Tạp chí KHKT Nông nghiệp, Tập 2 số 1/2004 Khả năng chống bệnh đạo ôn ( Pyricularia oryzae) Bắc Việt Nam và đặc điểm nông sinh học một số dòng lúa chứa gen chống bệnh Resistance to blast disease of northern Vietnam and some agronomic characteristics of rice lines containing different resistant genes Phan Hữu Tôn Summary Resistance and some important agronomic characteristics of 24 rice lines containing the different resistant genes to blast disease were investigated by artifically innoculation using 4 isolates from Yenbai and Hanam provinces of Northern Vietnam. Eight lines containing Pi- k s , Pi-k, Pi-z, Piz-5, Pi 1, Pi 3 and Pi 5(t) genes were identified with high resistance to all 4 used isolates. Other genes, Pi-i, Pi-k p , Pi-z t , Pi-ta, Pi-t, Pi sh, Pi 7(t), Pi 9 (t) and Pi 19(t) could resist to the three isolates. Isolate 45 showed strong virulence to the rice lines with low resistant/succeptable ratio(14R/10S). Rice line, manely, IRBLz-Fu containing Pi-z gene showed strong resistance to the blast disease, good agronomic characteristics and high yield of 6.0 tons/ha. Keywords : Blast disease, resistant gene, isolate, virulence 1. Đặt vấn đề Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong những bệnh hại quan trọng ở các nớc trồng lúa trên thế giới (Ou,1985). Trong những năm gần đây bệnh phát sinh mạnh và phá hại nghiêm trọng ở nhiều nơi của miền Bắc nớc ta. Để phòng trừ bệnh này có rất nhiều biện pháp khác nhau nh: canh tác, hoá học và chọn tạo giống chống bệnh, trong đó việc phát triển và tạo ra giống chống bệnh đợc coi là có hiệu quả kinh tế nhất, không gây ô nhiễm môi trờng và tạo ra nông sản sạch. Một trong những đặc điểm cơ bản của nấm bệnh đạo ôn là tồn tại rất nhiều chủng khác nhau, trên thế giới đã phát hiện có 256 chủng (Veeraraghavan, 1975). Mỗi vùng sinh thái, tồn tại một số chủng nhất định và có mức độ gây hại khác nhau. Tơng ứng với các chủng, có những gen chống khác nhau, hiện đã tìm thấy có tới 30 locus gen chống bệnh (Zheng et al, 1995). Mỗi gen chống đợc một hoặc một số chủng nhất định. Có gen chống rất mạnh đối với chủng này nhng lại bị nhiễm rất năng đối với chủng khác. Để chọn tạo giống chống bệnh thành công, trớc hết phải có nguồn gen chống, sau đó phải xác định đợc gen chống đợc chủng đang tồn tại ở vùng mà giống đó sẽ phổ biến rồi đa gen đó vào giống mới. Trong khuôn khổ Dự án JICA giữa Chính phủ Nhật Bản-Việt Nam và Trờng Đại học Nông nghiệp I, chúng tôi đã nhận đợc một tập đoàn gồm 24 dòng giống lúa, chứa các gen chống bệnh đạo ôn khác nhau. Để sử dụng nguồn gen này trong công tác chọn tạo giống chống bệnh đạo ôn ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập, phân lập chủng, rồi lây nhiễm nhân tạo để xác định gen nào chống đợc các chủng của Việt Nam, đồng thời khảo sát đặc điểm nông sinh học của các dòng giống. 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu tham gia thí nghiệm gồm 24 dòng giống lúa chứa các gen chống bệnh khác nhau do Viện lúa quốc tế IRRI cung cấp, giống đối chứng nhiễm bệnh là Nếp 352 (bảng 1). 4 chủng phân lập (isolate) nấm bệnh đạo ôn sử dụng trong lây nhiễm nhân 3 tạo, đợc nuôi cấy và phân lập theo phơng pháp đơn bào tử từ 4 giống lúa nhiễm bệnh trồng ở 2 tỉnh Hà Nam và Yên bái. ở tỉnh Hà Nam gồm 3 chủng: isolate 45 từ giống Q5; isolate 48 từ giống nếp thơm và isolate 50 từ giống C70; ở tỉnh Yên Bái có chủng isolate YB phân lập từ lúa lai 2 dòng Bồi tạp Sơn thanh. Bảng 1. Danh sách các dòng tham gia thí nghiệm Số thứ tự Tên dòng Chứa gen Số thứ tự Tên dòng Gen chứa IRBL 1 IRBLa-A Pi-a 13 IRBLta-CT2 Pi-ta 2 IRBLa-C Pi-a 14 IRBLb-B Pi-b 3 IRBLi-F5 Pi-i 15 IRBLt-K59 Pi-t 4 IRBLks-F5 Pi-k z 16 IRBLsh-S Pi sh 5 IRBLks-S Pi-k s 17 IRBLsh-B Pi sh 6 IRBLk-ka Pi-k 18 IRBL1-CL Pi 1 7 IRBLkp-K60 Pi-k p 19 IRBL3-CP4 Pi 3 8 IRBLkh-K3 Pi-k h 20 IRBL5-M Pi 5(t) 9 IRBLz-Fu Pi-z 21 IRBL7-m Pi 7(t) 10 IRBLz5-CA Piz-5 22 IRBL9-W Pi 9(t) 11 IRBLzt-T Pi-z t 23 IRBL12-M Pi 12(t) 12 IRBLta-K1 Pi-ta 24 IRBL19-A Pi 19(t) 25 Nếp 352 Đối chứng 2.2. Phơng pháp nghiên cứu Cách phân lập nấm bệnh : Mẫu lá bệnh đợc cắt thành mẩu rộng 1,0 x 0,5 cm , rửa sạch bụi bẩn bằng nớc cất vô trùng, rồi khử trùng đầu tiên bằng cách ngâm trong cồn 70 0 khoảng 15-30 giây sau đó ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 2 - 3 giây, rửa sạch 3 lần bằng nớc cất vô trùng rồi đặt mẫu vào đĩa petri giữ ẩm để nấm mọc tự nhiên. Sau khi nấm mọc trên lá bệnh và hình thành bào tử, tiến hành phân lập. Dùng que cấy vô trùng quệt lên bề mặt mô bệnh sau đó quệt nhẹ sang môi trờng WA (gồm nớc cất và agar) rồi đa lên kính hiển vi quan sát, dùng kim lấy bào tử, lấy chính xác một bào tử hình thoi hoặc hình nụ sen, chuyển sang môi trờng nuôi cấy mới là môi trờng KD chứa cám gạo để nuôi cấy. Sau đó đặt vào tủ định ôn có nhiệt độ 28 0 C, chu kỳ chiếu sáng/tối là 8/14 giờ, khoảng 22 ngày sau, tuỳ theo khả năng phát triển của các isolate khác nhau mà chúng ta có thể đem rửa lấy sợi nấm và cấy chuyển sang buồng sinh bào tử. Cách pha môi trờng WA nh sau: Lấy 20 gam agar cho vào một lít nớc cất vô trùng, đun sôi để hoà tan rồi bỏ vào nồi hấp khử trùng, hấp ở nhiệt độ 121 0 C trong thời gian 20 phút, đổ ra đĩa petri, mỗi đĩa 2 ml, để nguội trớc khi dùng. Môi trờng KD: Thành phần gồm: đờng saccaroza 20g, khoai tây 200g, bột hạt đậu tơng 10g, lá lúa tơi phơi khô 200g, cám gạo 20g và 20 g agar trong 1 lít môi trờng. Cách pha chế : Cho cám gạo vào 200 ml nớc, đun sôi 30 phút, đem lọc qua 4 lớp vải màn lấy phần nớc lọc. Dùng 800ml nớc còn lại cho lợng khoai tây, đậu tơng và lá lúa đã cắt nhỏ, đem đun sôi 30 phút, sau đó lọc lấy nớc vào bình tam giác trong có chứa dịch chiết cám gạo. Đổ lợng agar vào dung dịch đã nguội trong bình, khuấy đều bằng máy khuấy rồi đun sôi để hoà tan agar. Kết thúc tất cả các công đoạn cho toàn bộ môi trờng vào nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 0 C trong 20 phút. 2.3. Phơng pháp lây nhiễm nhân tạo ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng phơng pháp phun dịch bào tử vào khay mạ sau gieo 20-22 ngày thờng có từ 3 - 4 lá thật. Rửa đĩa petri nuôi nấm để lấy bào tử bằng nớc 4 cất vô trùng, bổ sung thêm vài giọt Tween 20 để tăng khả năng bám dính các bào tử lên lá mạ, sau đó lấy một giọt dung dịch bào tử đa lên lamen, quan sát dới kính hiển vi (pha loãng nếu cần thiết) để sao cho có khoảng 50 bào tử trên một quang trờng kính hiển vi, tơng đơng với 10 5 bào tử trên 1ml dung dịch. Sử dụng bình phun có áp lực khoảng 3 atm/cm 2 để phun cho mạ. Đặt các khay mạ trong tủ lây nhiễm ở nhà lới, phủ bao tải ẩm hoặc phun giữ ẩm thờng xuyên trong khoảng 16-24 h và giữ nhiệt độ khoảng 24-26 0 C trong 6 ngày. Thang điểm đánh giá theo Kato (1993): Cấp 0 không có vết bệnh , kháng cao (HR); cấp 1 vết bệnh là một chấm nhỏ bằng đầu kim, kháng (R); cấp 2 vết bệnh to hơn màu nâu nhạt đến nâu tối, kháng (R), cấp 3 vết bệnh to hơn và có màu xám ở giữa, nhiễm (S); cấp 4 vết bệnh đặc trng hình thoi, nhiễm nặng (HS). Cấp kháng từ cấp 0 (kháng cao, HR) đến cấp 2 (kháng, R); cấp nhiễm từ 3 (nhiễm, S), cấp 4 (nhiễm nặng, HS). Nghiên cứu các chỉ tiêu nông sinh học ngoài đồng theo phơng pháp khảo sát tập đoàn và đánh giá giống theo thang điểm của IRRI năm 1996. 3. Kết quả nghiên cứu và đề nghị 3.1. Đánh giá khả năng chống bệnh đạo ôn Để phục vụ cho công tác chọn giống chống bệnh thì việc đầu tiên là xác định đợc khả năng chống lại các chủng bệnh của các gen chống để biết gen nào chống đợc chủng nào, và chống đợc bao nhiêu chủng. Từ đó có kế hoạch sử dụng trong các chơng trình chọn tạo giống. Để đánh giá tính chống bệnh của từng gen khác nhau chúng tôi đã tiến hành lây nhiễm nhân tạo dùng 4 Isolate thu thập trên các giống nhiễm ở các địa phơng khác nhau. Kết quả lây nhiễm và đánh giá đợc trình bầy bảng 2. Trong số 24 dòng đánh giá thì có 8 dòng chống đợc tất cả 4 isolate , đó là các dòng số 4 chứa gen (Pi- k s ), số 5 chứa gen ( Pi- k s ), số 6 chứa gen ( Pi- k), số 9 chứa gen (Pi- z), số 10 chứa gen (Piz-5), số 18 chứa gen (Pi 1), số 19 chứa gen (Pi 3), số 20 chứa gen (Pi 5(t)). Trong khi đó giống đối chứng Nếp 352 bị nhiễm nặng bởi tất cả 4 isolate Có 10 dòng chống đợc 3 isolate lây nhiễm đó là các dòng số 3, 7, 11, 12, 15, 16, 17, 21, 22 và 24. Có 3 dòng giống chống đợc 2 isolate lây nhiễm đó là các dòng số 23, 14, 8 và có 2 dòng chỉ chống đợc 1 isolate lây nhiễm. Nh vậy các gen khác nhau thì khả năng chống các chủng bệnh đạo ôn cũng khác nhau. Trong số 20 gen nghiên cứu cho thấy mặc dù chứa gen chống khác nhau nhng các dòng giống đều có khả năng chống ít nhất là một chủng. Trong số 4 isolate sử dụng để lây nhiễm thì thấy isolate có độc tính mạnh nhất là isolate 45 có tỷ lệ chống trên nhiễm là 14R/10S, tiếp đến là isolate 50 (18R/6S), isolate 48 và isolate YB (22R/2S). Nh vậy muốn tạo đợc giống chống bệnh đạo ôn ở miền Bắc Việt Nam thì nên sử dụng những gen chống lại hầu hết các chủng lây nhiễm nh: Dòng số 4 chứa gen (Pi k-s), số 5 chứa gen (Pi k-s), số 6 chứa gen ( Pi k), số 9 chứa gen (Pi z), số 10 chứa gen (Piz-5), số 18 chứa gen (Pi 1), số 19 chứa gen (Pi 3) và dòng số 20 chứa gen (Pi 5(t)). Tuy nhiên do đặc điểm của nấm đạo ôn là tồn tại rất nhiều nòi sinh lý khác nhau trong cùng một vùng sinh thái nên việc điều tra phân lập, xác định số lợng chủng một cách chính xác là việc làm hết sức cần thiết. Trong nghiên cứu này mới chỉ sử dụng 4 chủng phân lập khác nhau để lây nhiễm, chắc chắn cha thể đại diện cho các vùng sinh thái Bắc Việt nam, do vậy việc kết luận những gen chống đa nòi mới chỉ là bớc đầu, cần phải nghiên cứu với qui mô và hệ thống hơn. Qua thực tế lây nhiễm nhân tạo cho thấy điều kiện ngoại cảnh có ảnh hởng quyết định đến quá trình phát bệnh đó là độ ẩm phải cao >85%, nhiệt độ thích hợp từ 20 - 24 C và cờng độ ánh sáng thấp. 5 3.2. Đặc điểm nông sinh học chính và năng suất Thời gian sinh trởng các dòng biến động từ 118 -141 ngày đều thuộc nhóm có thời gian sinh trởng ngắn đến trung bình. Chiều cao cây của các dòng biến động từ 75,5 cm đến 129,9 cm. Theo phân loại của IRRI thì đa số các dòng đều thuộc nhóm cây lùn đến nửa lùn, chỉ riêng có dòng số 12 có chiều cao 129,9 cm là thuộc nhóm cao cây. Bảng 2. Phản ứng chống bệnh của các dòng-giống đối với các isolate Isolate48 Isolate50 IsolateYB Isolate45 Isolate Stt Cấp bệnh Phản ứng Cấp bệnh Phản ứng Cấp bệnh Phản ứng Cấp bệnh Phản ứng 1 3 S 3 S 0 HR 3 S 2 3 S 4 HS 0 HR 4 HS 3 1 R 1 R 1 R 3 S 4 2 R 2 R 0 HR 0 HR 5 1 R 1 R 0 HR 0 HR 6 2 R 0 HR 0 HR 2 R 7 0 HR 0 HR 2 R 3 S 8 3 S 2 R 0 HR 3 S 9 1 R 2 R 0 HR 2 R 10 2 R 1 R 2 R 2 R 11 0 HR 2 R 0 HR 3 S 12 2 R 1 R 3 S 2 R 13 2 R 1 R 4 HS 2 R 14 1 R 3 S 0 HR 3 S 15 3 S 2 R 2 R 2 R 16 0 HR 3 S 0 HR 2 R 17 0 HR 0 HR 1 R 0 HR 18 2 R 2 R 0 HR 1 R 19 2 R 2 R 1 R 0 HR 20 2 R 0 HR 0 HR 0 HR 21 2 R 0 HR 2 R 3 S 22 2 R 3 S 0 HR 2 R 23 3 S 4 HS 2 R 3 S 24 1 R 2 R 0 HR 4 HS Tỷ lệ R/S 19R/5 18R/6 22/2 14/10 N352 4 HS 3 S 4 HS 4 HS 6 Bảng 3. Một số đặc điểm nông sinh học và năng suất các dòng giống Năng suất thực thu STT Thời gian sinh trởng (ngày) Chiều cao cây (cm) Nhánh tối đa /khóm Bông hữu hiệu /khóm Số hạt chắc trên bông Khối lợng 1000 hạt (g) G/cây Tạ/ha 1 125 82,3 9,8 8,3 85,6 22,0 12,0 54,00 2 127 83,9 7,7 5,7 84,4 17,8 7,3 32,85 3 126 78,8 8,1 6,2 79,6 24,8 10,0 45,00 4 121 106,7 7,0 4,0 78,9 26,2 7,0 31,50 5 124 102,7 9,7 8,2 97,2 20,0 14,0 63,00 6 130 98,6 8,5 6,5 80,7 25,4 12,0 54,00 7 128 109,3 6,4 3,4 105,8 26,4 8,0 36,00 8 129 112,5 10,4 8,9 58,0 26,4 11,5 51,75 9 141 108,0 8,0 6,0 119,3 24,0 15,5 69,75 10 128 115,6 9,0 7,0 108,3 21,0 12,0 54,00 11 123 102,2 9,0 7,0 73,3 25,0 11,0 49,50 12 121 129,9 11,1 9,6 73,5 24,0 13,0 58,50 13 125 94,9 9,2 7,2 72,9 20,4 6,0 27,00 14 127 95,9 8,8 6,8 61,5 27,4 10,0 45,00 15 131 116,8 9,0 7,0 83,3 24,2 12,0 54,00 16 120 113,5 10,0 8,0 83,3 21,0 10,0 45,00 17 118 75,5 7,8 5,8 74,3 27,2 10,5 47,25 18 125 106,7 9,3 7,3 87,8 22,6 12,8 57,60 19 128 113,3 8,8 6,8 72,4 24,6 10,5 47,25 20 132 91,7 7,0 5,0 89,1 21,8 8,5 38,25 21 133 92,2 7,6 5,6 60,4 24,0 7,0 31,50 22 124 124,7 8,0 6,0 93,6 19,5 8,5 38,25 23 120 117,7 7,0 5,0 147,6 20,0 12,1 54,63 24 128 93,1 9,0 7,0 106,0 19,7 12,0 54,00 N352 145 111,6 8,0 6,0 123,0 22,0 14,5 65,25 7 Tổng số nhánh của các dòng biến động từ 6,4 nhánh cả 24 dòng giống lúa (dòng số 7) đến 11,2 nhánh (dòng số 12), giống đối chứng có 8,0 nhánh. Theo IRRI, thì đều có khả năng đẻ nhánh thuộc diện thấp đến trung bình, đây là đặc điểm tốt cần khai thác. Số bông hữu hiệu trên khóm là một chỉ tiêu chính góp phần làm tăng năng suất của một giống. Kết quả cho thấy dòng đạt số bông hữu hiệu cao nhất là số 12 (9,6 bông/K) và thấp nhất là dòng số 7 (3,4 bông/K). Mục tiêu của trồng lúa là thu hoạch hạt vì vậy năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất luôn là chỉ tiêu quan trọng trong công tác chọn tạo giống và đánh giá một giống tốt hay xấu. Năng suất thực thu của các dòng biến động từ 7,0g/cây (dòng số 4 và 21) đến 15,5g/cây (dòng số 9), đối chứng đạt 14,5g/cây. Về năng suất thực thu thì chỉ duy nhất có dòng số 9 (IRBLz-Fu) cho năng suất thực thu cá thể cao hơn đối chứng, các dòng còn lại đều thấp hơn. Hai dòng số 9(IRBLz-Fu) và số 5 (IRBLks-S) có năng suất thực thu cao đạt trên 6,0 tấn/ha có thể chấp nhận đa trồng ra thực tế sản xuất vì chúng còn có khả năng chống bệnh đạo ôn tốt. 4. Kết luận - Bằng phơng pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng 4 chủng phân lập nấm bệnh đạo ôn đã phát hiện thấy có 8 dòng giống chứa các gen Pi- k s , Pi-k, Pi-z, Piz-5, Pi 1, Pi 3 và Pi 5(t) biểu hiện khả năng chống rất mạnh với cả 4 chủng phân lập. - Dòng lúa IRBLz-Fu chứa gen Pi-z cho năng suất khá cao (69,75 tạ/ha) vừa có khả năng chống bệnh đạo ôn tốt, có thể đa đi khảo nghiệm giống quốc gia. Tài liệu tham khảo Kato (1993). Plant diseases 77. P: 1211 - 1216. Kangle Zheng, Ning Huang, John Bennett, and Gurdev S. Khush, (1995). PCR-based marker assisted selection in rice breeding. IRRI international Rice Research Institute P.O.Box 933, Manila 1099, Phillippines. Ou, S, H, (1985). Rice diseases, 2 nd ed, Commonwealth Agric, Bureaux, Central Sales, Farnham Royal, Slough, UK. P.380. Tiêu chuẩn đánh giá giống lúa IRRI năm, (1996). Tài liệu dịch tiếng Việt. Veeraraghavan J., (1975). A new method of classification and nonmenclature of physiologic races of Pyricularia oryzae Cav., Int. Rice Comm. Newsl., 24: 128-138 . 8 . Tạp chí KHKT Nông nghiệp, Tập 2 số 1/2004 Khả năng chống bệnh đạo ôn ( Pyricularia oryzae) Bắc Việt Nam và đặc điểm nông sinh học một số dòng lúa chứa gen chống bệnh Resistance to. 9 chứa gen (Pi z), số 10 chứa gen (Piz-5), số 18 chứa gen (Pi 1), số 19 chứa gen (Pi 3) và dòng số 20 chứa gen (Pi 5(t)). Tuy nhiên do đặc điểm của nấm đạo ôn là tồn tại rất nhiều nòi sinh. giống chống bệnh đạo ôn ở miền Bắc Việt Nam thì nên sử dụng những gen chống lại hầu hết các chủng lây nhiễm nh: Dòng số 4 chứa gen (Pi k-s), số 5 chứa gen (Pi k-s), số 6 chứa gen ( Pi k), số