TCNCYH 28 (2) - 2004 116 Activation-Induced Cytidine deaminase (AID) - phát minh mới về cơ chế phân tử của quá trình tổng hợp kháng thể TS. Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa-Hóa sinh - Trờng Đại học Y Hà Nội Giới thiệu chung Một trong những bt ng của sự kiện hoàn tất bản đồ gen ngời là bộ gen ngời chỉ chứa đựng khoảng 30.000 gen và điều đặc biệt là con số này chỉ gấp đôi so với số gen của ruồi dấm và côn trùng [1]. Với một lợng gen nhỏ nh vậy rất khó lý giải cho các quá trình sinh học tinh vi của loài ngời, đặc biệt là hoạt động của hệ thần kinh và hệ miễn dịch. Một lời giải thích có sức thuyết phục hơn cả cho mối tơng quan giữa số lợng gen với các quá trình sinh học tinh tế và phức tạp của con ngời là: Sự biến đổi các thông tin di truyền diễn ra ngay sau khi con ngời đợc sinh. Điều này có nghĩa rằng bộ gen ngời không phải là bất biến mà nó tơng tự nh một bức tranh sinh động của cuộc sống luôn biến đổi [2]. Tại hệ miễn dịch, một loạt biến đổi về thông tin di truyền đợc diễn ra trong suốt quá trình biệt hóa của các tế bào lympho. Quá trình tạo kháng thể bao gồm hai giai đoạn kế tiếp nhau. Giai đoạn một là giai đoạn không phụ thuộc kháng nguyên và tế bào lympho T. Giai đoạn này xảy ra ở gan bào thai và tủy xơng, đợc lập trình và điều hòa một cách nghiêm ngặt bởi các cytokine. Trong quá trình này tế bào lympho B non sắp xếp các gen của immunoglobulin bao gồm gen V (variable gene), gen D (diversity gene) và gen J (joining gene) để tạo ra tổ hợp VDJ gen liên kết với vùng gen không biến đổi Cà. Cũng chính từ đây tổ hợp gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp IgM đã đợc thiết lập. Giai đoạn hai là giai đoạn phụ thuộc kháng nguyên và tế bào lympho T. Quá trình này xảy ra ở tổ chức lympho ngoại vi. Sau khi tiếp xúc với kháng nguyên, tế bào lympho B phân chia để hình thành cấu trúc lympho ngoại vi đặc biệt (germinal center). Chính tại siêu cấu trúc này, hai quá trình biến đổi của gen immonoglobulin đã xảy ra bao gồm: 1) Quá trình tái t hp gen (class switch recombination vit tt là CSR) và quá trình siêu t bin (somatic hypermutation vit tt là SHM). CSR thay thế gen C H của immunoglobulin tổng hợp IgM (Cà) bằng các gen C, C hoặc C (là các gen quy nh tng hp IgG, IgE và IgA) để chuyển quá trình tổng hợp IgM sang tổng hợp IgG, IgE hoặc IgA mà không thay đổi tính đặc hiệu kháng nguyên. SMH xảy ra trên gen V của chuỗi nặng (H chain) và chuỗi nhẹ (L chain). Quá trình này tạo ra các đột biến điểm với số lợng cao đến hàng triệu lần so với bình thờng. Quá trình đột biến một cách chọn lọc này đã tạo ra một thế hệ kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên. Do vậy CSR và SHM tạo ra các sản phẩm hoàn toàn khác hẳn nhau, từ các cơ chất là ADN cũng khác hẳn nhau. Chính vì vậy CSR và SHM đợc coi là hai quá trình có cơ chế phân tử hoàn toàn khác biệt. Tuy nhiên sự phát hiện ra activation-induced cytidine deaminase (AID), enzyme xúc tác s loi b gốc amine ca cytidine bởi nhóm nghiên cứu của Honjo, T. (1999) đã xóa bỏ hoàn toàn quan niệm này. Cho đến nay AID đợc coi là cầu nối duy nhất giữa CSR và SHM. AID, phát minh mới trong miễn dịch học 1. Quá trình phát hiện ra AID Bằng kỹ thuật thiết lập th viện ADN b sung (cDNA library) để phân tích và so sánh sự khác biệt giữa các gen của dòng tế bào lympho CH12F3-2 trớc