red spectrometry) : Ký sinh trùng : Liều gây chết 50% (Lethal dose) : Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectrometry) : Ngưỡng xác suất kiểm định thống kê : Độ lệch chuẩn (Standard deviation) : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia) : Giá trị trung bình : β-cyclodextrin MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Bệnh sốt rét ký sinh trùng kháng thuốc gia tăng nhiều nơi vùng nhiệt đới, gây khó khăn cho việc chọn thuốc điều trị Để chống tượng kháng thuốc lan rộng, xu hướng chấp nhận sử dụng phác đồ phối hợp dẫn xuất artemisinin với thuốc khác có thời gian bán thải dài Trên thực tế, thuốc phối hợp có hiệu cao cịn có nhược điểm định Việc phát triển thuốc phối hợp hiệu quả, an toàn, dễ cung ứng nhu cầu cấp thiết Trong số dẫn xuất artemisinin, artesunat dùng rộng rãi thuốc then chốt điều trị bệnh sốt rét nặng Tuy nhiên, artesunat khó tan nước nên sinh khả dụng không ổn định Do vậy, cần có biện pháp cải thiện độ tan artesunat trước đưa vào dạng bào chế Ở Việt Nam, nguyên liệu artesunat sản xuất quy mơ cơng nghiệp Nhưng quy trình sản xuất có sử dụng xúc tác pyridin, hoá chất độc hại gây nhiễm Nghiên cứu cải tiến quy trình, qua giảm nhiễm độc hại q trình sản xuất việc làm cần thiết Từ thực tế đó, đề tài tiến hành nhằm khắc phục tồn artesunat nhằm phát triển thuốc phối hợp artesunat điều trị bệnh sốt rét Mục tiêu luận án Cải tiến phương pháp bán tổng hợp artesunat nhằm hạn chế độc hại trình sản xuất Cải thiện độ tan artesunat kỹ thuật phân tán rắn Bào chế viên nén phối hợp artesunat - piperaquin Đánh giá độc tính cấp tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét chuột nhắt trắng viên phối hợp artesunatpiperaquin Nội dung luận án Đánh giá khả xúc tác natri bicarbonat cho phản ứng bán tổng hợp artesunat, khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn phản ứng cho hiệu suất cao Chế tạo hệ phân tán rắn (HPTR) artesunat với chất mang β-cyclodextrin Đánh giá số tính chất HPTR thu được: trạng thái vật lý, kích thước tiểu phân, độ tan, tốc độ hồ tan, độ ổn định hoạt tính chống sốt rét Bào chế viên nén phối hợp artesunat-piperaquin: xây dựng công thức phương pháp bào chế, xây dựng tiêu chuẩn phương pháp kiểm tra chất lượng, theo dõi độ ổn định viên phối hợp Xác định độc tính cấp đánh giá hiệu lực chống sốt rét động vật thực nghiệm viên phối hợp bào chế Những đóng góp luận án Bán tổng hợp artesunat đạt tiêu chuẩn DĐVN III phản ứng sử dụng natri bicarbonat/aceton với hiệu suất 89,4% Natri bicarbonat dễ kiếm, rẻ tiền, độc, thay pyridin độc hại gây ô nhiễm Lần nước ứng dụng thành công kỹ thuật phân tán rắn để cải thiện độ tan artesunat HPTR artesunat dễ tan nước, ổn định có hoạt tính chống sốt rét tốt so với artesunat nguyên liệu 3 Xây dựng phương pháp định lượng piperaquin chế phẩm bào chế sắc ký lỏng Phương pháp đơn giản, phù hợp với điều kiện thiết bị có Lần nước giới, viên nén phối hợp artesunat-piperaquin nghiên cứu bào chế đánh giá hiệu lực chống sốt rét Những nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy phối hợp artesunat-piperaquin có triển vọng điều trị bệnh sốt rét Phối hợp có ưu điểm tiện dùng, an tồn, hiệu giá thành hợp lý Cấu trúc luận án Luận án có 135 trang (khơng kể phụ lục tài liệu tham khảo), 47 bảng, 31 hình Bố