Đang tải... (xem toàn văn)
Nuôi cấy tế bào
2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Ứng dụng kỹ thuật ni cấy phịng thí nghiệm Tác Giả : Lê Hoàng Duy Danh mục : Chương : Sơ chế chất cần thiết cho nuôi cấy Chương : Hướng dẫn nuôi cấy Vi khuẩn Chương : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào thực vật Chương : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào động vật động vật hữu nhũ Lời Ngỏ : Tài liệu tham khảo từ sách chuyên nghành sinh học xuất năm 1972, tài liệu để tham khảo thêm cho sinh viên chuyên nghành công nghệ sinh học Tài liệu tài liệu xét nghiệm tập trung vào kiến thức nuôi cấy tế vào vi sinh vật, kiến thức cho công nghệ tế bào gốc sau này, nhìn chung cơng nghệ sử dụng máy móc để giảm gánh nặng cho nhà nghiện cứu cách thức nuôi cấy không khác năm đầu cơng nghệ sinh học Chương : Sơ chế chất cần thiết cho nuôi cấy Dung dịch Hanks Đậm gấp 10 lần Cách pha : Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Pha dung dịch riêng A B riêng rẽ sau kết hợp lại : Dung dịch A : NaCl : 80g KCl : 40g 7H2O + MgSO4 : 1g MaCl2 .6H2O : 1g CaCl2 : 1,4g Nước cất lần 500ml Dung dịch B : Na2HPO4.2H2O : 0,75g Na2HPO4.12H2O : 1,5g KH2PO4 : 0,6g Glucozơ : 10g Nước cất lần 480 ml ** Pha dung dịch muối sau đổ dung dịch A vào dung dịch B cách từ từ vừa đổ vừa khuấy Cuối lít dung dịch cho thêm 20 ml dung dịch 1% đỏ phenol Lọc qua lọc giấy, để làm tiệt trùng có cách : + Cách thứ cách tốt lọc qua Seitz (lọc ngăn vi khuẩn) + Cách sấy ước 100 độ C 20 phút, sấy lần ngày liên tiếp Nhưng trường hợp CaCl2 phải pha riêng vào cho thêm sau sấy, trước dùng Tiệt trùng xong đóng vào lọ 500-1000 ml đậy kín nút cao su Thử vô trùng cách cấy 0,5 ml dung dịch vào môi trường canh thang thịt – pepton thách Sabouraud Bảo quản dung dịch mẹ tủ lạnh bảo quản đến tháng Trước dùng đem pha loãng 10 lần với nước cất lần vô trùng Dung dịch làm việc đem sấy 100 độ C, 10 phút với áp suất 0,7 at , điều chỉnh PH bằngng dung dịch bica 1,4% có PH = 7,2 – 7,4 Cứ 100 ml dung dịch cho 2,5 – ml Chú ý : + Dung dịch làm việc phịng khơng q tháng Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào + Chưa pha bica sử dụng tháng Bica tên viết tắt : Bicacbonat Na, Bicacbonat Ca, Bicacbonat Mg Dung dịch Earle Thành phần dung dịch chuẩn đặc 10 lần lít sau : NaCl : 68g KCl : 4g CaCl2 : 2g MgSO4.7H2O : 2g NaH2PO4.7H2O : 1,25g Glucozơ : 10g Đỏ Phenol : 0,2g Hòa tan thành phần mưới theo trật tự kể nước cất lần Riêng CaCl2 phải pha riêng cho vào sau vừa cho vừa trộn lọc qua lọc Seitz Khử vô trùng đậy nút cao su Bảo quản buồng lạnh Trước pha loãng 10 lần với nước cất lần Lọc lại lần thứ Điều chỉnh PH để có PH = 7,4 – 7,5 cách cho thêm vào – 4,4 ml dung dịch 5% Bica vào 100 ml dung dịch muối Nếu cần cho giảm PH cho luồn khí CO2 qua sau khí qua bình chứa axit H2SO4 hay qua lọc Dung dịch đệm FotFat Tùy theo yêu cầu cụ thể công tác cần cụ thể cơng tác cần đến dung dịch đệm Fotfat chứa ion Ca Mg Cách pha lít dung dịch đặc 10 lần sau : Dung dịch A : NaCl : 80g KCl : 2g CaCl2 : 80g KCl : 2g CaCl2 : 1g MgCl2.6H2O : 1g Nước cất lần 1000 ml Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Dung dịch B : Na2HPO4.12H2O : 28,98g KH2PO4 : 2g Nước cất lần : 10 ml Trước dùng 100ml dung dịch A cho thêm 800 ml nước cất lần sau cho thêm 100 ml dung dịch B Lọc qua lọc Seitz giữ tủ lạnh Nếu dung dịch đệm Fotfat không cần Ion Ca Mg cách pha sau : NaCl : 8g KCl : 0,2g Na2HPO4.12H2O : 2,9g KH2PO4 : 0,2g Nước cất lần cho đầy lít sấy vơ trùng 110 độ 30 phút giữ nhiệt độ phịng Dung dịch Trypsin Hòa tan 1g Trypsin Difco 100ml dung dịch đệp Fotfat Lọc qua lọc giấy hay lọc sau lọc qua lọc Seitz thử vơ trùng cấy vào canh thang thịt Pepton thạch Sabouraud Ở trạng thái đống băng (-20 độ C) dung dịch Trypsin bảo quản tháng + độ C, giữ vài tuần lễ Trước dùng đem pha loãng lần với dung dịch đệm Fotfat hay dung dịch Hanks vơ trùng để có nồng độ cuối 0,25% Dung dịch Vecxen (Vecxen muối axit etylen diamin tetra-axetic) Để điều chế