và sau khi kích thích bởi các cytokine TGF-, IL-4 và CD40L (nhằm tạo ra quá trình CSR), nhóm nghiên cứu của TCNCYH 28 (2) - 2004 Honjo, T. đã phát hiện ra AID [3]. Lợng ARN thông tin (mARN) của AID trong tế bào CH12F3-2 có CSR cao gấp 10 lần so với các tế bào không có CSR. Gen AID có chiều dài 1,2-kb mã hóa 198 amino acid với trọng lợng phân tử khoảng 24 kDa. Gen AID của ngời và chuột giống nhau đến 98%, nằm ở vị trí 12p13 trên nhiễm sắc thể và điều đặc biệt là chúng giống gen APOBEC-1 của chuột đến 30% trong đó trung tâm hoạt động (deaminase motif) của ba gen trên hầu nh giống nhau hoàn toàn. Dựa trên cơ sở này các nhà khoa học đã xác định AID có hoạt tính deaminase để chuyển C (cytosine) thành U (uridine) trong cấu trúc điển hình WRCY (R=G hoặc A, Y=T hoặc C, W=A hoặc T) [3]. Từ đây một giả thuyết cho cơ chế hoạt động của AID đã đợc đề xuất trong đó AID tác dụng trực tiếp vào các mRNA bằng chính hoạt tính deaminase của mình, mà các mRNA đó thì mã hóa các protein enzyme xúc tác cho các quá trình CSR và SHM [2]. 117 Hình 1. Quá trình tái tổ hợp các gen trên chuỗi nặng của immunoglobulin. Vị trí các gen trên chuỗi nặng của immunoglobulin chuột bao gồm: hình ô vuông và hình bầu dục là exons và vùng gen công tắc (S). Quá trình tổ hợp các gen V, D và J xảy ra ở tủy xơng trong khi SHM và CSR xảy ra ở các tổ chức lympho ngoại vi. Quá trình tổ hợp các gen V, D và J đã chọn lựa mỗi loại chỉ một gen để tạo ra một gen tổ hợp (V) cho tế bào lympho B. SHM tạo ra các đột biến trên gen tố hợp V nhằm tạo ra dòng tế bào lympho B có khả năng tạo ra kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên. CSR tái tổ hợp gen V với các gen C khác nhau bằng cách cắt bỏ các gen nằm giữa hai gen công tắc (S). ADN cắt bỏ tạo thành AND vòng. 2. Giả thiết về cơ chế hoạt động của AID trong quá trình tái tổ hợp gen immunoglobulin AID đợc đánh giá là lĩnh vực nóng bỏng nhất trong các ngành Y Sinh học trong vòng ba năm trở lại đây. Tính từ khi đợc phát hiện vào năm 1999 đến nay trên thế giới đã có trên 150 công To hop gen VDJ n R) dot bien cho loc (SHM) ta'i to hop gen (CS san pham trung gian gen V dot bien ADN vo`ng tu do S S S S S S V H D J H C à C C 3 C 1 C 2b C 2aC C S Tuy xuongTo c h u c l y m pho ng Ty xng san pham gen sau ta'i to hop T hp gen VDJ oai vi Sn phm gen sau tỏi t hp ADN vũng t do t bin chn lc (SHM) Tỏi t hp gen (CSR) T chc lympho ngoi vi Sn phm trung gian Gen V t bin TCNCYH 28 (2) - 2004 118 trình khoa học liên quan đến AID đã đợc công bố trên các tạp chí khoa học nổi tiếng nhất. Các nhà khoa học đang cố gắng tìm ra cơ chế phân tử của AID trong việc điều hòa hai quá trình CSR và SHM đồng thời tìm hiểu nguồn gốc và cơ chế của một số bệnh miễn dịch bẩm sinh liên quan đến AID để từ đó nghiên cứu ứng dụng trong điều trị. Hiện nay có hai giả thuyết về cơ chế hoạt động của AID. Honjo, T. và cộng sự cho rằng AID đóng vai trò nh APOBEC-1, trong đó AID tác động trực tiếp lên các mRNA mà các mARN này mã hóa tổng hợp các protein enzyme xúc tác hai quá trình CSR và SHM [2, 4, 7]. Một số nhóm khác lại chứng minh rằng AID tấn công trực tiếp lên ADN bằng hoạt tính deaminase để chuyển C thành U tại vùng gen S (switch gene), tại điểm này chuỗi ADN bị bẻ gẫy và sau đó nhờ hệ thống enzyme sửa chữa (N.H.E.J.) để nối lại hai đầu gen tự do [5, 6]. Các nhóm đều đa ra các bằng chứng thuyết phục để chứng minh cho giả thuyết của mình. Tuy nhiên có một điểm chung mà cả hai giả thuyết đều khẳng định là vai trò quyết định của AID trong CSR và SHM thông qua hoạt tính deaminase. 3. Đột biến gen AID gây hội chứng tăng IgM bẩm sinh trên ngời Vai trò của AID trong hội chứng tăng IgM bẩm sinh type 2 ở ngời lần đầu tiên đợc công bố bởi công trình nghiên cứu phối hợp giữa nhóm nghiên cứu của Honjo, T và các cộng sự ngời Pháp. Các dạng đột biến của gen AID bẩm sinh bao gồm các đột biến điểm, cắt hoặc thêm đoạn nucleotide. Các bệnh nhân này đều nhập viện với các triệu chứng lâm sàng của nhiễm trùng kéo dài nh viêm phổi, ỉa chảy. Xét nghiệm máu của các bệnh nhân này thấy lợng IgM tăng cao hàng chục, hàng trăm lần so với bình thờng trong khi nồng độ IgA, IgE và IgG lại rất thấp, thậm chí không phát hiện đợc. SHM của gen immunoglobulin giảm đáng kể hoặc không có. Kết quả giải phẫu bệnh cho thấy lách to, các hạch lympho phì đại và không có cấu trúc lympho siêu vi. Tạ Thành Văn và cộng sự đã đa các gen AID đột biến này vào hệ retrovirus vector sau đó gây nhiễm vào tế bào lympho B của chuột nhắt đã bị loại bỏ gen AID (AID knock out mice) và dòng tế bào sợi NIH3T3 mang gen cơ chất cho SHM (mutated GFP gene) để nghiên cứu quá trình CSR và SHM in vitro [7]. Kết quả cho thấy đại đa số các gen AID đột biến mất cả hai hoạt tính CSR và SHM. Tuy nhiên gen AID đột biến tại 17 acid amin đầu C tận vẫn duy trì hoạt tính SHM trong đó CSR hoàn toàn bị loại bỏ [7, 8]. Sử dụng kỹ thuật tủa miễn dịch (immuno- precipitation) kết hợp với Western blot, tác giả đã đa ra bằng chứng khẳng định thể hoạt động của AID là dimer hoặc multimer. Bằng siêu ly tâm phân tích sử dụng dòng tế bào NIH3T3 chuột tổng hợp AID của ngời đợc kết hợp với một phần của estrogen receptor (ER) trong đó quá trình tổng hợp và hoạt hóa AID-ER đợc điều hòa bởi tetracycline promoter và 4-hydroxytamoxifen thông qua estrogen receptor, Tạ Thành Văn và cộng sự lần đầu tiên đã chứng minh thể hoạt động của AID là một phức hợp có trọng lợng phân tử rất lớn (3000 kDa) mà trong thành phần có mRNA và HS 90 (heat shock protein 90) các co-factor và các protein khác. Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu cơ chế hoạt động phân tử của AID. 4. Hớng nghiên cứu hiện nay về AID và triển vọng Sự phát minh ra AID thực sự đã tạo ra một bớc đột phá trong miễn dịch học. AID đóng vai trò nh là một enzyme chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp các kháng thể. Do vậy việc nghiên cứu tìm ra cơ chế điều hoà hoạt động của AID, thông qua đó điều hoà quá trình tổng hợp các kháng thể sẽ đem lại một ích lợi vô cùng lớn trong Y học. Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới đang đi sâu nghiên cứu nhằm tìm ra: - Cơ chế hoạt động phân tử của AID, cụ thể nghiên cứu xác định cơ chất mà AID xúc tác là ADN hay ARN. - Co-factor tham gia vào quá trình xúc tác của AID. TCNCYH 28 (2) - 2004 119 - Liệu pháp điều trị gen cho các bệnh nhân đột biến AID (hội chứng tăng IgM bẩm sinh type 2). - Thể bất hoạt của AID (dominant negative form) có tác dụng ức chế AID in vivo thông qua đó ức chế quá trình sinh tổng hợp từng dòng kháng thể khác nhau. iu ny cú th a n vic nghiờn cu ứng dụng trong lâm sàng (ví dụ ức chế sự tổng hợp IgE trong điều trị các bệnh dị ứng). Tài liệu tham khảo 1. Venter, J. C., Adams, M. D., Myers, E. W. et al. The sequence of the human genome. Science 291, 1304-1351, (2001). 2. Honjo, T., Kinoshita, K., Muramatsu, M. Molecular mechanism of class switch recombination: linkage with somatic hypermutation. Ann. Rev. Immunol. 20, 165- 196 (2002). 3. Muramatsu, M., Sankaranand, V. S., Anant, S. et al. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999). 4. Doi, T., Kinoshita, K., Ikegawa, M., Muramatsu, M. & Honjo, T. De novo protein synthesis is required for the activation- induced cytidine deaminase function in class- switch recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2634-2638 (2003).Petersen-Mahrt, S. K., Harris, R. S. & Neuberger, M. S. AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature 418, 99-103 (2002). 5. Dickerson, S. K., Market, E., Besmer, E. & Papavasiliou, F. N. AID mediates hypermutation by deaminating single stranded DNA. J. Exp. Med.197, 1291-1296 (2003). 6. Van-Thanh, T., Nagaoka, H., Honjo, T. et al. AID mutant analyses imply requirement of class switch specific cofactor(s). Nature Immunology 4, 843-848 (2003). 7. Van-Thanh, Ta and Honjo, T. Response to Domain organization of activation-induced cytidine deaminase. Nature Immunology 4 (12), 1154 (2003). (Bi vit c thc hin ti B mụn Húa Y hc v Sinh hc phõn t, Khoa Y, Trng i hc Kyoto, Nht Bn). Summary Activation-Induced Cytidine deaminase (AID) - a new discovery of molecular mechanism for immunoglobulin synthesis The immune system takes advantage of genetic alteration to amplify its diversity. During early states of T and B lymphocyte differentiation, V(D)J recombination takes place to assemble variable (V), diversity (D) and joining (J) segments of the V exon of the T cells receptor and immunoglobulin gene. In the later states, antigen stimulation of mature IgM B lymphocytes induces two additional genetic alteration events, namely class switch recombination (CSR) and somatic hypermutation (SHM) in which activation-induced cytidine deaminase (AID) has been known to be essential. Human AID gene is mapped to chromosome 12p13 and encodes 198 amino acids. AID deficiency causes the hyper-IgM syndrome (HIGM2) characterized by normal or elevated serum IgM levels with absence of IgG, IgA and IgE. Studies on AID mutations in HIGM2 syndrome have revealed that loss-of-function mutations are scattered in the entire 198 residues. The mutations of the C-terminal domain of human AID resulted in loss-of-function of CSR, but retained SHM and E-coli mutagenesis activities. In TCNCYH 28 (2) - 2004 120 addition, active AID forms multimer and huge complex including target mRNA, co-factors and some other proteins. . TCNCYH 28 (2) - 2004 116 Activation-Induced Cytidine deaminase (AID) - phát minh mới về cơ chế phân tử của quá trình tổng hợp kháng thể TS. Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa-Hóa sinh - Trờng Đại. chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp các kháng thể. Do vậy việc nghiên cứu tìm ra cơ chế điều hoà hoạt động của AID, thông qua đó điều hoà quá trình tổng hợp các kháng thể sẽ đem lại một. - Cơ chế hoạt động phân tử của AID, cụ thể nghiên cứu xác định cơ chất mà AID xúc tác là ADN hay ARN. - Co-factor tham gia vào quá trình xúc tác của AID. TCNCYH 28 (2) - 2004 119 -