TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh Phạm Trí Tuệ, Phạm Văn Thân, Trơng Thị Kim Phợng, Phạm Ngọc Minh, Lê Thị Tuyết Khanh, Cao Vân Huyền Bộ môn Ký sinh trùng, Trờng Đại học Y Hà Nội Đáp ứng yêu cầu nuôi giữ dài ngày một số chủng đơn bào phục vụ nghiên cứu và giảng dạy, chúng tôi đã tiến hành đề tài này và có một số nhận xét sau: 1. Môi trờng Palova có thể sử dụng tốt để nuôi giữ E. histolytica và một số loại đơn bào khác nh: E. gingivalis, Acanthamoeba, T. vaginalis. Những yếu tố đảm bảo cho sự phát triển tốt của đơn bào trong nuôi cấy là: nhiệt độ, tỷ lệ huyết thanh ngựa, pH của môi trờng và lợng tinh bột gạo. 2. Quy trình nuôi cấy - Nhiệt độ nuôi cấy luôn giữ ổn định ở 37 0 C. - Đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy. - Môi trờng nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của đơn bào: + Tỷ lệ huyết thanh ngựa: 10%. + pH của môi trờng nuôi cấy: 6 - 6,5. + Lợng tinh bột gạo: 5mg/1 ống nuôi cấy. - Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trờng có nhiều đơn bào nhất. - Thời gian cấy truyền tốt nhất là ngày đơn bào có mật độ cao nhất và hoạt động khỏe. Với nuôi cấy amíp: + Ngày thứ 2 (3 lần cấy đầu). + Ngày thứ 3 (các lần cấy sau). - Với quy trình này (tính đến tháng 7 năm 2004), chúng tôi đã nuôi giữ đợc 12 mẫu đơn bào thuộc các giống: Entamoeba, Acanthamoeba và Trichomonas với thời gian từ 6 đến 24 tháng và hiện vẫn đang phát triển tốt. i. Đặt vấn đề Vấn đề nuôi cấy amíp trong phòng thí nghiệm đã đợc chú ý từ lâu. Đến năm 1918 hai tác giả là Boeck và Drbohlav đã tìm ra môi trờng để nuôi cấy amíp gây bệnh Entamoeba histolytica. ở Việt Nam trong những năm trớc đây cũng đã có một số cơ sở trong đó có Bộ môn Ký sinh trùng Trờng Đại học Y Hà Nội đã nghiên cứu nuôi cấy E. histolytica bằng môi trờng Palova và thu đợc những kết quả nhất định. Tuy nhiên việc nuôi cấy rất khó khăn do thể hoạt động của amíp rất dễ chết nên vẫn cha nuôi cấy đợc dài ngày [1]. Để đáp ứng những yêu cầu cần thiết phải nuôi giữ dài ngày các chủng đơn bào ký sinh, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh nhằm các mục tiêu sau: 1. Xác định một số yếu tố chủ yếu ảnh hởng đến nuôi cấy đơn bào. 2. Xây dựng qui trình nuôi cấy đơn bào thờng qui áp dụng trong Labo để giữ các chủng đơn bào nuôi cấy dài ngày. ii. đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng 1.1. Quy trình nuôi cấy Tiến hành nghiên cứu theo quy trình của Baillenger J trên môi trờng Palova [3]. 61 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 1.2. Các chủng đơn bào nghiên cứu - E. histolytica phân lập từ: phân bệnh nhân có hội chứng lỵ, tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. Chúng tôi đã phân lập đợc 4 mẫu bệnh phẩm có E. histolytica, ký hiệu là H1, H2, H3, H4. Mẫu H2 đã làm phản ứng PCR với gen mồi là E. histolytica và cho kết quả dơng tính. - E. gingivalis: bốn mẫu bệnh phẩm có E. gingivalis đợc phân lập từ bựa răng của những bệnh nhân viêm quanh răng, ký hiệu là G1, G2, G3 và G4. - Acanthamoeba: hai mẫu bệnh phẩm có Acanthamoeba phân lập từ mảnh giác mạc của bệnh nhân bị viêm loét giác mạc, ký hiệu là M1 và M2 (Bệnh viện Mắt trung ơng gửi đến). - Trichomonas vaginalis: bốn mẫu bệnh phẩm có T. vaginalis phân lập từ dịch nhầy âm đạo của bệnh nhân viêm âm hộ - âm đạo, ký hiệu là V1, V2, V3 và V4. 2. Vật liệu nghiên cứu 2.1. Môi trờng nuôi cấy Palova Là loại môi trờng lỏng, rẻ tiền, dễ pha chế đã đợc sử dụng từ lâu gồm: - NaCl: 4,25g; Na 2 HPO4: 0,30g; H 2 PO4: 0,23g; Nớc cất: 500ml. 2.2. Huyết thanh động vật cho môi trờng nuôi cấy: huyết thanh ngựa đợc cho vào môi trờng ngay trớc khi cấy với các tỷ lệ 5%, 10% và 15%. 2.3. Tinh bột gạo: tinh bột gạo đợc sấy bảo quản vô trùng và chỉ cho vào môi trờng một lợng nhỏ (3 - 10mg) trớc khi tiến hành cấy. 2.4. Dung dịch nhuộm để định loại: hematoxylin, hematoxylin - eosin. 3. Phơng pháp nghiên cứu 3.1. Lấy bệnh phẩm: tùy theo vị trí ký sinh và tính chất gây bệnh của từng loại đơn bào: - Lấy ở nơi có thể có nhiều đơn bào (nhầy máu đối với amíp) - Bệnh phẩm phải đợc giữ ở điều kiện ấm để đơn bào sống trớc khi cấy 3.2. Kỹ thuật pha môi trờng Palova: pha theo công thức, điều chỉnh pH = 6 - 6,5. Chia vào các ống nuôi cấy, mỗi ống 5ml, hấp tiệt trùng. Để nguội và bảo quản trong tủ lạnh. 3.3. Kỹ thuật nuôi cấy [3], [6] - Cấy bệnh phẩm: sau khi lấy bệnh phẩm, xét nghiệm thấy có đơn bào phải tiến hành cấy ngay vào môi trờng (đã đợc làm ấm) và để ở tủ ấm 37 0 C. - Cấy truyền trên môi trờng: cấy truyền liên tiếp từ môi trờng đang cấy sang môi trờng mới. - Đánh giá kết quả nuôi cấy: + Đơn bào sống/chết. + Sự hoạt động của đơn bào. + Mật độ của đơn bào. 3.4. Kỹ thuật xác định mật độ đơn bào trong môi trờng nuôi cấy: đếm số lợng đơn bào có trong 0,05ml môi trờng nuôi cấy. 3.5. Kỹ thuật nhuộm đơn bào: nhuộm Hematoxylin feric của Heidenhain và nhuộm cải tiến Hematoxylin Eosin (HE). 3.6. Phản ứng PCR để định loại đơn bào: tiến hành tại Labo Trung tâm, Trờng Đại học Y Hà Nội. 3.7. Xử lý số liệu: theo phơng pháp thống kê y sinh học. iii. Kết quả 62 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Bảng 1. Theo dõi sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Palova qua các lần cấy Mật độ (số con/0,05ml MTNC) Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 3 Ngày thứ 4 Ngày thứ 5 L ầ n c ấ y ống 1 ống 2 ống 3 TB ống 1 ống 2 ống 3 TB ống 1 ống 2 ống 3 TB ống 1 ống 2 ống 3 TB ống 1 ống 2 ống 3 TB 1 3 5 37 40 3 7 4 7 4 6 5 1 4 8 2 4 2 5 2 4 2 4 1 2 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1 2 4 1 46 45 4 4 6 0 6 4 6 5 6 3 2 7 2 5 2 1 2 4 1 2 1 2 1 1 1 1 2 2 0 1 3 5 1 58 65 5 8 7 2 7 9 8 3 7 8 2 4 2 6 2 8 2 6 1 3 1 1 1 5 1 3 3 0 2 1 4 5 7 67 55 5 9 7 8 8 5 7 2 7 8 8 5 9 1 7 9 8 5 3 1 2 9 2 5 2 8 1 2 1 2 1 1 11 5 5 5 62 59 5 8 7 4 8 5 7 0 7 6 8 9 9 5 9 2 9 2 2 9 3 2 2 8 2 9 1 1 1 5 911 6 5 2 49 61 5 4 7 7 8 0 8 3 8 0 9 1 8 8 9 7 9 2 3 2 3 1 3 1 3 1 1 2 1 1 1 5 12 7 5 6 51 58 5 5 7 4 7 9 8 3 7 8 8 5 9 2 9 4 8 9 2 7 3 3 2 9 2 9 9 1 5 1 0 11 Amíp đạt mật độ cao nhất vào ngày thứ 2 trong 3 lần cấy đầu, các lần cấy tiếp theo mật độ amíp đều cao vào ngày thứ 3. Bảng 2. So sánh mật độ ngày thứ 3 của mẫu amíp H 2 trong môi trờng Palova huyết thanh ngựa 5%, 10% và 15% Tỷ lệ HT ngựa Số lần đếm (n) TB p 5% (1) 30 77 p 1/2 < 0,001 10% (2) 30 98 p 2/3 < 0,001 15% (3) 30 65 p 1/3 < 0,001 Sự phát triển của amíp trong môi trờng Palova huyết thanh ngựa 10% là cao nhất và cao hơn hẳn so với môi trờng Palova huyết thanh ngựa 5% và 15%. Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001. Bảng 3. So sánh mật độ ngày thứ 3 của mẫu amíp H2 trong môi trờng Palova huyết thanh ngựa pH 6, pH 6,5 và pH 7 pH Số lần đếm (n) TB p 6 (1) 30 106 p 1/2 > 0,05 6,5 (2) 30 108 p 2/3 < 0,001 7 (3) 30 57 p 1/3 < 0,001 63 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Trong môi trờng Palova pH = 6,5 amíp phát triển rất tốt và không khác biệt so với môi trờng có pH = 6 (p > 0,05). Tuy nhiên trong môi trờng Palova có pH = 7 amíp phát triển kém hơn rất nhiều và sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001. Bảng 4. So sánh mật độ ngày thứ 3 của mẫu amíp H2 trong môi trờng Pavlova HT ngựa 10%, pH 6,5 với lợng tinh bột gạo khác nhau Lợng tinh bột gạo (mg) Số lần đếm (n) TB p 3 (1) 30 71 p 1/2 < 0,001 5 (2) 30 113 p 2/3 < 0,001 10 (3) 30 75 p 1/3 < 0,001 Môi trờng Palova với lợng tinh bột gạo 5mg amíp phát triển tốt nhất và đạt mật độ trung bình ngày thứ 3 cao hơn hẳn so với cùng môi trờng nhng lợng tinh bột gạo là 3mg và 10mg. Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001. Bảng 5. Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Pavlova ở nhiệt độ 37 0 C Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày theo dõi ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5 Trung bình 1 50 49 41 45 51 47 2 75 67 70 68 79 71 3 121 115 109 122 145 122 4 41 39 27 31 33 34 5 15 12 11 11 15 12 6 3 1 5 2 4 3 7 0 0 1 0 1 0 Trong môi trờng Palova (10% huyết thanh ngựa, pH = 6,5 và 5mg tinh bột gạo) ở nhiệt độ 37 0 C amíp phát triển rất tốt và có mật độ trung bình vào ngày thứ 3 rất cao. Bảng 6. Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Pavlova ở nhiệt độ 36,5 0 C Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày theo dõi ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5 Trung bình 1 41 39 47 45 46 43 2 70 64 73 65 71 68 3 115 97 101 98 122 106 4 39 35 41 36 42 38 5 12 11 13 9 15 12 6 3 2 3 0 2 2 7 0 0 0 0 0 0 ở nhiệt độ 36,5 0 C amíp cũng phát triển tơng đối tốt, tuy nhiên mật độ có thấp hơn so với ở nhiệt độ 37 0 C. 64 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Bảng 7. Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Pavlova ở nhiệt độ 36 0 C Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày theo dõi ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5 Trung bình 1 47 45 39 41 46 43 2 25 17 12 8 11 14 3 3 1 2 0 2 1 4 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 ở nhiệt độ 36 0 C, amíp không những không phát triển mà còn giảm rất nhanh kể từ ngày thứ 2 và ngày thứ 3 hầu nh không còn. Bảng 8. Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Pavlova ở nhiệt độ 37,5 0 C Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày theo dõi ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5 Trung bình 1 46 42 39 47 45 43 2 39 42 37 29 31 35 3 9 11 12 7 6 9 4 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 Nhiệt độ 37,5 0 C mật độ amíp không những không tăng mà còn giảm nhanh từ ngày thứ hai và hầu nh không còn kể từ ngày thứ t. Bảng 9. Kết quả nuôi cấy các mẫu amíp gây bệnh (Tính đến hết tháng 7 năm 2004) Mẫu amíp gây bệnh Môi trờng nuôi cấy Thời gian sống H1 Palova pH = 6 - 6,5 huyết thanh ngựa 10%, 5mg tinh bột gạo 20 ngày H2 nt 7 tháng H3 nt 12 tháng H4 nt 7 tháng Mẫu bệnh phẩm H1 chỉ nuôi sống đợc 20 ngày và mẫu bệnh phẩm H2 nuôi sống đợc khoảng 7 tháng. Nguyên nhân chết của cả 2 trờng hợp này đều do sự cố mất điện không đảm bảo đợc nhiệt độ nuôi cấy. Các mẫu bệnh phẩm H3, H4 hiện nay vẫn đang phát triển tốt. 65 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Bảng 10. Kết quả nuôi cấy một số đơn bào khác (Tính đến hết tháng 7 năm 2004) Loại đơn bào Ký hiệu Môi trờng nuôi cấy Thời gian đã sống và còn đang sống E. gingivalis (Răng miệng) G1 G2 G3 Palova pH = 6,5 huyết thanh ngựa 10%, 5mg tinh bột gạo 10 tháng 9 tháng 9 tháng Entamoeba (Không gây bệnh) sp nt 24 tháng Acanthamoeba (Mắt) M1 M2 nt 12 tháng 5 tháng T. vaginalis (Sinh dục - tiết niệu) V1 V2 V3 nt 15 tháng 8 tháng 8 tháng 6 tháng Trong môi trờng Palova giống nh với amíp gây bệnh, một số loại đơn bào trên cũng đã nuôi cấy thành công, giữ sống đợc dài ngày và hiện vẫn đang phát triển tốt. v. Bàn luận 1. Các yếu tố chủ yếu liên quan đến qui trình kỹ thuật nuôi cấy đơn bào Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng môi trờng Palova để nuôi cấy các loại đơn bào đã phân lập đợc và lợng môi trờng trong mỗi ống nuôi cấy là 5ml. Trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy một số yếu tố chủ yếu liên quan đến nuôi cấy đơn bào gồm: - Tỷ lệ huyết thanh ngựa trong môi trờng nuôi cấy: kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy môi trờng Palova với tỷ lệ huyết thanh ngựa 10% đảm bảo tốt nhất cho sự phát triển của đơn bào. Với tỷ lệ huyết thanh ngựa 5% và 15% đơn bào phát triển kém hơn hẳn. Các sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 (bảng 2). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác [5], [7]. - pH của môi trờng nuôi cấy: trong nghiên cứu của chúng tôi, với môi trờng Palova pH 6 và 6,5 sự phát triển của đơn bào không có gì khác biệt (p > 0,05). Môi trờng Palova pH 7, đơn bào phát triển kém hơn hẳn và sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 (bảng 3). Nh vậy môi trờng Palova pH từ 6 đến 6,5 đơn bào đều có thể phát triển tốt. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu của một số tác giả khác [4]. - Lợng tinh bột gạo trong môi trờng: kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy với môi trờng Palova huyết thanh ngựa 10%, pH 6,5 có 5mg tinh bột gạo thì đơn bào phát triển tốt nhất. Lợng tinh bột gạo 3mg và 7mg, đơn bào phát triển kém hơn hẳn. Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 (bảng 4). Nghiên cứu của một số tác giả khác chỉ nói nên cho một chút tinh bột gạo, mà không đề cập cụ thể nên chúng tôi không so sánh đợc [2], [8]. 2. Qui trình nuôi cấy đơn bào: nh đã tiến hành nghiên cứu áp dụng thích hợp trong Labo để giữ chủng dài ngày - Bệnh phẩm có amíp phải đợc tiến hành nuôi cấy ngay. Môi trờng nuôi cấy cần thiết phải làm ấm (khoảng 37 0 C) trớc khi cấy. - Khi cấy từ bệnh phẩm sang môi trờng nuôi cấy nên lấy chỗ có nhiều đơn bào (nhầy máu đối 66 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 với amíp). Sau khi cho bệnh phẩm vào môi trờng nên lắc nhẹ và cho ngay vào tủ ấm 37 0 C. - Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trờng có nhiều đơn bào nhất (khoảng 0,5ml = 10 giọt), cho vào các ống cấy mới mỗi ống 3 - 5 giọt. - Nhiệt độ nuôi cấy luôn đảm bảo ổn định ở 37 0 C. - Theo dõi sự phát triển hàng ngày của đơn bào. - Đối với amíp, trong 3 lần cấy đầu mật độ cao nhất vào ngày thứ 2 và giảm rất nhanh kể từ ngày thứ 3. Các lần cấy sau amíp đều có mật độ cao nhất vào ngày thứ 3 và đến ngày thứ 4 mới bắt đầu giảm nhng giảm chậm hơn (bảng 1). Điều này có lẽ là do khi vừa cấy từ bệnh phẩm sang môi trờng, trong những lần đầu môi trờng còn lẫn tạp khuẩn trong phân, amíp lại cha thích nghi nên thời gian tồn tại sẽ ngắn hơn. Trong các lần cấy sau, amíp đã thích nghi và môi trờng lại thuần nhất hơn nên thời gian tồn tại của amíp dài hơn. Chính vì vậy, theo chúng tôi với 3 lần cấy đầu nên cấy chuyển vào ngày thứ 2, các lần cấy sau thì nên cấy chuyển vào ngày thứ 3. Nh vậy vừa tiết kiệm đợc môi trờng lại vừa tiết kiệm đợc thời gian. v. Kết luận 1. Một số yếu tố chủ yếu ảnh hởng đến nuôi cấy đơn bào - Môi trờng Palova có thể sử dụng tốt để nuôi giữ E. histolytica và một số loại đơn bào khác nh: E. gingivalis, Acanthamoeba, T. vaginalis. - Các yếu tố đảm bảo cho sự phát triển tốt của đơn bào trong nuôi cấy là: + Tỷ lệ huyết thanh ngựa. + pH của môi trờng nuôi cấy. + Lợng tinh bột gạo. + Nhiệt độ nuôi cấy. 2. Qui trình nuôi cấy đơn bào trong Labo để giữ chủng dài ngày - Nhiệt độ nuôi cấy luôn giữ ổn định ở 37 0 C. - Đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy. - Môi trờng nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của đơn bào: + Tỷ lệ huyết thanh ngựa: 10%. + pH của môi trờng nuôi cấy: 6 - 6,5. + Lợng tinh bột gạo: 5mg/1 ống nuôi cấy. - Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trờng có nhiều đơn bào nhất. - Thời gian cấy truyền tốt nhất là ngày đơn bào có mật độ cao nhất và hoạt động khỏe. Với nuôi cấy amíp: + Ngày thứ 2 (3 lần cấy đầu). + Ngày thứ 3 (các lần cấy sau). - Với quy trình này (tính đến tháng 7 năm 2004), chúng tôi hiện đang nuôi giữ đợc 12 mẫu đơn bào thuộc các giống: Entamoeba, Acanthamoeba và Trichomonas với thời gian từ 6 đến 24 tháng. Tài liệu tham khảo 1. Vũ Văn Phong, Đỗ Dơng Thái, Vi Kim Ngọc (1985), Phơng pháp nuôi cấy đơn bào, Kỹ thuật Ký sinh trùng Y học, NXB Tổng cục hậu cần, tr. 29 - 80. 2. Đỗ Dơng Thái và CS (1975), Ký sinh trùng và bệnh ký sinh trùng ở ngời, Quyển III, NXB Y học, tr. 966 - 989. 3. Baillenger J (1992), Coprologie parasitaire et fontionelle, Editeur Arcachon - Bordeau - France. 4. Dagci H, Balcioglu IC, Ertabaklar H, Kurt O, Atambay M (2003), Effectiveness of peptone - yeast extract (P - Y) medium in the cultivation and isolation of Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar in Turkish patients, Diagn Microbiol Infect Dis, Feb, 45 (2), pp. 127 - 30. 5. Diamond LS, Cunnick CC (1991), A serum - free, partly defined medium, PDM - 805, for axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and other Entamoeba, J Protozool, May - Jun, 38 (3), pp. 211 - 6. 67 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 6. Mata - Cardenas BD, Vargas - Villarreal J, Navarro - Marmolejo L, Said - Fernandez S (1998), “Axenic cultivation of Trichomonas vaginalis in a serum - free medium”, J Parasitol, Jun, 84 (3), pp. 638 - 9. 7. Mata - Cardenas BD, Vargas - Villarreal J, Martinez - Rodriguez HG, Said - Fernandez S (1995), “Entamoeba histolytica axenic growth improvement by ox bile”, Arch Med Res, 26 (4), pp. 441 - 4. 8. Said - Fernandez S, Mata - Cardenas BD (1992), “Axenic cultivation of Entamoeba histolytica in suspension”, Trans R Soc Trop Med Hyg, Mar - Apr, 86 (2), pp. 173 - 4. Summary Study on culture technique improvement of routine, standard procedure for maintenance of several parasitic protozoa Responding to our research purposes of considerable interest in improvement of culture techniques to maintain long time several strains of E. histolytica and other parasitic protozoa as material serving for research work and for formation in practice, one study of improved culture techniques has been carried out with result obtained as follows: 1. The Palova culture medium could be applied effectively to maintain long time trophozoites of E. histolytica and some other parasitic protozoa. - Optimal proportion of horse serum added into the medium is 10%. Optimal quantity of purified rice starch added into medium 5mg/500ml medium. - Optimal pH of culture medium trophozoites should be from 6 to 6.5 and 37 o C should be optimal incubation temperature. 2. Three types of media for material samples transport have been applied successfully: sterile 0,85% salin solution, Method of Silard, Method of Gleason can keep trophozoites surviving from 12 hours to 3, 4 days in outside environtment. 3. One routine standard culture procedure for E. histolytica and other protozoa with 4 steps of performance has been established and introduced to collect 144 material samples and to cultivate successfully 4 strains of E. histolytica, 3 strains of Entamoeba Sp, 3 strains of Entamoeba gingivalis, 2 strains of free - living pathogenic amebae of genera Acanthamoeba, and 4 strains of Trichomonas vaginalis. 4. All cultivated protozoa strains mentioned above have been surviving from over 8 months to over two years and at present show continuation of their development. 68 . những yêu cầu cần thiết phải nuôi giữ dài ngày các chủng đơn bào ký sinh, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh nhằm các mục tiêu sau:. 2004 Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh Phạm Trí Tuệ, Phạm Văn Thân, Trơng Thị Kim Phợng, Phạm Ngọc Minh, Lê Thị Tuyết Khanh, Cao Vân Huyền Bộ môn Ký sinh. hởng đến nuôi cấy đơn bào. 2. Xây dựng qui trình nuôi cấy đơn bào thờng qui áp dụng trong Labo để giữ các chủng đơn bào nuôi cấy dài ngày. ii. đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1.