NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Võ Hà Giang 1 , gô Xuân Bình 1 , guyễn Tiến Dũng 1 SUMMARY Study on the effect of sterile reagents and culture mediums in in vitro propagation of Duoi Chon orchid (Rhynchostylis retusa [L.] Blume) Study on the effect of sterile reagents and culture mediums to the seed germination of Duoi Chon orchid showed that: the sterile reagents have strongly effected to sterility of culture sample (seed). Treatment with Clorox 7% in 10 minutes obtained alive samples to 33,3%; Sterized by H 2 O 2 with 10% in 20 minutes obtained the alive samples to 40%; Sterized by Ca (OCL) 2 with 10% in 10 minutes obtained the alive samples to 46,7%; Sterized by burning sample (orchid fruit) with alcohol (96%) within 3 seconds obtained alive samples to 88,9%. The examized culture mediums have obtained rate of seed germination from 6,7% to 66,7%. Suitable culture medium to assist seed germination are 1/2MS, Hyponex and MS. Of which, the medium of 1/2MS obtained highest rate of germination to 66,7% Keywords: Sterility, Duoi Chon orchid, Culture medium, Culture samples, Germination T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 2 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.] Blume) là loài lan rừng rất được ưa chuộng vì hoa đẹp và hương thơm. Hiện nay tại các khu rừng ở Việt Nam, các loài lan rừng bị khai thác quá mức, đang có nguy cơ cạn kiệt, trong đó hai loài lan rừng là Đuôi Chồn và Đai Châu đang được khai thác nhiều cho mục đích thương mại và có nguy cơ mất dần trong tự nhiên. Việc nghiên cứu phát triển các loài lan nêu trên, vừa bảo tồn và có khả năng nhân giống cho mục tiêu thương mại là rất cần thiết. Trong hai loài lan nêu trên, loài lan Đai Châu đã được nghiên cứu nhiều và đã có một số kết quả trong nhân giống in vitro còn loài lan Đuôi Chồn chưa được nghiên cứu nhiều, nhất là các nghiên cứu về nhân giống. Từ thực tế trên, việc nghiên cứu nhân giống lan Đuôi Chồn là rất cần thiết. Phạm vi bài báo trình bày kết quả "Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng và môi trường nuôi cấy trong nhân giống phong lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.] Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào". II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Quả lan Đuôi Chồn độ tuổi khoảng 10-12 tháng được thu hái trong tự nhiên (khu vực Vườn Quốc gia Ba Bể) từ những cây lan khỏe mạnh. Hạt được sử dụng làm mẫu nuôi cấy. 2 Phương pháp nghiên cứu ội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn. Thí nghiệm 1: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Clorox đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và được khử trùng bằng dung dịch Clorox dạng thương phNm (cha 5% Javel). Các công thc thí nghim b trí như sau: CT Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý 1 Không xử lý 4 10% + 5 phút 2 7% + 5 phút 5 10% + 10 phút 3 7% + 10 phút Ghi chú: CT = Công thc. Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l sng (ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu. 1 ại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 3 Thí nghiệm 2: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Qu lan uôi Chn còn nguyên vn ưc thu hái, ra bng dung dch xà phòng 5%, ra sch bng nưc ct nhiu ln, chuyn qu lan qua bình tam giác và kh trùng bng dung dch H 2 O 2  nng  và thi gian theo các công thc như sau: CT Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý 1 Không xử lý 5 5% + 20 phút 2 3% + 10 phút 6 10% + 10 phút 3 3% + 20 phút 7 10% + 20 phút 4 5% + 10 phút Ghi chú: CT = Công thc. Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l sng ca mu (ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu. Thí nghiệm 3: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Calcium hypochloride Ca (OCl) 2 đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Qu lan uôi Chn còn nguyên vn ưc thu hái, ra bng dung dch xà phòng 5%, ra sch bng nưc ct nhiu ln, chuyn qu lan qua bình tam giác và kh trùng bng dung dch Calcium hypochloride dng thương phNm (cha 5% Ca (OCl) 2 ). Các công thc thí nghim b trí như sau: CT Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý 1 Không xử lý 4 10% + 5 phút 2 7% + 5 phút 5 10% + 10 phút 3 7% + 10 phút Ghi chú: CT = Công thc Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l sng (ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng bằng đốt quả đến khả năng vô trùng mẫu nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn) Qu lan uôi Chn còn nguyên vn ưc ra sch bng nưc ct nhiu ln, lau khô qu, tin hành t qu bng cách nhúng ngp qu vào dung dch cn 96%, ưa qu ra khi dung dch cn và t qu  cn cháy  thi gian theo các công thc sau: CT1: (/C): Không t; CT2: t trong 3 giây; CT3: t trong 5 giây; CT4: t trong 10 giây; CT5: t trong 15 giây. Sau 10 ngày nuôi cy, tin hành theo dõi các ch tiêu: T l mu b nhim, t l sng (ch tính nhng mu sng và không b nhim), t l cht ca mu. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 4  ni dung 1 (cho c 4 thí nghim), các thí nghim ưc b trí ngu nhiên 3 ln nhc li, mi ln nhc li gm 15 bình nuôi cy (loi 250 ml), mi bình nuôi cy ưc tính là mt mu, trung bình lưng ht ca mt qu lan ưc gieo u cho 3 bình. ội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt phong lan Đuôi Chồn trong nhân giống in vitro. Quả lan sau khi khử trùng được chuyển vào đĩa peptri. Dùng dao tách bỏ vỏ quả và lấy hạt gieo trong bình nuôi cấy (250 ml) đã chuNn b sn môi trưng khác nhau, trung bình theo công thc thí nghim. Ht thu t mt qu lan uôi Chn ưc chia u và nuôi cy trên 3-4 bình. Thí nghim ưc b trí ngu nhiên 3 ln nhc li, mi ln nhc li gm 10 bình nuôi cy (loi 250 ml), mi bình cy ưc tính là mt mu. Sau 12 tun tin hành theo dõi s bình ny mm, t l ny mm. Thí nghiệm 5: ghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi Chồn. Thí nghim b trí vi 5 công thc (CT): CT1: 1/2 MS; CT2: MS; CT3: VW; CT4; N 6; CT5: Hyponex.  các công thc, trong 1 lít môi trưng b sung: ưng 30 g + nưc da 120 ml + than hot tính 2 g + agar 6,5 g. III. KT QU VÀ THO LUN 1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn Kt qu nghiên cu nh hưng ca hóa cht kh trùng Clorox n t l sng ca mu ht nuôi cy (ht phong lan uôi Chn) ưc th hin  bng 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng Clorox đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT Số bình nuôi Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) 1 45 100,0 0,0 0,0 2 45 66,7 20,0 * 13,3 3 45 46,7 33,3 * 20,0 4 45 42,2 24,5 * 33,3 5 45 37,8 13,3 * 48,9 LSD 0,05 5,1 3,6 3,6 CV% 8,5 * Sai khác có ý nghĩa. Công thc 1 (i chng không x lý) sau 10 ngày t l các bình nuôi cy b nhim là 100%.  các công thc còn li, khi qu lan ưc kh trùng bng dung dch nưc Clorox nng  7% và 10% trong thi gian khác nhau (5 phút, 10 phút) t l ht lan b nhim gim so vi khi không x lý (CT1). Tuy nhiên thi gian x lý và nng  càng cao thì t l ht nhim gim nhưng t l ht cht tăng. Hiu qu kh trùng qu lan tt T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5 nht khi s dng Clorox nng  7% trong 10 phút (CT3), t l ht sng và không nhim t 33,3% ( tin cy 95%). Kt qu  bng 2 cho thy thi gian và nng  x lý H 2 O 2 nh hưng n hiu qu kh trùng qu lan uôi Chn. Bảng 2. Kết quả nghiên cứu khử trùng bằng H 2 O 2 đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT Số bình nuôi cấy Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) 1 45 100,0 0,0 0,0 2 45 93,3 6,7 * 0,0 3 45 80,0 13,3 * 6,7 4 45 66,7 20,0 * 13,3 5 45 53,3 26,7 * 20,0 6 45 42,2 31,1 * 26,7 7 45 28,9 40,0 * 31,1 LSD 0,05 3,9 2,7 2,7 CV% 9,6 *S sai khác có ý nghĩa. Công thc 1 (/c) sau 10 ngày t l các bình nuôi cy b nhim là 100%.  các công thc còn li, khi qu lan ưc kh trùng bng nưc H 2 O 2  nng  3%, 5% và 10% trong thi gian khác nhau (10 phút và 20 phút) t l ht lan b nhim gim dn. Tuy nhiên thi gian và nng  x lý càng cao thì t l ht nhim gim và t l ht cht tăng không áng k. Do qu lan v qu dày nên khi x lý  các nng  và thi gian như trên thì mu cht do hoá cht không áng k mà ch yu cht do b tp nhim. Bảng 3. Kết quả nghiên cứu khử trùng của Ca (OCl) 2 đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT Số bình nuôi Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) 1 45 100,0 0,0 0,0 2 45 62,2 17,8 * 20,0 3 45 40,0 33,3 * 26,7 4 45 28,9 40,0 * 31,1 5 45 20,0 46,7 * 33,3 LSD 0,05 5,1 3,6 3,6 CV% 7,2 * Sai khác có ý nghĩa. Kt qu  bng 3 cho thy, thi gian và nng  x lý Ca (OCl) 2 nh hưng n hiu qu kh trùng qu lan uôi Chn. Công thc 1 sau 10 ngày t l các bình nuôi cy b nhim là 100%.  các công thc còn li, khi qu lan ưc kh trùng bng dung dch Ca (OCl) 2  nng  7% và 10% trong thi gian khác nhau (5 phút, 10 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 phút) t l ht lan b nhim gim dn. Không x lý (CT1: /c) t l nhim rt cao. Tuy nhiên thi gian và nng  x lý tăng thì t l ht nhim gim. Bảng 4. Kết quả khử trùng bằng phương pháp đốt cồn (sau 10 ngày nuôi cấy) CT Số bình nuôi (bình) Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%) 1 45 100,0 0,0 0,0 2 45 2,2 88,9 * 8,9 3 45 0,0 64,4 * 35,6 4 45 0,0 44,4 * 55,6 5 45 0,0 0,0 ns 100,0 LSD 0,05 3,1 5,4 5,4 CV% 8,4 ns: Sai khác không có ý nghĩa; * Sai khác có ý nghĩa. Kt qu bng 4 cho thy, kh trùng qu lan uôi Chn bng phương pháp nhúng qu vào dung dch cn 96% ri ly ra t nhanh trên ngn la èn cn cho hiu qu cao hơn so vi phương pháp kh trùng bng hóa cht. Tuy nhiên nu t qu quá lâu s nh hưng n sc sng và kh năng ny mm ca ht.  công thc 3 khi qu lan ưc t nhanh trên ngn la èn cn trong thi gian 5 giây cho t l ht lan sng và không b nhim t 64,4%, nhưng ht lan b nh hưng do nhit t nóng (35,6% mu b cht). Khi t nhanh qu lan trên ngn la èn cn trong thi gian 3 giây (CT2) hiu qu kh trùng khá cao (88,9% mu sng không b nhim) ht lan b nh hưng do nhit t nóng không áng k (8,9%). Công thc 4, khi tăng thi gian t lên 10 giây t l mu b cht tăng lên áng k (55,6% mu b cht), tăng 7 ln so vi CT2. Công thc 5, khi tăng thi gian t lên 15 giây t l cht là 100%. Như vậy khi khử trùng bằng đốt quả lan Đuôi Chồn, CT2 (nhúng cồn và đốt trong 3 giây) cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống không bị nhiễm là 88,9% (độ tin cậy 95%). Từ các kết quả thu được ở bảng 1, 2, 3 và bảng 4 cho thấy, khi khử trùng riêng rẽ các dung dịch đều cho kết quả khử trùng tương đối tốt. Khử trùng bằng phương pháp đốt cồn 96 0 trong thời gian 3 giây cho hiệu quả khử trùng tốt nhất. 2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi Chồn (sau 12 tuần nuôi cấy) Bảng 5. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi Chồn (sau 12 tuần nuôi cấy) CT Môi trường Số bình nuôi cấy Số bình có hạt nảy mầm Tỷ lệ nảy mầm (%) 1 1/2MS 30 20 66,7 2 MS 30 15 50,0 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 3 VW 30 10 33,3 4 N6 30 2 6,7 5 Hyponex 30 11 53,3 LSD 0,05 9,3 CV% 11,2 Kt qu thí nghim  bng 5 cho thy:  CT1 (1/2 MS) t l ht lan ny mm t 66,7%, t l ny mm gim dn theo th t các môi trưng sau: Môi trưng Hyponex (CT5) t 53,3%, môi trưng MS (CT2) t 50,0%, môi trưng VW (CT3) t 33,3%, môi trường N6 đạt giá trị thấp nhất (6,7%). Môi trường 1/2MS có tỷ lệ hạt lan nảy mầm cao nhất (66,7%) ở mức độ tin cậy 95%. Nhân giống in vitro cây phong lan nói chung có th s dng nhiu loi mu khác nhau như: Mu lá, nh sinh trưng, chi cung hoa [1],[2],[6]. Các loi lan công nghip (H ip, a Lan, Vanda ) khi nhân ging có th s dng mu khác nhau tùy vào iu kin, môi trưng và mc ích nhân ging [3]. Tuy nhiên, vi các loi lan rng như ai Châu, uôi Chn, vic nhân ging t ht có ý nghĩa quan trng, các thí nghim nhân ging in vitro t mu lá  cây lan uôi Chn cho kt qu chưa kh quan. Vì vy, ngun ht phong lan có th là mu nuôi cy rt cn ưc quan tâm nghiên cu. Trong t nhiên ht lan thưng rt khó ny mm vì ht không cha abumin và mt phôi chưa phân hóa; ht lan rt nh không d tr hoc d tr rt ít dinh dưng;  ny mm ưc ht lan phi cng sinh vi nm [5]. T l ht lan ny mm trong t nhiên ch vào khong 1-2% [5]. Qu và ht phong lan có th ưc hình thành qua quá trình t th và có th s dng làm mu nhân ging in vitro. Năm 1992 Knudson cho rằng có thể trợ giúp hạt phong lan nảy mầm trên môi trường nhân tạo có bổ sung nguồn dinh dưỡng khoáng và đường mà không cần sự có mặt của nấm. Có nhiều loại môi trường sử dụng để nảy mầm hạt các loài phong lan khác nhau [5], [6]. Tuy nhiên, đối với môi trường nuôi cấy hạt lan Đuôi Chồn, cho đến nay, chưa có các nghiên cứu cụ thể. Kết quả nội dung 2 cho thấy: có thể sử dụng môi trường 1/2MS và Hyponex và MS trong nuôi cấy hạt phong lan Đuôi Chồn. Mẫu hạt nảy mầm được tiếp tục nuôi cấy để phát triển thành cây hoàn chỉnh, hiện nay nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ mẫu hạt phong lan Đuôi Chồn đã nảy mầm trong thí nghiệm nêu trên. IV. KẾT LUẬN Phương pháp khử trùng quả lan Đuôi Chồn để sử dụng hạt làm mẫu nuôi cấy trong nhân giống in vitro có hiệu quả tương đối tốt là các phương pháp: Xử lý quả với Clorox nồng độ 7% trong 10 phút (tỷ lệ hạt sống và không nhiễm đạt 33,3%); khử trùng bằng nước H 2 O 2 nồng độ 10% trong 20 phút (tỷ lệ hạt sống và không nhiễm đạt 40,0%); khử T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 trùng bằng dịch Ca(OCl) 2 nồng độ 10% trong 10 phút (tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm đạt 46,7%); khử trùng bằng phương pháp nhúng cồn và đốt nhanh cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ mẫu sống không bị nhiễm đạt 88,9%. Các môi trường này nuôi cấy, hạt nảy mầm đạt tỷ lệ từ 6,7% đến 66,7%. Môi trường phù hp giúp cho ht nNy mm là môi trưng 1/2MS và Hyponex hoc MS, Trong ó môi trưng 1/2 MS cho t l mu ny mm t giá tr cao nht (66,7%). TÀI LIU THAM KHO 1 guyễn Công ghiệp, 1998. Trng hoa lan, N XB. Tr TP. H Chí Minh. 2 Hội Lan Hà ội, 2005. S tay ngưi trng lan, N XB. N N Hà N i. 3 Arditti, 1982. Orchild Biology. Reviews and perspective II. Cornell Univ. Press, Ithaca: 1-310. 4 Bermard, 1999. Introduction of some orchid species. Ann. Sci. Bot.9: 1-196. 5 Knudson, 1992. Use of seed for orchid propagation in vitro. Bot. Gaz.73: 1-25. 6 R.L.M. Pierik, 1987. In vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff Publishers. gười phản biện: TS. Trịnh Khắc Quang . NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA HÓA CHẤT KHỬ TRÙNG VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Võ Hà Giang 1 , gô Xuân. quả " ;Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng và môi trường nuôi cấy trong nhân giống phong lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.] Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào& quot; mẫu nuôi cấy. 2 Phương pháp nghiên cứu ội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn. Thí nghiệm 1: ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng