TCNCYH 27 (1) - 2004 Bớc đầu Nghiên cứu tác dụng của Tri mẫu trên sự bài tiết insulin của đảo tụy cô lập Nguyễn Khánh Hoà 1 , Đào Văn Phan 1 , Nguyễn Duy Thuần 2 , Claes Goran Ostenson 3 1 Bộ môn Dợc lý Trờng Đại học Y Hà Nội, 2 Viện Dợc liệu, 3 Đơn vị Bệnh nội tiết và đái tháo đờng, 3 Khoa Y học phân tử, Bệnh viện Karolinska Stockholm Thụy Điển Dịch chiết ethanol của Tri mẫu (Anemarrhena aspheloides Bunge) với nồng độ 2, 4 và 8mg/ml có tác dụng làm tăng bài tiết insulin của đảo tụy cô lập của chuột cống bình thờng chủng Wistar và chuột cống đái tháo đờng di truyền chủng GK. Nh vậy, ngoài Mangiferin là hoạt chất đợc thấy có tác dụng làm hạ đờng huyết do tăng nhạy cảm của các mô đích với insulin, cây Tri mẫu còn có hoạt chất khác kích thích bài tiết insulin của đảo tụy. i. Đặt vấn đề Tri mẫu (TM - Anemarrhena aspheloides Bunge- Liliaceae) là một vị trong bài thuốc dùng điều trị bệnh đái tháo đờng trong Y học cổ truyền [3]. Năm 2001 các tác giả Nhật đã phát hiện tác dụng gây hạ đờng huyết trên chuột nhắt đái tháo đờng chủng KK-Ay của Mangiferin, một hoạt chất chiết từ Tri mẫu [8, 9]. Trong nghiên cứu trớc đây của chúng tôi, tác dụng hạ đờng huyết của Tri mẫu đã đợc chứng minh trên chuột nhắt bình thờng [1, 2]. Tuy nhiên cơ chế tác dụng gây hạ đờng huyết của Tri mẫu vẫn còn cha đợc nghiên cứu đầy đủ. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm tìm hiểu tác dụng gây tăng tiết insulin của Tri mẫu trên đảo tụy cô lập. ii. Chất liệu, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Chất liệu nghiên cứu: Thân củ Tri mẫu đợc nghiền nhỏ rồi chiết trong ethanol 70% bằng Soxhlet. Làm bay hơi ethanol, thu đợc cao mềm chứa hoạt chất toàn phần, trong đó có Mangiferin và đem sử dụng cho nghiên cứu. Mangiferin chuẩn mua của hãng Sigma Aldrich, dùng làm đối chứng. 2. Đối tợng nghiên cứu: Chuột cống trắng bình thờng chủng Wistar, chuột đái tháo đờng di truyền GK (Goto-Kakizaki), một dạng chuột đái tháo đờng di truyền typ 2 kháng insulin không béo phì [4] cả hai giống nặng 250-300g, nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nớc uống tại Khoa Chăn nuôi Viện Karolinska, Stockholm, Thụy Điển. 3. Phơng pháp nghiên cứu Cô lập đảo tụy của chuột cống và ủ trong dung dịch KRB (Kreb-Ringer buffer) chứa các nồng độ 3,3mM hoặc 16,7mM glucose dùng làm nhóm chứng. Các dung 34 TCNCYH 27 (1) - 2004 dịch khác có chứa thêm các nồng độ thuốc khác nhau là Tri mẫu (TM 2, 4, 8mg/ml), Tolbutamid (0,15mM), Arginin (10 mM) và Mangiferin (0,25, 0,5 và 1mg/ml-tơng đơng với các nồng độ trong cao toàn phần), là thuốc nghiên cứu và các thuốc để đối chiếu so sánh. Mỗi nồng độ thuốc nghiên cứu đợc làm trên 21 đảo tụy của 1 chuột. Định lợng insulin trong dịch ủ sau 1 giờ ( à U/đảo/h) bằng phơng pháp phóng xạ miễn dịch [6]. Nhóm chứng ủ với KRB chứa glucose. Định lợng insulin trong dịch thu đợc ( à U/đảo/h) [7]. Kết quả đợc so sánh với nhóm chứng hoặc nhóm đảo tụy ủ với Tolbutamid 0,15mM hoặc Arginin 10mM (các tác nhân gây tăng tiết insulin của tế bào đảo tụy). Mangiferin cũng đợc thử nghiệm với các liều 0,25, 0,5 và 1mg/ml (tơng đơng với các nồng độ có trong cao toàn phần). iii. Kết quả 1. Tác dụng của TM trên đảo tụy chuột cống bình thờng (chuột Wistar) ủ trong KRB có nồng độ glucose 3,3mM và 16,7mM 0 5 10 15 20 25 Glucose 3,3mM TM 2mg TM 4mg TM 8mg/ml Tolb 0,15mM Nồng độ insulin ( à IU/ đảo/h) ** * *** * Đồ thị 1. Tác dụng của TM trên đảo tụy chuột Wistar ủ trong glucose 3.3mM (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001) so với nhóm chứng) 0 5 10 15 20 25 Glucose 16,7mM TM 2mg TM 4mg TM 8mg/ml Tolb0,15mM nồng độ insulin à IU/đảo/h *** * ** *** Đồ thị 2. Tác dụng của TM trên đảo tụy chuột Wistar ủ trong glucose 16,7mM (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001) so với nhóm chứng) 35 TCNCYH 27 (1) - 2004 Các kết quả trình bày ở đồ thị 1 và 2 cho thấy TM với các nồng độ 2, 4 và 8mg/ml có tác dụng làm tăng tiết insulin của tế bào đảo tụy khi ủ với các nồng độ glucose khác nhau. Với nồng độ 2mg/ml TM có tác dụng tơng đơng với Tolbutamid 0,15mM. Với các nồng độ cao hơn (4 và 8mg/ml) TM cho thấy tác dụng gây tăng bài tiết insulin mạnh hơn một cách rõ rệt so với Tolbutamid 0,15mM. Tác dụng gây tăng tiết insulin của TM không phụ thuộc vào nồng độ glucose của môi trờng (p>0,05 khi so sánh giữa các nhóm ủ với TM tơng ứng ở 2 nồng độ 3,3mM và 16,7 mM glucose) 0 5 10 15 20 25 Glucose 16.7 TM 2mg TM 4mg TM 8mg Arg 10 Mangi0.125 Mangi0.25 Mangi 0.5 Nồng độ insulin ( à IU/ đảo/h) ** *** ** Đồ thị 3. Tác dụng của TM và Mangiferin trong glucose 16,7mM ** p < 0.01, *** p < 0.001) so với nhóm chứng) 0 5 10 15 20 25 Glucose 16,7mM TM 2mg TM 4mg TM 8mg Tolb 0,15mM Nồng độ insulin ( à IU/ đảo/h) * ** *** Đồ thị 4. Tác dụng gây tăng tiết insulin từ đảo tụy chuột GK cô lập trong glucose 16.7mM của TM (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001) so với nhóm chứng) 36 TCNCYH 27 (1) - 2004 2. Tác dụng của TM trên đảo tụy chuột cống bình thờng so với Mangiferin và Arginin. Đồ thị 3. cho thấy ở môi trờng có nồng độ glucose cao (16,7mM) TM có tác dụng gây tăng tiết insulin trong khi đó Mangiferin không gây tăng tiết insulin. Tác dụng của TM với các nồng độ 4 và 8mg/ml mạnh tơng đơng với tác dụng của Arginin 10 à M. 3. Tác dụng của TM trên đảo tụy chuột cống đái tháo đờng GK. Đồ thị 4 cho thấy ở các nồng độ 2, 4 và 8mg/ml TM cũng thể hiện tác dụng gây tăng bài tiết insulin của đảo tụy chuột đái tháo đờng GK (10,66 0,67 12,8 0,77 à U/đảo/h và 15,1 0,93 à U/đảo/h tơng ứng với nồng độ 2,4 và 8mg/ml so với nhóm chứng 11,4 1,06 à U/đảo/h). Trong khi đó Tolbutamid 0,15mM không có tác dụng gây tăng tiết insulin trên đảo tụy chuột GK khi ủ với glucose 16,7mM. IV. Bàn luận ở các liều 2, 4 và 8mg/ml TM có tác dụng làm tăng bài tiết insulin của đảo tụy cô lập ở cả chuột cống đái tháo đờng GK (Chuột GK là chuột đái tháo đờng di truyền, có hai đặc điểm là giảm nhạy cảm của mô đích với insulin và rối loạn bài tiết insulin của tế bào beta đảo tụy) cũng nh chuột cống bình thờng Wistar. Tác dụng gây tăng tiết insulin của TM tăng dần theo liều sử dụng và theo nồng độ glucose. Điều đó chứng tỏ là TM đã làm tăng tính nhạy cảm của tế bào beta đảo tụy với sự kích thích tiết insulin của glucose. Trong khi đó Mangiferin, một hoạt chất tách chiết từ Tri mẫu đã đợc Miura T. công bố là gây hạ đờng huyết trên chuột đái tháo đờng chủng KK-Ay (Chuột đái tháo đờng KK- Ay là chuột nhắt đái tháo đờng di truyền, đặc điểm chủ yếu là do giảm nhạy cảm của mô đích với insulin) [7, 8] không gây tăng tiết insulin của tế bào đảo tụy ở những liều (theo tính toán của chúng tôi) đợc coi nh có nồng độ tơng đơng với nồng độ trong dịch chiết toàn phần. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Miura T. khi thử trên súc vật nguyên vẹn để chứng minh Mangiferin làm tăng độ nhạy cảm của các mô cơ quan với tác dụng của insulin [8, 9]. Do vậy chúng tôi phỏng đoán là trong thành phần của TM còn có hoạt chất khác gây hạ đờng huyết liên quan đến tác dụng làm tăng tiết insulin của tế bào đảo tụy do làm tăng tính nhạy cảm của tế bào beta với glucose. Arginin là một hoạt chất có tác dụng làm tăng tiết insulin của tế bào đảo tụy với sự có mặt của glucose ở nồng độ cao đợc coi nh chứng dơng cho các thực nghiệm [10], đồng thời cũng đợc dùng để so sánh với tác dụng của TM. Kết quả so sánh cho thấy TM ở liều 8mg/ml có tác dụng tơng đơng với Arginin 10mM. Tolbutamid 0,15mM, một sulfamid gây hạ đờng huyết theo đờng uống do kích thích tế bào beta tiết insulin [5], có tác dụng yếu hơn so với tác dụng của TM trong các thực nghiệm của chúng tôi. Điều đó cho thấy TM có triển vọng trở thành một thuốc gây hạ đờng huyết có thể sử dụng đợc trong lâm sàng. Iv. Kết luận Bên cạnh hoạt chất gây hạ đờng huyết là Mangiferin do làm tăng nhạy cảm của mô ngoại biên với insulin TM còn chứa hoạt chất gây hạ đờng huyết khác mà cơ chế tác dụng liên quan đến việc gây tăng bài tiết insulin của tế bào beta đảo tụy. Cơ chế làm tăng tiết insulin của đảo tuỵ dới 37 TCNCYH 27 (1) - 2004 tác dụng của Tri mẫu và hoạt chất gây ra tác dụng này cần đợc tiếp tục nghiên cứu. Tài liệu tham khảo 1. Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hoà, Nguyễn Duy Thuần (2002). Nghiên cứu tác dụng hạ đờng huyết của Tri mẫu, Móng trâu, Thất diệp đởm và Thiên hoa phấn. Tạp chí Nghiên cứu y học, Trờng Đại học Y Hà Nội (21). 2. Phạm Hữu Điển, Phan Văn Kiệm, Đặng Thị Lan Hơng, Lu Văn Chính, Châu Văn Minh, Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hoà (2002). Nghiên cứu khả năng hạ đờng huyết của sinh địa và tri mẫu, Tạp chí Dợc học, Bộ Y tế, tháng 5/2002 (313), 10-12. 3. Trần Thúy (1992). Bệnh học nội khoa Y học cổ truyền. 341-348. 4. Goto Y, Suzuki K. I., Sasaki M, Ono T, Abe S. (1988). GK rat as a model of none insulin dependent diabetes: Selective breeding over 35 generations In: Lessons from animal diabetes. (Shafrir E, Renold AE, eds). Libbey J, London pp 301-303. 5. Hellman B., Sehlin J., and Taljedal I. B. (1971). The pancreatic B cell recognition of insulin secretogogues. II. Site of action of tolbutamide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45, 1384- 1388. 6. Herbert V, Lau KS, Gottlieb CW, Bleicher SJ (1965). Coated charcoal immunoassay of insulin. J. Clin. Endocrinology. Metab. 25: 1375- 1384. 7. Ostenson C. G., Khan A.,Abdel- Halim S.M., Suzuki K., Goto Y. and Efendic S. (1993). Abnormal insulin secretion and glucose metabolism in pancreatic islets from the spontaneously diabetic GK rat. Diabetologia, 36: 3-8. 8. Miura T. et al. (2001). Antidiabetic activity of the rhizoma of Anemarrhena asphodeloides and active components mangiferin and its glucoside. Biol Pharm Bull. Sep. 24 (9): 1009-11. 9. Miura T. et al (2001). Antidiabetic activity of a xanthone compound, mangiferin, Phytomedicine; 8 (2): 85-7. 10. Wang F, Westermark G, Gasslander T, Permert J. (1997). Effect of islet amyloid polypeptide on somatostatin inhibition of insulin secretion from isolated rat pancreatic islets. Regul. Pept. Sept. 26; 72 (1): 61-7. Summary Preliminarily investigate the stimulating insulin secretion of Tri Mau in isolated pancreatic islets The ethanol extract of Anemarrhena aspheloides Bunge- Liliaceae in concentration of 2, 4 and 8mg/ml increases the insulin secretion of isolated islets of normal Wistar rat and also of genetic diabetes GK rat incubated in glucose 3.3 or 16.7mM. So, in addition of Mangiferin, one Anemarrhena active substance having the hypoglycemic effect due to increasing the insulin sensitivity of peripheral tissues, there are the other substances directly stimulating the pancreas islets to secrete insulin. 38 . hạ đờng huyết của Tri mẫu vẫn còn cha đợc nghiên cứu đầy đủ. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm tìm hiểu tác dụng gây tăng tiết insulin của Tri mẫu trên đảo tụy cô lập. ii. Chất. TCNCYH 27 (1) - 2004 Bớc đầu Nghiên cứu tác dụng của Tri mẫu trên sự bài tiết insulin của đảo tụy cô lập Nguyễn Khánh Hoà 1 , Đào Văn Phan 1 , Nguyễn Duy. Mangiferin không gây tăng tiết insulin. Tác dụng của TM với các nồng độ 4 và 8mg/ml mạnh tơng đơng với tác dụng của Arginin 10 à M. 3. Tác dụng của TM trên đảo tụy chuột cống đái tháo đờng