dung dịch 0,02% người ta cấy 0,5g Vecxen hòa tan 2500ml dung dịch đệm Fotfat không chứa Ion Ca Mg rót vào lọ 50ml, sấy vơ trùng áp suất at, 30 phút Bảo quản độ C thời gian -2 tháng tránh ánh sáng Dung dịch đỏ Phenol 1% Trước hết chứa 100ml 1N NaOH cách trộn 10ml dung dịch NaOH bảo hòa(li tâm dung dịch NaOH bảo hòa để bỏ hết cặn) với 90 ml nước cất lần Sau 10g đỏ Phenol hòa tan cồn cho thêm 20ml dung dịch 1N NaOH lắc để lắng phút Hút bên cho vào ống đo lường lít cho thêm vào chỗ cặn độ 10ml 1N NaOH lại lắc hút lấy nước hộp vào ống đong, tiếp tục thuốc đỏ Phenol tan hết Tuy nhiên 1N NaOH dùng để hòa tan 10g Phenol Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào không 70ml số lượng NaOH nhiều dung dịch có màu đỏ thẫm khơng dùng vào ni cấy tế bào Dung dịch đỏ trung tính Muốn chế dung dịch 0,1% đỏ trung tính người ta hịa tan 0,1g thuốc vào 100ml cồn Etyl 60 độ dung dịch dùng để nhuộm ống tế bào để đếm để phát Plecơ Dung dịch Cristal Violet( xem thêm ) Dung dịch dùng để nhuộm sống tế bào để đếm làm Trypsin hóa mơ Pha 0,1% dung dịch Cristal Violet 0,1N axit Nitric Tạo Huyết Thanh Ứng dụng dùng để thêm vào môi trường dinh dưỡng lượng định từ – 10% để tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh Điều chế : Lấy máu động vật thường Bê, Ngựa & người Cho vào lọ rộng cổ để tủ ấm 20 – 30 độ C cho máu đơng, sau dùng que tách máu đông khỏi lọ, đặt lọ vào tủ lạnh +4 độ C – ngày Chắt huyết li tâm 2000 vòng/phút 20 phút lọc lấy huyết qua lọc Seitz rót vào lọ hay ống đậy nắm cao su, thử vô trùng bảo quản tủ từ – 20 độ C Tùy mục đích sử dụng dùng tươi hay đun 50 độ C 30 phút trước dùng cần thử độc tính tế bào Chất làm nhũ hóa Liên quan đến chất béo chia nhỏ chất béo Dung dịch Glyxerin 15% H2O huyết ngựa bình thường khơng chứa chất bảo quản, dung dịch Sacarozơ 10% với Gelatinh 1% có PH 6,8 – dung dịch chứa glucozơ, lactozơ có 10 – 30% sữa Thủy phân tinh bột Nguyên lí : Dùng(H2SO4 HCl) với áp lực dư Dịch thủy phân thu trung hòa Na2CO3 NaOH Nếu dùng H2SO4 làm tác nhân thủy phân dùng CaCO3 nước vơi để trung hịa, sau lọc qua lọc ép khung với than hoạt tính để khử màu : Dịch thủy phân thường glucoza, lượng nhỏ aa, khốn chất đem làm đặc lại 60-70% để sử dụng dần • Dùng enzim : Bột gạo, bột ngô tách phôi men α amilaza hay β Amilaza, Bột đậu tương nguồn Nitơ kỹ thuật chứa 40% Protein 19% chất béo Axit amin Cách làm cao ngô Bắp Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Cách làm cao ngơ thường có màu nâu sẫm 150 kg hạt không mọt không mốc, rửa ngậm với 220l nước, máy tỉ lệ nước 1:1,3 thêm lít HCl 30% 1,2 kg Na2SO3 để làm dịch ngâm có PH = nồng độ SO2 có 0,25% ngâm 48 50 – 55 độ C Sau kết thúc dịch ngâm gia nhiệt tới 75 – 80 độ C dùng sữa vô lọc sạch, chỉnh PH – 8,2 để lắng 30 phút cho protein kết tủa Lọc qua lọc ép khung rữa bả nước nóng Dịch lọc nước rửa điều chỉnh PH HCl tới cô chân không 60 độ C tới 28 độ bé Thành phần lớp tạo phủ dùng để làm phương pháp plecơ : Dung dịch Earcle đặc 10 lần không chứa đỏ 18 ml Phenol Bica Nước cất vô trùng : 60 ml Huyết bê khỉ 3,6 ml NaHCO2 (7,5%) : 5,4 ml Đỏ trung tính (1:1000) : ml Penixilin : 18.000 đơn vị Streptomixin : 18.000 đơn vị Thạch phủ đảm bảo tế bào sống – 12 ngày • 2% thạch • Môi trường dinh dưỡng dung dịch Gey A đặc 10 lần 20% • Dung dịch Gey B đặc 10 lần 10% • Tris 0,2 M, PH = 7,6 đặc 10 lần 10% • 5% Lactoalbumin Hydrolisat 10% • Chứa 10% huyết bê • Đỏ trung tính 1:1000 • Nước cất 30% Dung dịch Gey B NaCl : 8g KCl : 0,375g Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào CaCl2 : 0,275g MgCl2 : 0,21g Na2HPO4 : 0,15g KH2PO4 : 0,025g Glucoza : 2g NaHCO3 : 0,25g Nước cất lần 1000ml có thêm đỏ Phenol làm chất thị màu, bảo quản nhiệt độ +4 độ C thời gian tháng Tách Enzim dùng muối trung tính kết tủa Sunfat amon [(NH4)2SO4] tỉ lệ 50 – 60 % dùng (Etanol, Izopropanol axeton) chiết nước nấm men cho 3-4 thể tích cồn vào thể tích nước chiết enzim để trách giảm hoạt tích enzim cần lạnh xuống – độ C khuấy mạnh, enzim kết tủa lắng xuống cần li tam cần rửa đến – lần ca độ cho vào bình hút ẩm máy sấy chân kh6ong sản phẩm thu dạng bột Chương : Nuôi cấy vi khuẩn Tóm tắt nội dung chương : hướng dẫn ni cấy vi khuẩn có lợi, ứng dụng vào sống, cách nuôi cấy vi khuẩn khác tương tự bạn tìm hiểu thêm trường hỏi người có chun mơn Bảng vi khuẩn ứng dụng vi khuẩn Vi sinh vật sản sinh Aerobacter cloal Amanita muscaria nấm khác Bacillus anthracis Bản chất sản phẩm trao đổi chất Polisacarit Muscarin Bacillus licheniforms Bacillus subtilis Các loài Claviceps Nước chiết thơ // Ecgotalcaloit Corticium caeruleum Fusarium oxysporum Nhiều lồi Fusarium Gibbrella Zea Ruglovasin A & B Axit Fusaric Caxit5-butylpicolinic Nước chiết thô Zlagenin Lactobacillus leichmannii Zearalenon Nước chiết thô Dịch lọc thơ nước chiết Hoạt tính Dược học Chống viêm tăng phó giao cảm Giống Eponefrin hoat tính tim mạch Giống ACTH // Phong bế adreneric kích thích trơn hoạt tính CNS Hạ huyết áp Hạ huyết áp Gây buồn nôn Gây hạ protein, gây động dục Gây động dục Giống ACTH Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Lenzites trabea Lentinus Edodes Lenzites trabea Naematoloma fasciculare Oospora-astringenes Oudemansiella radicata Nhiều loài Panaeolus Pellicularia filamentosa Penicillium convor ruglosum Penicillium corylophiloides Penicilium purpurogenum Penicilium Rugulosum Phialocepphala repens Psilocybe mexicana nấm khác Rhizoc tonia leguminicola Salmoella enteriditis Salmonella tiphi Serratia marcescens Nhiều loài Serratia Streptomyces allbire ticuli Streptomyces argenteolus Var.toyonakensis Treptomyces cacaoi Varasoensis Treptomyces caespitosus Treptomyces chartreusis Streptomyces grioseolus Streptomyces griseus Streptomyces hygroc picus Streptomyces kinoluteus Streptomyces lavendulae Streptomyces nigrifaciens Var.FFD-101 Streptomyces : noboritoensis Streptomyces : roseochromogenes Streptomyces roseus Streptomyces testaceus Streptomyces thioluteus Streptomyces Verticillatus Var Zynogenes Streptomyces EF-44-201 Rugulovasin A & B Lentysin Rugulovasin A & B Naemototin Oosponals oospo lacton, oospong lycol Oudenon Serotonin hydroxytriptophan Rugulovasin A & B Rugulovasin A & B Rugulovasin A & B Rugulovasin A & B // Phialoxin Psiloxin Hạ huyết áp Giảm lipit máu Hạ huyết áp Giảm động mạch vành Co Pepstatin Hạ huyết áp Co mạch Hạ huyết áp Hạ huyết áp Hạ huyết áp Hạ huyết áp // Chống đông Tăng hoạt động tâm thần Tăng phó giao cảm Giống ACTH // // Chống viêm Chống Plaxmin, chống viêm ức chế, men Trypsin Papainmen chống đông máu men khác Ức chế Pepxin Proteinnaza trung tín Chống viêm Pepstatin Leupeptin Proteinnaza trung tín proteaza Chimostatin Kinonaza B1 Proteinnaza Chimostatin Leupeptin Nigrifactin Ức chế pepsin Như stm.albireticuli Chống viêm Giống Insulin ức chế chimotripsin Chống viêm ức chế chimotripsin stm.albireticuli Chống hixtamin Leupeptin // Như stm.albiraticuli // Leupeptin Leupeptin Leupeptin Retikinonaza I & II Proteinaza trung tin thành phần S-PI Như stm.albiraticuli Ức chế Peptin Như stm.albiraticuli Chống Viêm Slaframin Nước chiết thô // // Proteaza(TSP) Leupeptin Ức chế pepsin Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Các lồi streptomyces Enzim Zygosporiu Masonii Zygosporium Mycophilum Penicillium chrysogenum Zygosporin A Zygosporin A Penixylin Streptomyces Erythryus Streptomyces Griseus Striptomyces erythreus Penixillium patulum Clavileps purpurea Tetraxiclin Streptomyxin Eritromixin Grizeofulvin Alcaloit nấm cựa gà : Ecgotamin, Ecgotoxin Propionibacterium Shermanii Vitamin(B12) corinoit Ca1v loại vi khuẩn xạ khuẩn nấm Steroit có cấu trúc thay đổi cách đặc hiệu nhờ vi sinh vật Acetobacter subboxy dans Dextran L-socboza (Tiền chất để tổng hợp axit ascorbic) Chất thay huyết tương Aspergllus niger Enzim Penixilium chryso genum Glucozooxydaza Escherichia coli Asparaginaza Streppiococcus spec Streptokinaza Bacillus subtilis Rhizpus spec Penixilinaza Lipaza Giảm nhóm Protein A & B máu Chống Viêm