cục gồm phần: Mở đầu (2 trang); Tổng quan (39 trang); Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu (15 trang); Thực nghiệm kết (53 trang); Bàn luận (23 trang); Kết luận đề xuất (2 trang); Danh mục báo công bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 170 tài liệu tham khảo (15 trang) 11 phụ lục (34 trang) Chương TỔNG QUAN Phần tổng quan trình bày khái quát tình hình kháng thuốc ký sinh trùng (KST) sốt rét, cần thiết phải phối hợp thuốc ưu nhược điểm số thuốc phối hợp có điều trị bệnh sốt rét Tổng quan hai dược chất artesunat piperaquin, biện pháp sử dụng để tăng độ tan độ ổn định artesunat Khái niệm HPTR, thành phần, cấu trúc, phương pháp chế tạo, chế làm tăng độ tan dược chất, biện pháp hạn chế tái kết tinh dược chất phương pháp xác định tính chất HPTR Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, dung mơi, hố chất Các ngun liệu, hóa chất, dung môi, tá dược loại dược dụng tinh khiết phân tích Các dung mơi sắc ký đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC 2.2 Ký sinh trùng động vật thực nghiệm KST sốt rét loài P berghei chủng kháng cloroquin (K70), giữ giống Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Chuột nhắt trắng chủng Swiss, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp 2.3 Thiết bị nghiên cứu Sử dụng thiết bị bào chế, thiết bị phân tích tin cậy Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên - Trung tâm Khoa học tự nhiên Công nghệ Quốc gia, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp bán tổng hợp artesunat – Đánh giá khả xúc tác natri bicarbonat cho phản ứng bán tổng hợp artesunat, so sánh với xúc tác pyridin truyền thống Khảo sát ảnh hưởng yếu tố dung môi, nhiệt độ, tỉ lệ chất tham gia phản ứng đến hiệu suất, mức độ triệt để thời gian phản ứng, từ lựa chọn điều kiện phản ứng thích hợp để có hiệu suất cao – Chứng minh cấu trúc sản phẩm artesunat tổng hợp dựa liệu phổ IR, 1H-NMR, MS – Đánh giá chất lượng sản phẩm artesunat theo DĐVN III 2.4.2 Phương pháp bào chế Chế tạo HPTR artesunat: HPTR artesunat chế tạo phương pháp phun sấy, tiến hành qua bước: Bước 1: chuẩn bị dung dịch artesunat chất mang Hoà tan artesunat ethanol 96% Hoà tan chất mang βcyclodextrin nước 800C, để nguội đến khoảng 400C Phối hợp dung dịch, siêu âm 15 phút Bước 2: phun sấy Tiến hành phun sấy dung dịch máy Büchi Mini Spray Dryer B-191 với thông số thiết bị thích hợp Bào chế viên nén phối hợp artesunat-piperaquin: Tiến hành theo phương pháp dập thẳng: trộn dược chất tá dược, dập viên máy thủ công Unicam máy tâm sai KP2 Viên có hình trụ dẹt, đường kính 12 mm Máy thủ cơng Pye Unicam: cân lượng bột kép cho viên Nạp bột vào cối nén thành viên lực nén xác định Máy tâm sai KP2: cho bột kép vào phễu phân phối hạt Điều chỉnh máy để viên có khối lượng độ cứng theo qui định 2.4.3 Phương pháp kiểm nghiệm Phương pháp đánh giá tính chất HPTR: – Hình dạng, kích thước: hình dạng tiểu phân HPTR xác định kính hiển vi điện tử quét Kích thước tiểu phân xác định với hỗ trợ phần mềm CorelDraw 12 – Khối lượng riêng biểu kiến: dùng máy ERWEKA SVM – Mất khối lượng làm khô: dùng cân xác định hàm ẩm nhanh YMC IB-30 – Tốc độ trơn chảy: đo máy ERWEKA GWF – Độ tan artesunat: hoà tan bão hoà artesunat nước 25 ± 20C Xác định lượng artesunat hoà tan phương pháp sắc ký lỏng Phương pháp đánh giá chất lượng viên nén: – Độ mài mòn: xác định máy ERWEKA TA10 – Lực gây vỡ viên: đo máy ERWEKA TBH20 – Độ rã: xác định máy ERWEKA ZT31 – Độ đồng khối lượng hàm lượng viên: tiến hành theo DĐVN III – Giới hạn tạp chất liên quan: phương pháp sắc ký lớp mỏng, tiến hành theo DĐVN III Phương pháp định lượng: Định lượng artesunat: phương pháp sắc ký lỏng Các điều kiện sắc ký tham khảo từ IP 2003 DĐVN III Định lượng piperaquin phosphat: – Phương pháp đo quang: đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 347 nm (tham khảo CP 2005) – Phương pháp sắc ký lỏng: điều kiện sắc ký sau: Cột sắc ký: Discovery C18, 150 x 4,6 mm, μm Bước sóng phát hiện: 347 nm Thể tích mẫu tiêm: 20 μL Tốc độ dịng: mL/phút Pha động: dung dịch đệm phosphat 0,01M pH 2,7 acetonitril - triethylamin (94:6:1) Phương pháp thử độ hoà tan: Điều kiện hoà tan: Thiết bị: máy cánh khuấy Mơi trường hồ tan: 900 mL nước cất Tốc độ quay: 100 vịng/phút Xác định lượng artesunat hồ tan phương pháp sắc ký lỏng lượng piperaquin phosphat hoà tan phương pháp đo quang Phương pháp đánh giá độ ổn định thuốc: Độ ổn định HPTR artesunat: Mẫu theo dõi đựng ống nghiệm thủy tinh sạch, nút nhựa kín, bảo quản điều kiện nhiệt độ 40 ± 20C, độ ẩm tương đối 75 ± 5%, thời gian theo dõi tháng Các tiêu theo dõi: hàm lượng artesunat, độ hoà tan, trạng thái vật lý Độ ổn định viên nén artesunat-piperaquin: Viên nén phối hợp artesunat-piperaquin sau bào chế đóng gói lọ thuỷ tinh, nắp nhựa kín bảo quản tủ vi khí hậu (nhiệt độ 30 ± 20C, độ ẩm tương đối 75 ± 5%) thời hạn 24 tháng Các tiêu đánh giá: hình thức, hàm lượng, tạp chất liên quan độ hồ tan Tuổi thọ thuốc tính tốn phần mềm STAB FDA Các phương pháp phân tích phổ: Phổ nhiễu xạ tia X: ghi máy D8-Advance với thơng số: góc qt 100 - 500, bước quét 0,0300 Giản đồ nhiệt vi sai: xác định máy DSC-TGA 131 với thông số: tốc độ gia nhiệt 100C/phút, thời gian 30-35 phút Phổ hồng ngoại (IR): ghi máy Perkin Elmer theo kỹ thuật đĩa nén với kali bromid Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): ghi máy AVANCE500-BRUKER Phổ khối lượng (MS): đo máy Agilent 6310 Ion Trap 11 (32 so với 24 giờ) hiệu suất có giảm không đáng kể (88,1% so với 89,4%) 3.1.3 Số liệu phổ chất lượng sản phẩm artesunat – Cấu trúc hoá học artesunat khẳng định liệu phổ IR, 1H-NMR MS – Sản phẩm artesunat kiểm tra chất lượng Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung Ương xác nhận đạt tất tiêu chất lượng theo qui định DĐVN III 3.2 CHẾ TẠO HỆ PHÂN TÁN RẮN CỦA ARTESUNAT 3.2.1 Xây dựng công thức phương pháp chế tạo Chế tạo HPTR theo phương pháp phun sấy với chất mang βcyclodextrin Tiến hành khảo sát công thức với tỉ lệ artesunat/β-cyclodextrin (1:2), (1:4) (1:6) Qua khảo sát, lựa chọn thơng số phun sấy sau: Nhiệt độ khí vào: 800C Nhiệt độ khí ra: 50-600C Lưu lượng khí vào: 700 L/giờ Bơm hút khí thải: maximum (khoảng 35 m3/giờ) Áp suất khí phun: 0,34 MPa Tốc độ phun dịch: 10 mL/phút Sản phẩm HPTR thu có màu trắng, khơ tơi, hiệu suất 75% Q trình phun sấy với điều kiện không làm phân hủy artesunat 3.2.2 Khảo sát số tính chất HPTR artesunat Hình dạng kích thước tiểu phân: Các tiểu phân HPTR có dạng hình cầu rỗng, bề mặt tiểu phân tương đối nhẵn Kích thước tiểu phân phân bố giới hạn hẹp, hầu hết 10 µm, phần