Chống Viêm Điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn, nấm virus // // // // Trong khoa sản (giúp vào việc co tử cung) điều trị bệnh mạch máu, bệnh nhứt đầu bên Điều trị thiếu máu ác tính Chế phẩm hoocmon Ví dụ để kìm hãm rụng trứng để điều trị viêm thấp khớp Tiền chất Vitamin C Leuconostoe mesenteroides Chuẩn đoán lâm sàn hóa sinh Chuẩn đốn bệnh đái đường Kiềm hãm khối u bệnh bạch cầu Điều trị bệnh mạch máu Loại trừ Penixilin Thuốc trị tiêu hóa Mơi trường nuôi dưỡng kháng sinh Penixilin Các chủng Penixilin : Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Penicyllum, Aspergllus Penicillum notatum, Pichrysogenum Môi trường nuôi cấy : 30g Lactozơ kỹ thuật, 3g NaNO3, o,5g KH2PO4, 0,25g MgSO4 0,2g C6H5Ch2CooH, 0,044g ZnSO4 Nước cất vừa đủ lít dùng NaOH điều chỉnh PH tới 5,5 Cấy chìm gam/lít: Cao ngơ : Glucozơ : Lactozơ : 0,5 Nitrat amol : 0,125 Sunfat Magie : 0,025 Sunfat Nitrat : 0,05 Kali Photohat monobazic : 0,2 CaCO3 : 0,5 Treptomixin Môi trường : Có glucoz ơ, bột đậu tương, cao ngơ, ngồi cịn có muối Amon, photphat CaCO3 điều chỉnh PH Giberelin Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 10 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Môi trường : Sacarozơ : 40 – 60 Tatarat amon : KH2PO4 : MgSO4.7H2O : 0,2 Hỗn hợp chứa nguyên tố vi lượng PH = 5,5 thêm 0,5 Cao ngô Eremothecium a shbyii Ashbya gossypii Giới thiệu chủng vi khuẩn tạo Ribolavin (hay gọi B12) Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 11 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào E.ashbyii có khuẩn ti dạng sợi kích thướt – x 60 – 80 Micromet Khuẩn ti có cấu tạo phân nhánh Giống sinh sản vơ tính bào tử, có hình đầu đầu nhỏ bào tử nang chứa – 10 bào tử nảy mầm phát triển thành khuẩn ti Trên môi trường thạch E.ashbii cịn non có màu trắng dần sang màu vàng già bị phân hủy, có màu vàng lục huỳnh quang (5 – 10 ngày cấy lần) Ashbya gosspii sống kí sinh nụ bơng, cafe, số khác, cấu tạo có hình thoi đầu dài tránh ánh nắng mặt trời nhiệt độ phát triển 28 độ C Môi trường E.ashbyii : Bã mía : 130 γ/gam Khơ hạt bơng : 1000 Khơ đậu tương : 2200 Khô lạc : 3500 Mầm đại mạch : 6000 Mầm thóc : 5000 Bã đậu : 3000 Có 5% đường vàng, 3% dịch thủy phân protein chưa tới Pepton 1% phơi mì, 0,3% cao thịt, 0,3 % cao thịt, 0,3% KH2PO4, 0,25% NaCl nước cất, PH = 6, ngày cấy lần nhiệt độ = 28 độ C Tetraxyclin Còn gọi Tetraxin, steclin, acromixin, polixiclin tạo phương pháp hóa học Clotetraxylin nuôi cấy xạ khuẩn Str.aureofaciens Môi trường nuôi cấy : Sacacroza : 2% Cao ngô : 0,24 Bột đậu tương : CaCO3 : 0,4 NaCl : 0,5 Rỉ đường : 0,2 Phương pháp chiết lấy chất từ vi nấm : Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 12 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào • Phương pháp ni cấy riêng rẻ khuẩn lạc môi trường rắn gelatin thạch (agar - agar) • Penixilin nhờ mốc màu xanh lục Penicillium notatum • Đối với sản phẩm chất hịa tan dung dịch ni cấy phải li tâm tách lấy phần dịch cho kết tủa, làm sạch, cho kết tinh trở lại sản phẩm nằm tế bào phải phá vỡ vỏ tế bào tiến hành tách làm pectinaza phân hủy pectin • Sự chuyển hóa Steroit tạo thành cortizol oxi hóa khơng hồn tồn tạo thành axit axetic sobboza để sản xuất axit ascorbic (Vitamin C), thành tựu trình ứng dụng sản xuất Cortizon, axit asscorbic(Vitamin C), axit glucomic tiền chất Aphidrin chất điều trị chứng viêm khớp số loại Vi khuẩn có lợi cho cơng mơi trường : Vi khuẩn dùng dầu mỏ làm thức ăn ứng dụng dùng để phân hủy dầu mỏ hay vệt dầu loang Achromabater, Alkigenes,Bacillus, Bacterium, Corynerbacterium,Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibria Chủng nấm men, nấm mốc : Acremonium, Aspergilus, Candida, Cyfromyces, Debaryomyces, Endomyces, Hansenula monilia, Penicillium, Scopuluriosis, Torulopsis Khuẩn Ty xạ khuẩn : Micromonospora , Mycobacterium Các chủng sử dụng Hydrocacbua : Candida lipolytica, Cointermedias, C.Tropicalis, C.Parasilops, S.guilliermondii Tên loại vi khuẩn gây bệnh: Phế cầu : Pneumococcus Lậu cầu : Conococcus Màn não cầu : Miningococcus Bruxela (Brucella) Micobacterium bền với axit Trực khuẩn than : Bacillus anthracis Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 13 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Vi khuẩn khí gây bệnh trực khuẩn đường ruột Các vi khuẩn influenxa Strepto Staphylococcus Tụ cầu khuẩn : Staphylococcus số cách đột biến : Treptomixin xạ khuẩn Streptomyces griseus gọi Actinomyces Streptomixin Đột biến nhờ tia tử ngoại Polysacarit sinh vật sinh ta thấy có dextran trùng hợp từ gốc glucoza, Levan trùng hợp từ Fructoza nhờ vi khuẩn Aerobacter Levanicum Pulalan trùng hợp từ Maltoza nhờ loại nấm tương tự nấm men Pullularia Pullulans Dextran Plysacarit vi khuẩn lactic có phân tử lượng 15000 – 50000000 liên kết gốc glucoza với mối 1,6 glucorit vi khuẩn sinh Leuconostoc mesenteroides Đột biến : Hợp chất chứa Nitơ Nitrozomety guanidin metyldicloroety lamin, nitrix, Hydroxylamin hay EtylametanSunfotnat Inozit rượu mạch vòng nguyên tử Chương : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào thực vật Về chương nhẹ VN cách viện sinh học VN làm hết nên nhắc lại đôi nét hoocmon Thực vật Hoocmon thực vật gồm có : Auxin, Giberilin, Xitokin kích thích mơ non phân hóa thành Cách thức : Trước hết dùng tổ hợp phá xenlulo Trypxin thành tế bào trần sau ni mơi trường dinh dưỡng tiếp đến xử lí hoocmon thành Hiện nét có nhiều tài liệu hoocmon thực vật GIới thiệu chất thành phần : • Giberelin tìm thấy việc phá ngủ hạt giống có tác dụng kích thích nẩy mầm hình thành đường lên men (lột bỏ vỏ hạt cho lên men) phân lập từ rễ cân lúa Von số khác, giống vi khuẩn Fusariummonilifome, Fusarium OxySprum có tất 38 loại : + A1 : C19H24O6 Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 14 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào + A2 : C19H26O6 + A3 : C19H22O6 + A4 : C19H24O5 A12 : C20H28O4 A38 : C20H26O6 Giberelin thúc xanh chóng chín cảm ứng hoa dứa Trên chương ni vi khuẩn có giới thiệu cấu trúc • Auxin hợp chất β-indolaxetic chứa phận sinh sản cối tham gia vào trình sinh trưởng nẩy mầm hạt giống hình ảnh minh họa : Chức : Auxin Ức chế hạt nảy mầm kích thích rụng • Xitokin (Cytokin) chất chiết suất tế bào bạch cầu động vật hay nhựa thực vật từ Limphokin Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 15 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Chức : Kích thích rễ cành giâm (chiết) kích thích thu tinh tạo hạt • Etilen : Ni cấy tế bào mơ thực vật (nhân giống vơ tính) kích thích sinh trưởng chồi non • Axit Abscisic Pha ngủ cho mầm hạt, củ khoai tây tạo không hạt Chương : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào động vật động vật hữu nhũ Tinh chế Phôi : Tinh chế mô phôi dùng rộng rãi thêm vào môi trường nuôi tế bào + Phôi gà có trống ấp 9-11 ngày lấy phơi cắt bỏ mắt, ,mỏ, chân, cánh, rửa dung dịch hanks cốc, dùng kéo cắt thật nhỏ hay nghiền nhỏ cho vào ống cho thêm vào thể tích dung dịch hanks chứa 100 đơn vị 1ml Penixilin Sterptomyxin Li tâm 30 phút, hút lấy nước tinh chế phôi gà 50% thử vô trùng thường lệ, bảo quản 12-20 độ C ống đậy nút cao su, trước dùng phải làm tan chảy li tâm 30 phút, tốc độ 2000 – 3000 vòng/ phút, hút lấy nước Đối với phôi người hay động vật khác tiến hành tương tự khác ngâm mô nghiền dung dịch hanks 30 phút tỷ ấm 37 độ trước li tâm Môi trường dinh dưỡng 5% Lactoalbumin hydrolysat Gọi tắt “LH” Đây môi trường, phổ cập dùng để nuôi tế bào thành phần gồm có : - Lactoalbumin Hydrolysat : 5g Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 16 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào - NaCl - : 0,85g Nước cất lần : 1000ml Trước tiên hòa tan NaCl vào nước cất Sau cho Lactoal bumin Hydrolysat vào lọc qua lọc Seitz rót vào lọ, đậy nút cao su hàn Parafin (là sáp nến hay sáp đèn cầy), thử vô trùng cách cấy vào canh than thịt Pepton thạch Saboureaud Lacoalbumin Hydrolisat thường dùng nồng độ 0,5% nên trước dùng phải pha loãng dung dịch mẹ 10 lần với dung dịch hanks hay dung dịch Earle Mơi trường Parker cịn gọi (199) Đây môi trường tổng hợp thường dùng để dưỡng tế bào sau gây nhiễm virus Điều chế môi trường Parker đặc 10 lần : - Chuẩn bị dung dịch riêng rẻ : + Dung dịch tính gam cho lít mơi trường L - acginin : 0,7g L - histidin : 0,2g L – Lizin : 0,7g Dl – Triptophan : 0,2g Dl – phenilalanin : 0,5g Dl – metionin : 0,3g Dl – axit glutamic : 1,5g Dl – serin : 0,5g Dl – treonin : 0,6g Dl – lơxin : 1,2g Dl – izolơxin : 0,4g Dl – valin : 0,5g L – Hydroxyprolin : 0,1g Glyxin : 0,5g Dl – axit asparaginic : 0,6g Dl – alfa – alanin : 0,5g (dl – α - alanin) Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 17 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào L – prodin : 0,4g L – glutamin : 1g Sodium axetat : 0,5g Các axit amin với sodium axetat câ sẵn hỗn hợp dạng bột cho vào môi trường theo trật tự nói sau + Dung dịch : Hòa 400mg L – lirozin 200mg L-xistin 200mg 0,075N HCl đun nóng lên tới 85 – 90 độ C Lắc mạnh khơng để sơi, sau để dung dịch vào nồi đun cách thủy nhiệt độ 37 độ C lắc cho tan hoàn toàn + Dung dịch : Axit Nicotinic : 25mg Amit axit nicotic : 25mg Piridioxin Hydroclorit : 25mg Tiamin Hydroclorit : 10mg Ribolavin : 10mg Calcium Pantotenat : 10 mg L – Inozit : 50mg Axit para aminobenzoic : 50 mg Cholin Clorit : 500mg Hòa tan tất 175 ml nước cất lần, lắc mạnh khuấy que thủy tinh cho nước cất lần thêm cho đủ 200ml Rót ống 2ml bảo quản - 20 độ C + Dung dịch : Sơ chế dung dịch với thành phần sau A : L – glutation : 10 mg L – Sytin Hydroclorit : 20 mg Axit Ascocbic : 10 mg Hòa tan 100 ml nước cất lần Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 18 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào B : Vitamin A : 20 mg Cồn etyl (95%) ml Tween 80 (dung dịch 5% 20ml nước ) Vitamin A hịa tan cồn etyl sau cho thêm tween 80 (axit oleic) Trộn dung dịch A B cho nước cất lần thêm vào cho đủ 200 ml cho thêm vào cho đủ 200ml cho thêm 1g Adeno Zintrifotfat Sodium (ATP) Chế xong rót dung dịch vào ống 10ml bảo quản -20 độ C + Dung dịch : Hòa 100mg biotin 75ml, nước cất lần cho thêm 1ml dung dịch 1N HCl để bảo quản bền cho nước cất lần vào cho đủ 100ml rót ống 1ml bảo quản -20 độ C + Dung dịch : Hòa 10mg axit folic (tinh thể) 100ml dung dịch Hanks, rót ống 1ml bảo quản - 20 độ C + Dung dịch : Hòa 20mg Vitamin D2 (Calciferol) , 40ml cồn etyl 90% cho thêm 40mg Cholesterin Để làm tan Cholesterin phải lắc mạnh khuấy que Sau cho thêm 60ml dung dịch 5% Tween 80 rót ống 5ml bảo quản -20 độ C + Dung dịch : 10 mg Vitamin E (alfatocaferol fotfat) Hòa tan 100ml nước cất lần rót ống ml bảo quản - 20 độ C + Dung dịch : 10 mg Vitamin K hòa 100ml nước cất lần, lắc mạnh đặt nồi cách tủy 37 độ tan hoàn toàn Rot ml bảo quản - 20 độ C + Dung dịch 12 Hòa 18 mg Guanin (Chlorit) 167 ml nước cất lần cho thêm 0,5 ml NH4OH đậm đặc cho nước cất lần thêm vào cho đủ 180 ml Đun sôi để nguội lại cho thêm nước cất cho đủ 180ml + Dung dịch 13 : Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 19 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Hòa 100 mg d-riboza 100mg α –dezoxyriboza 100 ml nước cất lần Rót ml vào ống bảo quản - 20 độ C + Dung dịch 14 : Hòa 100 mg nước cất lần hòa tan 40 mg axit adenilic : Rót ống 5ml bảo quản -20 độ C + Dung dịch 15 : Hòa tan 10 mg Fe(NO3)3.9H2O 100 ml nước cất lần Cho thêm giọt HNO3 đậm đặc Rót ống 2ml bảo quản -20 độ C Chế môi trường 199 đặc 10 lần dung dịch Hanks a Hòa tan 80 g NaCl 200 ml dung dịch cho thêm 30 ml dung dịch 12 30 ml dung dịch 13 Hòa tan vào hỗn hợp 4g HCl sau cho 2g MgSO4.7H2O b Trong bình khác hịa tan 0,6g KH2PO4 55 ml nước cất lần Hòa tan thêm 0,6g Na2HPO4 (khơng ngậm nước) hay 1,52g Na2HPO4.12H2O cho thêm nước vừa đủ 111ml Dung dich vừa chế đem trộn với dung dịch chế điểm a c Hòa tan riêng biệt 10g Glucoza (Dextrozơ không ngậm nước) 55 ml nước cất lần, cho thêm vào 20ml dung dịch 1% đỏ phenol trộn với hỗn hợp vừa chế bên d Trong bình riêng hịa tan hịa tan 1,4g CaCl2 không ngậm H2O 60ml lần dung dịch đem rót từ từ vào hỗn hợp trên, vừa rót vừa lắc mạnh để đề phịng kết tủa Ca3(PO4)2 khơng tan e Cho hỗn hợp vừa chế vào dung dịch chế sẵn : Dung dịch 2ml Dung dịch 1ml Dung dịch 1ml Dung dịch 5ml Dung dịch 1ml Dung dịch 1ml Dung dịch 13 5ml Dung dịch 14 5ml Dung dịch 15 2ml Nếu dung dịch rót sẵn vào ống với khối lượng nói sau rót vào hỗn hợp phải trán kĩ ống Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 20 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào f Cho dung dịch 10 vào hỗn hợp cho thêm nước cất vừa đủ 945ml g Cho vào hỗn hợp axit amin Natri axetat với khối lượng nói đơn dung dịch trộn cẫn thận tinh thể tan gần hết h Cho thêm 5ml hỗn hợp Penixillin Streptomixin chứa thứ 20000 đơn vị 1ml i Hỗn hợp vừa chế để tủ lạnh đêm j Cho thêm 10ml dung dịch nước cất lần vừa đủ 1000ml trộn cẩn thận Môi trường đặc 10 lần vừa chế đem lọc Seits với áp suất dương, thử vơ trùng, rót vào chai bảo quản độ C • Khi sử dụng pha lỗng 10 lần với nước cất lần Mơi trường Eagle (Igơn) Sau nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tế bào động vật bú sữa Eagle đến kết luận đa số loại tế bào cần 13 axit amin, sinh tố (vitamin) Glucozơ ion (Na, K, Ca, Mg, Fotfat, Clorat )và đề nghị môi trường phức tạp so với mơi trường 199 Cách chế : thường chế riêng dung dịch kết hợp lại trước dùng • Dung dịch : Dùng dung dịch hanks không chứa Glucozơ Bicacbonat Natri thiếu chất làm vơ trùng Sấy • Để chế 1000 ml mơi trường nuôi cấy chứa 10% huyết ngựa Trước dùng người ta trộn 84ml dung dịch với 6,1 ml dung dịch mẹ 10 ml huyết ngựa sau cho thêm dung dịch (Natri Bicacbonat) để đưa PH = 7,2 – 7,4, Mơi trường chế xong bảo quản ngày tủ lạnh, nhiên số liên kết khơng bền bị phá hủy nhanh Nuôi cấy tế bào lưỡng bội Môi trường : Eagle chứa 0,5% Lactoalbumin ủ độ, tế bào bắt đầu mọc thay mơi trường Phương pháp tách ADN Cấy tế bào lên môi trường thạch Hottinger Sau 18 chuyển sang bình cầu chứa 200ml môi trường Spizizen canh thang Hottiger với tỉ lệ 2:1 Ủ bình buồng ấm 37 độ C lắc liên tục, sau 18 tuổi cấy truyền sang 16 bình cầu khác có chứa 200ml mơi trường Những bình ni 19h Sau có tế bào cách li tâm 2,5 – 300 vòng / phút 30 phút rửa lần dung dịch sinh lí (0,14M NaCl + 0,014 Xitrat Na) Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 21 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Bắt đầu tách ADN phá hủy tế bào lizozim nguyên sinh chất phá hủy Dodesysunfat 1%, dùng phenol để tách Protein, lắc mạnh để 1,5 giờ, sau đem li tâm dùng Pipet hút lấy lớp Cho thêm ete với thể tích tương đương Lắc mạnh li tâm phút tốc độ 2000 vòng / phút, ADN nằm lớp cách ta tách ADN khỏi phenol Protein lớp bỏ cho vào cồn Etylic để kết tủa ADN dùng đũa thủy tinh để trộn ADN Phá hủy ARN ARN – AZA (50 γ/ml) trước đem đun ARN aza nồi cách thủy 90 độ C để phá hủy ADN- aza hòa tan 0,15 M NaCl, ủ với ARN- aza 30 phút nhiệt độ 37 độ C sau xử lí ADN 80% Phenol nhiệt độ 37 độ C 30 phút li tâm 10 phút Hai lần xử lí etylic, ADN bảo quản cồn 70 tủ lạnh Nồng độ ADN ADN (γ/ml) = ((E270 – E290).10,1a )/0,19 E : quang học a: độ loãng Bảo quản sinh vật phương pháp đông lạnh -15 độ C : – 20 độ C -20 độ C : - 30 độ C Để tăng khả sống sót cần thêm chất hóa chất keo bảo vệ hỗn dịch : sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, Pepton muxin hay loại đường, chất làm nhủ hóa dung dịch glyxerin 15% nước huyết ngựa ngựa bình thường khơng chứa chất bảo quản, dung dịch Saccaroza 10% với Gelatin 1% có PH 6,8 – dung dịch chứa Glucoza , Lactoza có 10 – 30% sữa 13 axit amin : Glutamin, Lơxin, Izolơxin, Valin, Fenillamin, Alginin, Lizin, Hystidin, Triptophan, Metionin, Treonin, Xistin, Tirozin Sinh tố B (Vitamin) Tiamin, Calci Umpatotenat, axit Nicotinic, Biotin, cholin, axit-folic, Piridoxal Tế bào mọc tốt sinh tố B dạng Coenzin : Adenozindifotfat (ADP), Adnozintrifotfat (ATP), Coenzim A Dung dịch bảo quản mô phơi Cho mẫu mơ vào bình vơ trùng đựng mơi trường gồm 0,5% Hydrolisat