lớn μm (hình 3.4) 12 20 µm Hình 3.4 Hình ảnh tiểu phân HPTR artesunat/β-cyclodextrin (1:4) kính hiển vi điện tử qt, độ phóng đại 2000 lần Trạng thái vật lý: Phổ nhiễu xạ tia X giản đồ nhiệt vi sai cho thấy artesunat HPTR với β-cyclodextrin tỉ lệ (1:2) tồn phần lớn dạng vơ định hình Trong HPTR tỉ lệ (1:4) (1:6), artesunat tồn chủ yếu dạng vơ định hình Độ tan: Độ tan nước artesunat xác định 0,41 ± 0,03 mg/mL, HPTR artesunat/β-cyclodextrin (1:4) 2,62 ± 0,04 mg/mL Như độ tan artesunat tăng lên 6,4 lần chế dạng HPTR với β-cyclodextrin Tốc độ hồ tan: Artesunat ngun liệu có tốc độ tan chậm, sau 60 phút tan 75,3% HPTR artesunat/β-cyclodextrin tỉ lệ (1:2) có 90% artesunat hồ tan sau 15 phút HPTR tỉ lệ (1:4) (1:6), artesunat hoà tan gần hồn tồn sau 10 phút (hình 3.8) 13 Phần trăm artesunat hòa tan 120 100 80 60 ASU nguyên liệu 40 ASU/β-CD (1:2) ASU/β-CD (1:4) 20 ASU/β-CD (1:6) 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Hình 3.8 Tốc độ hồ tan artesunat từ HPTR Tóm lại, HPTR artesunat/β-cyclodextrin (1:4) có tỉ lệ dược chất dạng vơ định hình cao hơn, tốc độ hoà tan nhanh so với HPTR tỉ lệ (1:2) không khác biệt đáng kể so với HPTR tỉ lệ (1:6) Do HPTR tỉ lệ (1:4) chọn sử dụng nghiên cứu 3.2.3 Đánh giá độ ổn định HPTR artesunat Theo dõi độ ổn định HPTR artesunat/β-cyclodextrin (1:4) theo phương pháp lão hoá cấp tốc Kết cho thấy HPTR artesunat ổn định sau tháng bảo quản tiêu hàm lượng dược chất, tốc độ hoà tan trạng thái vật lý 3.2.4 Đánh giá hoạt tính chống sốt rét HPTR artesunat HPTR artesunat có tác dụng làm giảm mật độ KST máu nhanh so với artesunat dạng ngun liệu (hình 3.11) Ở nhóm chuột uống artesunat nguyên liệu, mật độ KST giảm 82% sau 48 giờ, sau tăng dần trở lại từ ngày N3 Trong đó, mật độ KST nhóm điều trị HPTR artesunat giảm 72% sau 24 giờ, 97% sau 48 99,7% sau 72 điều trị 14 Số lượng KST/10000 hồng cầu 50 45 40 Nhóm ASU nguyên liệu 35 Nhóm ASU HPTR 30 Nhóm chứng 25 20 15 10 N0 N1 N2 Ngày điều trị N3 N4 Hình 3.11 Diễn biến mật độ KST ngày N0 – N4 3.3 BÀO CHẾ VIÊN NÉN ARTESUNAT-PIPERAQUIN 3.3.1 Sự tương hợp artesunat piperaquin phosphat Sự tương hợp artesunat piperaquin phosphat khảo sát phương pháp: phân tích nhiệt lão hóa cấp tốc Kết chứng minh dược chất tiếp xúc với khơng có tương tác lý hố ảnh hưởng đến độ ổn định Như phối hợp chúng viên 3.3.2 Xây dựng công thức phương pháp bào chế viên nén phối hợp Qua khảo sát máy dập viên thủ công Unicam, lựa chọn công thức phương pháp bào chế viên nén artesunatpiperaquin sau: Công thức bào chế (tính cho viên): HPTR artesunat/β-cyclodextrin (1:4) 230 mg (tương đương 50 mg artesunat) Piperaquin phosphat tetrahydrat 350 mg (tương đương 320 mg piperaquin phosphat khan) Tinh bột mì 60 mg Talc 15 mg Acid stearic 15 mg 15 Với công thức bào chế trên, tiến hành dập viên máy tâm sai KP2 Điều chỉnh máy để viên có khối lượng trung bình khoảng 670 mg lực gây vỡ viên khoảng 60 - 80 N Các mẫu viên thu có số tiêu chất lượng sau: Độ bền học độ rã: Các mẫu viên nén có độ mài mịn 0,5-0,6%, đạt yêu cầu theo USP 28 (không 0,8%) độ rã 7-8 phút, đạt yêu cầu theo DĐVN III (không 15 phút) Độ đồng khối lượng hàm lượng: Độ đồng khối lượng hàm lượng viên đạt qui định theo DĐVN III Độ hoà tan: Các mẫu viên có tỉ lệ dược chất hồ tan sau 30 phút cao đồng mẻ (bảng 3.29) Bảng 3.29 Phần trăm dược chất hoà tan sau 30 phút (n=6) Mẻ Artesunat 92,4 ± 2,2 92,6 ± 2,4 91,2 ± 4,2 Piperaquin 85,7 ± 2,9 86,8 ± 4,4 83,6 ± 2,6 Tóm lại, mẫu viên bào chế với máy dập viên tâm sai đạt tiêu chất lượng chung viên nén theo qui định DĐVN III có độ hồ tan tốt 3.3.3 Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng artesunat piperaquin viên phối hợp Phương pháp định lượng artesunat Định lượng artesunat viên nén đơn thành phần sắc ký lỏng qui định DĐVN III IP 2003 Kết thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu tiêu chuẩn: 16 tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ lặp lại độ đúng, áp dụng để định lượng artesunat viên phối hợp Phương pháp định lượng piperaquin phosphat Phương pháp đo quang: Định lượng piperaquin phosphat viên nén đơn thành phần đo quang qui định CP 2005 Kết thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu tiêu chuẩn: tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ lặp lại độ đúng, áp dụng để định lượng piperaquin phosphat viên phối hợp Phương pháp sắc ký lỏng: Qua khảo sát, nhận thấy với cột pha đảo thông thường với pha động tham khảo từ tài liệu acetonitril - dung dịch kali dihydrophosphat 0,01M (8:92), pic piperaquin ln có tượng kéo đuôi rõ rệt Với điều chỉnh nhỏ thêm vào pha động 1% triethylamin, tượng kéo đuôi giảm rõ rệt, pic nhọn cân xứng Kết thẩm định cho thấy phương pháp định lượng piperaquin phosphat sắc ký lỏng xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ độ lặp lại, áp dụng để định lượng piperaquin phosphat viên phối hợp 3.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định Xây dựng tiêu chuẩn viên nén artesunat-piperaquin Căn vào kết nghiên cứu dựa theo chuyên luận “viên nén artesunat” DĐVN III chuyên luận “viên nén piperaquin” CP 2005, dự thảo tiêu chuẩn viên nén phối hợp đề xuất bảng 3.40 17 Bảng 3.40 Dự thảo tiêu chuẩn viên nén phối hợp Chỉ tiêu Hình thức Độ đồng khối lượng Định tính Độ hồ tan Yêu cầu Viên nén không bao màu vàng, thành cạnh viên lành lặn Độ lệch không 5% so với khối lượng trung bình viên Có pic artesunat sắc đồ HPLC có pic piperaquin phosphat sắc ký lớp mỏng Không 70% lượng artesunat 70% lượng piperaquin phosphat hoà tan sau 30 phút Tạp chất liên quan Phải đạt qui định Hàm lượng Chế phẩm phải chứa 90-110% artesunat 93107% piperaquin phosphat so với lượng ghi nhãn Mẫu viên kiểm tra chất lượng Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung Ương xác nhận đạt chất lượng theo tiêu chuẩn sở đề Theo dõi độ ổn định viên nén artesunat-piperaquin Kết nghiên cứu cho thấy viên nén artesunat-piperaquin ổn định sau 24 tháng bảo quản điều kiện nhiệt độ 30 ± 20C, độ ẩm tương đối 75 ± 5% tiêu: hình thức cảm quan, tạp chất liên quan, độ hoà tan hàm lượng dược chất Với trợ giúp phần mềm STAB, tuổi thọ mẫu viên dự đoán 35 tháng dựa tiêu hàm lượng dược chất 3.4 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VIÊN NÉN ARTESUNAT-PIPERAQUIN 3.4.1 Xác định độc tính cấp Xác định liều gây chết 50% số chuột (LD50) là: LD50 = 1550,5 (1393,9 - 1734,8) mg/kg cân nặng 18 3.4.2 Đánh giá hoạt tính chống sốt rét Hoạt tính chống sốt rét in vivo viên phối hợp artesunatpiperaquin đánh giá chuột nhắt trắng nhiễm P.berghei chủng kháng cloroquin Kết tóm tắt sau: – Artesunat đơn có tác dụng ức chế KST phát triển so với nhóm chứng, khơng diệt hoàn toàn KST – Piperaquin phosphat đơn cho tỉ lệ khỏi bệnh không tái phát 10/30 chuột (33,3%) KST máu hoàn toàn từ ngày thứ sau điều trị, xuất trở lại từ ngày thứ 10 Tổng số chuột tái phát vòng 28 ngày 20/30 chuột (66,7%) – Thuốc phối hợp artesunat-piperaquin có tác dụng diệt KST từ ngày thứ Chỉ có 2/30 chuột (6,7%) tái phát KST vịng 28 ngày, sau chuột khỏi bệnh trở lại Đến ngày 28, tất 30 chuột sống KST (khỏi bệnh 100%) (hình 3.22) 60 2000 50 1500 40 30 1000 % chuột sống Mật độ KST 20 10 10 14 17 21 2500 (297 mg/kg) 60 2000 50 1500 40 1000 20 24 28 % chuột sống Mật độ KST 10 500 0 ngày 100 10 14 17 21 24 28 ngày 200 100 200 60 50 100 40 % chuột sống Mật độ KST 30 50 20 Artesunat-piperaquin 80 % chuột sống 150 70 KST/10000 hồng cầu Piperaquin (512 mg/kg) 80 150 70 (80 mg - 512 mg/kg) 60 100 50 40 % chuột sống Mật độ KST 30 20 KST/10000 hồng cầu 90 90 % chuột sống Artesunat 70 30 500 0 3000 80 % chuột sống 2500 70 90 KST/10000 hồng cầu Không điều trị 80 % chuột sống 3000 3500 100 3500 90 KST/10000 hồng cầu 100 50 10 10 0 10 14 17 21 24 28 ngày 0 10 14 17 21 24 28 Hình 3.22 Hiệu lực điều trị artesunat, piperaquin thuốc phối hợp artesunat-piperaquin ngày 19 Chương BÀN LUẬN 4.1 Phương pháp bán tổng hợp artesunat Nhằm thay pyridin dicloromethan độc hại tổng hợp artesunat, khảo sát nhận thấy phản ứng dùng xúc tác natri bicarbonat/aceton cho hiệu suất tốt (89,4%), không nhiều so với phản ứng dùng pyridin/dicloromethan (91,9%) Phản ứng dùng xúc tác natri bicarbonat/aceton có ưu điểm quan trọng, ngun liệu sử dụng độc, gây nhiễm phương pháp tinh chế đơn giản 4.2 Hệ phân tán rắn artesunat So với biện pháp tăng độ tan khác, kỹ thuật phân tán rắn áp dụng với artesunat, sử dụng phương pháp phun sấy chất mang β-cyclodextrin có số ưu điểm sau: – Khắc phục đồng thời hai nhược điểm artesunat tan ổn định – Sản phẩm phun sấy trơn chảy tốt dễ chịu nén, thích hợp để bào chế viên nén phương pháp dập thẳng Artesunat dạng HPTR có tác dụng làm giảm mật độ KST máu nhanh so với artesunat dạng nguyên liệu thông thường Kết chứng tỏ artesunat dạng HPTR hấp thu qua đường tiêu hóa tốt so với artesunat dạng nguyên liệu ban đầu 4.3 Bào chế viên nén artesunat-piperaquin Công thức phương pháp bào chế Để đảm bảo độ ổn định dược chất, phương pháp dập thẳng áp dụng để bào chế viên nén Hơn nữa, piperaquin phosphat HPTR artesunat có đặc tính trơn chảy dễ chịu nén, thích hợp cho phương pháp dập thẳng 20 Nói chung, cơng thức phương pháp bào chế viên nén phối hợp đơn giản Tá dược sử dụng nguyên liệu thông dụng, đảm bảo viên nén đạt tiêu chất lượng qui định Tuy nhiên, cơng thức qui trình bào chế nghiên cứu qui mơ phịng thí nghiệm Để áp dụng sản xuất, cần thêm khảo sát với máy dập viên công nghiệp qui mô lớn Phương pháp định lượng artesunat piperaquin Phương pháp định lượng artesunat: Để định lượng artesunat viên phối hợp, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng với điều kiện sắc ký tham khảo từ DĐVN III IP 2003 Kết cho thấy thành phần piperaquin phosphat không ảnh hưởng đến q trình phân tích artesunat Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại độ đúng, đạt yêu cầu phương pháp định lượng Phương pháp định lượng piperaquin phosphat: Định lượng piperaquin đo quang phương pháp đơn giản, khơng thích hợp thử nghiệm u cầu tính đặc hiệu cao Vì vậy, chúng tơi tiến hành xây dựng thêm phương pháp định lượng piperaquin sắc ký lỏng Năm 2001, Bruce Sunderland nêu khó khăn phát triển phương pháp phân tích piperaquin sắc ký lỏng: hiệu lực tách hệ số bất đối xứng cao Qua khảo sát nhận thấy với cột pha đảo thơng thường, pic piperaquin ln có tượng kéo đuôi rõ rệt Việc điều chỉnh tỉ lệ dung môi hay pH pha động không cải thiện hệ số bất đối xứng pic 21 Piperaquin base amin, phân cực pH acid, nên bị hấp phụ mạnh bề mặt pha tĩnh, gây nên tượng pic kéo đuôi Có thể khắc phục nhược điểm cách thêm vào pha động base amin cạnh tranh, để chất bị hấp phụ ưu tiên dẫn đến giảm thiểu hấp phụ piperaquin Kết cho thấy thêm vào pha động 1% triethylamin, pic trở nên nhọn cân xứng Dựa sở đó, chúng tơi xây dựng phương pháp định lượng piperaquin sắc ký lỏng Phương pháp đơn giản, sử dụng dung môi thông dụng phù hợp với điều kiện thiết bị có Tiêu chuẩn chất lượng độ ổn định Tiêu chuẩn viên nén phối hợp artesunat-piperaquin xây dựng sở tham khảo chuyên luận “viên nén artesunat” DĐVN III “viên nén piperaquin phosphat” CP 2005 Trong bổ sung tiêu độ hòa tan piperaquin Chỉ tiêu độ hòa tan artesunat điều chỉnh tăng từ 60% lên 70% Định lượng piperaquin phosphat áp dụng phương pháp đo quang, áp dụng phương pháp sắc ký lỏng xây dựng dựa kết nghiên cứu Bằng phương pháp theo dõi dài hạn, chứng minh viên nén artesunat-piperaquin ổn định sau 24 tháng bảo quản Căn vào tốc độ giảm hàm lượng dược chất, tuổi thọ thuốc dự đoán 35 tháng 4.4 Tác dụng sinh học viên phối hợp Độc tính cấp Liều chết trung bình đường uống (LD50) thuốc phối hợp artesunat- piperaquin xác định 1550,5 mg/kg cân nặng chuột, độc so với thuốc thành phần số thuốc 22 chống sốt rét khác (ví dụ LD50 artesunat 1180 mg/kg, piperaquin phosphat 1080 mg/kg, cloroquin 400 mg/kg) So với liều điều trị dự kiến người (8 viên chia liều/đợt điều trị, tương đương 29,6 mg/kg ngày đầu 14,8 mg/kg ngày tiếp theo) LD50 thuốc phối hợp cao gấp 26 lần tổng liều điều trị người Như thuốc phối hợp có số điều trị rộng Hoạt tính chống sốt rét Hoạt tính chống sốt rét thuốc phối hợp đánh giá chuột nhiễm P berghei bước thử nghiệm quan trọng để xác định hiệu lực điều trị thuốc Kết thí nghiệm cho thấy thuốc phối hợp có tác dụng diệt KST máu nhanh có hiệu lực điều trị cao Tuy nghiên cứu tiền lâm sàng ban đầu, cho thấy phối hợp artesunat-piperaquin có triển vọng điều trị bệnh sốt rét Phối hợp có ưu điểm tiện dùng, an toàn, hiệu giá thành hợp lý (khoảng đô la Mỹ cho đợt điều trị), phù hợp với yêu cầu Tổ chức Y tế Thế giới KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận: Về cải tiến phương pháp bán tổng hợp artesunat − Đã bán tổng hợp artesunat đạt tiêu chuẩn DĐVN III phản ứng dùng xúc tác natri bicarbonat dung môi aceton với hiệu suất 89,4% − Natri bicarbonat aceton hóa chất dễ kiếm, rẻ tiền, độc, thay pyridin dicloromethan độc hại gây nhiễm qui trình sản xuất artesunat Ngoài ra, 23 phản ứng dùng xúc tác natri bicarbonat dễ tinh chế so với phản ứng dùng xúc tác pyridin Về hệ phân tán rắn artesunat − Đã chế tạo HPTR artesunat với chất mang βcyclodextrin phương pháp phun sấy Sản phẩm có khả hồ tan tốt thích hợp để sử dụng dạng thuốc viên nén − HPTR artesunat ổn định trạng thái vật lý, hàm lượng khả giải phóng dược chất tháng điều kiện lão hoá cấp tốc (nhiệt độ 40 ± 20C, độ ẩm tương đối 75 ± 5%) − Artesunat dạng HPTR có hoạt tính chống sốt rét tốt so với artesunat nguyên liệu Về bào chế viên nén artesunat-piperaquin − Đã xây dựng công thức bào chế viên nén phối hợp artesunat 50 mg - piperaquin phosphat 320 mg phương pháp dập thẳng qui mơ phịng thí nghiệm − Đã xây dựng thẩm định phương pháp định lượng artesunat sắc ký lỏng, phương pháp định lượng piperaquin đo quang sắc ký lỏng Các phương pháp định lượng ứng dụng để xác định hàm lượng artesunat piperaquin viên phối hợp − Đã xây dựng tiêu chuẩn sở cho viên nén artesunatpiperaquin − Đã bước đầu theo dõi độ ổn định viên nén artesunatpiperaquin Sản phẩm giữ chất lượng sau 24 tháng bảo quản nhiệt độ 30 ± 20C, độ ẩm tương đối 75 ± 5% Tuổi 24 thọ sản phẩm dự đoán 35 tháng dựa tiêu hàm lượng dược chất Về tác dụng sinh học viên nén artesunat-piperaquin − Đã xác định LD50 phối hợp artesunat-piperaquin 1550,5 mg/kg, cao gấp 26 lần tổng liều điều trị dự kiến người Như phối hợp có số điều trị rộng − Phối hợp artesunat-piperaquin có tác dụng nhanh hiệu lực cao chuột nhiễm P berghei chủng kháng cloroquin Với tổng liều 592 mg/kg (80 mg artesunat 512 mg piperaquin phosphat), thuốc phối hợp có tác dụng diệt KST tất chuột thử nghiệm sau ngày điều trị Đến ngày 28, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% Với ưu điểm hiệu lực cao, an toàn, tiện dùng dễ cung ứng, phối hợp artesunat-piperaquin có triển vọng điều trị bệnh sốt rét Đề xuất: Bán tổng hợp artesunat với xúc tác natri bicarbonat qui mô lớn để ứng dụng vào sản xuất Tiếp tục thử nghiệm tiền lâm sàng bệnh nhân, khẳng định tính an tồn hiệu lực điều trị phối hợp artesunat-piperaquin Nghiên cứu hồn thiện qui trình bào chế viên nén artesunatpiperaquin qui mô lớn tiếp tục theo dõi độ ổn định để xác định tuổi thọ thuốc 25 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Đỗ Hữu Nghị, Nguyễn Văn Hân (2007), “Định lượng piperaquin viên nén phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, 18(5), tr 11-13 Đỗ Hữu Nghị, Nguyễn Văn Hân (2008), “Tổng hợp artesunat với xúc tác natri bicarbonat”, Tạp chí dược học, 384, tr 2931 Nguyễn Văn Hân, Đỗ Hữu Nghị, Trần Văn Nam (2008), “Chế tạo hệ phân tán rắn artesunat với β-cyclodextrin phương pháp phun sấy”, Tạp chí dược học, 388, tr 14-17 Nông Thị Tiến, Trương Văn Như, Nguyễn Văn Hân, Đỗ Mạnh Hà, Bùi Thị Sáu (2009), “Đánh giá bước đầu tính an tồn hiệu lực ký sinh trùng sốt rét thực nghiệm artesunat-piperaquin (Asukin)”, Tạp chí phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, 3, tr 7-13 ... 4.3 Bào chế viên nén artesunat- piperaquin Công thức phương pháp bào chế Để đảm bảo độ ổn định dược chất, phương pháp dập thẳng áp dụng để bào chế viên nén Hơn nữa, piperaquin phosphat HPTR artesunat. .. Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp bán tổng hợp artesunat – Đánh giá khả xúc tác natri bicarbonat cho phản ứng bán tổng hợp artesunat, . .. Cải thiện độ tan artesunat kỹ thuật phân tán rắn 2 Bào chế viên nén phối hợp artesunat - piperaquin Đánh giá độc tính cấp tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét chuột nhắt trắng viên phối hợp artesunatpiperaquin