lactoalbumin,, 5% huyết bê kháng sinh B (100 μg/ml, erytromixin 100 μg/ml), Tetraxilin (15 μg/ml Micostatin 100 μg/ml) nước muối đệm Hanks đưa đến phịng thí nghiệm để tách tế bào Cách tính thơng dụng Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 22 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào γ : khối lượng tế bào vi khuẩn khô tạo từ 100g Glucoza G : tốc độ phát triển tính phút Milimol oxy/phút = ((3333)/ γ).41,8G Nếu muốn sản xuất 40g/l tế bào khơ vi khuẩn khí chứa cacbon 50% khối lượng biến đổi 50% cacbon có chất chất phải chứa ((40 x 50 )/100) x (100/50) = 40g (cacbon) Nếu dạng cacbon cung cấp dạng Glucoza công thức môi trường 40 x (180/72) = 100g (Glucoza) Bổ sung thêm số thơng tin cịn thiếu dung dịch : Tween : 40 Polyoxyetilen – socbitan – monopalmitat Tween : 60 polyoxy etylen - socbitan – MonoStrearat Ax amino axetic : gọi Glyxin hay glycocol Ion kim loại : Ca(HCO3)2 + 2NaR = CaR2 + 2NaHCO3 Formol : 2CnH2n+1OH + O2 2Cn-1H2n-1CHO + 2H2O Ax α amino glutaric (ax glutamic) Biotin : vitamin H Lizin : Axit α, β – dimironic Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 23 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào CaSO4 + 2H2O : Thạch cao sống CaSO4 : thạch cao khan Hàn the (borax) : Na2B4O7 Rỉ đường nhiều sắt thêm K4[Fe(CN)6] 4Fe+++ + 3[Fe(CN)6] Fe4[Fe(CN)6]3 Note : Để làm ống hút tế bào bạn kiếm ống hút nhỏ giống ruột viết bút bi, sau canh đốt giữ giữ nhiệt đột vừa đủ nóng bạn từ từ kéo đầu ta có ống hút cỡ nhỏ dùng để tách, hút tế bào Về khoa học người vào điểm cụt lẫn quẫn chưa có khám phá mới, bạn học môn sinh nghe qua phương pháp sinh sản vơ tính chả khác với nơi cấy mơ phơi ta có tế bào(trứng) sau hút nhân tế bào chuyển qua nhân tế bào đem nuôi cấy cho đế phá triển Khi cịn nhỏ có nghe qua nhà khoa học phương tây khám phá phương pháp nuôi tim gà giữ nhịp đập phịng thí nghiệm tới 12 năm, ông ta chết người phụ tá ơng ta cố tính phá tồn phịng thí nghiệm ơng ta tồn cơng trình nghiên cứu trái tim gà bị thiêu trụi làm cho giới khoa học luyến tiếc Với khoa học giữ trái tim người động vật -24 thơi Tơi mong bạn u thích mơn sinh VN khám phá nhiều điều kì bí mà giới khoa học chưa khám phá ra, chia kiến thức để nước VN ta phát triển mạnh lĩnh vực công nghệ Tổng kết: nội dung nuôi cấy tế bào : cần phải tiệt trùng tất lọ đựng khơng có máy móc đại, đèn tia cực tím dùng phương pháp thủ công : ngâm chai lọ chuẩn bị cho ni cấy dung dịch axit lỗng đun sơi, sau cho vào dung nồi chứa nước cất đun sơi tiếp Cịn dung dịch ni cấy tế bào khơng q chua q kiềm giữ PH ổn định 7,2 – 7,4 Và phải lắc để trách tế bào lắng xuống đáy mà chết Lời Kết : xin giới thiệu bạn phương pháp làm suốt(vơ hình) vật thể(Xác động vật) gọi tiêu Cách làm Tiêu (làm xác chết suốt dung dịch) có chiết suất sau ngâm xác chết động vật vào ete-metylic axit Salixilic vật chất trở nên suốt Spantegonxer (Người Đức thí nghiệm), lưu ý ta đem xác vật y cũ mà không bị tan hay bị rữa nha, suốt ta đặt xác vật vào dung dịch Và người ta tạo áo tàn hình nhờ cơng nghệ nano tán ánh sáng, hy vọng đọc ebook trở thành người thành cơng có nhiều thành tựu Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hồng Duy 24 2011 Kỹ thuật ni cấy tế bào Lê Hoàng Duy Tài liệu chia miễn phí diễn đàn Khotien.vn Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 25 ... sấy chân kh6ong sản phẩm thu dạng bột Chương : Nuôi cấy vi khuẩn Tóm tắt nội dung chương : hướng dẫn ni cấy vi khuẩn có lợi, ứng dụng vào sống, cách nuôi cấy vi khuẩn khác tương tự bạn tìm hiểu... Khotien.vn | Tài liệu viết Lê Hoàng Duy 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Penicyllum, Aspergllus Penicillum notatum, Pichrysogenum Môi trường nuôi cấy : 30g Lactozơ kỹ thuật, 3g NaNO3, o,5g KH2PO4,... hạt • Etilen : Nuôi cấy tế bào mô thực vật (nhân giống vơ tính) kích thích sinh trưởng chồi non • Axit Abscisic Pha ngủ cho mầm hạt, củ khoai tây tạo không hạt Chương : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào