BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÀI BÁO CÁO Chủ đề 27: CÂY SINH DÒNG VIRUS PRRS Giáo viên hướng dẫn : TS.NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: LUYỆN THỊ NGÂN Lớp: DH06SH MSSV: 06126089 Thành phố Hồ Chí Minh I.Đặt vấn đề: -PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) gây hội chứng rối loạn sinh sản heo hay gọi bệnh heo tai xanh, gây thiệt hại nghiêm trọng cho kinh tế nước giới Hiện có vaccine, nhiên vaccine khơng có khả bảo hộ cho heo Người ta phát thấy virus PRRS có đột biến cao, tạo nhiều chủng có độc lực khác nhau, khó để kiểm sốt dịch bệnh Do đó, để hiểu rõ chủng virus PRRSV, người ta xây dựng sinh dịng cho virus này,nó cần thiết cho việc xác định nguồn gốc, lan truyền tiến hóa virus PRRS II Tổng quan II.1.Giới thiệu virus PRRS II.1.1 Lịch sử phát virus PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp heo virus thuộc nhóm Arterividae có khả xâm nhiễm vào đại thực bào vào mô Các đại thực bào với "chân giả" có tác dụng bắt giữ tác nhân gây bệnh vi khuẩn, virus tiêu diệt chúng (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) -Năm 1987 bệnh ghi nhận lần Mỹ , vào thời điểm đó, chưa xác định nguyên bệnh nên gọi “bệnh bí hiểm lợn” (MDS) Khi bị virus phá hủy, đại thực bào khơng cịn "chân giả", khả bắt giữ tiêu diệt tác nhân gây bệnh (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) -Tháng năm 1991 Tây Ban Nha phát trường hợp lâm sàng đàn heo nhập Ở Hà Lan bệnh báo cáo -Tháng năm 1991 Bỉ xuất bệnh -Tháng năm 1991ở An ghi nhận trường hợp -Tháng 10 năm 1991 Pháp, trận dịch xảy Britany -Tháng năm 1992 Đan Mạch dịch bệnh xuất - Năm 1992, Hội nghị quốc tế bệnh tổ chức St Paul, Minnesota trí dùng tên PRRS Tổ chức Thú y Thế giới công nhận -Collin cộng tác viên (1992) người xác định nguyên PRRS, ông gây bệnh thực nghiệm cách gây nhiễm heo qua đường hô hấp từ mẫu mô heo bệnh địa phương -Khoảng năm sau đó, Viện Nghiên cứu Thú Y Trung ương Lelystad (Hà Lan) phân lập virus từ đại thực bào phế nang heo bệnh gọi virus Lelystad (LV) -Khơng lâu sau đó, nhà nghiên cứu Mỹ phân lập virus liên quan đến bệnh đặt tên VR-2332 Họ phân biệt khác LV VR-2332 mặt kiểu gen kiểu hình Bên cạnh khác biệt quan trọng LV VR-2332 chủng virus Bắc Mỹ đàn heo thời điểm có khác -Năm 1994 PRRSV thức phát 16 quốc gia thuộc Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Á -Năm 1997 Ở Việt Nam, bệnh phát đàn lợn nhập từ Mỹ -Tháng năm 2006 Trung Quốc xảy đại dịch PRRSV, triệu heo mắc bệnh, 400000 heo chết Người ta xác định có biến chủng PRRSV thành chủng độc lực cao, lây lan gây chết nhanh heo II.1.2 Kích thước hình thái học virus PRRS -Những nhà nghiên cứu chứng minh rằng, virus PRRS có quan hệ gần mặt sinh vật học, cấu trúc, gen với virus gây viêm động mạch ngựa (equine arteritis virus-EVN ) , virus gây tăng enzyme khử hydro lactate ( lactate dehydrogenase elevating virus-LDV) chuột virus gây sốt xuất huyết khỉ (simian hemorrhagic fever virus-SHFV) Theo nguyên tắc dựa đặc tính chung , virus PRRS, EVA SHFV xếp chung nhóm thuộc chi Arterivirus , họ Arrterividae , Nidovirales -Virus PRRS có vỏ bọc với đường kính 50-60 nm, bề mặt nhẵn có lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25-35 nm GP : protein màng (glycoprotein) M : protein gian màng (a membrane-spaining protein) N : protein capsid (nucleocapsid protein) E : protein vỏ ngồi Hình 1: Hình gen PRRSV II.1.3 Tổ chức gen virus PRRS -Bộ gen vius PRRS tương tự với Arterivirus khác Virion chứa acid nhân RNA 15.1kb, dạng thẳng, sợi, poly adeny (PolA) đầu dương -Bộ gen chứa tám vùng đọc mở mã hóa cho protein đặc hiệu virus ORF1a ORF1b chiếm 12kb Ở đầu 5’ gen mã hóa cho protein liên quan đến việc mã hóa RNA dịch mã, bao gồm RNA polymerase phụ thuộc RNA, lại 3,5kb nằm đầu 3’ gen chứa ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 ORF7 mã hóa cho protein cấu trúc virus Hình 2: Mơ hình protein cấu trúc PRRSV II.2 Nguyên lý chung phương pháp PCR PCR phương pháp nhân nhanh đoạn phân tử DNA ống nghiệm Đây kỹ thuật nhằm tạo hàng triệu đoạn DNA đồng từ hỗn hợp phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA khơng có chức DNA có chức di truyền Người ta cịn gọi kỹ thuật tạo dòng DNA invitro Ngày PCR dùng phổ biến nhiều lĩnh vực sinh học PCR thực sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm trình tự sau : Bước 1: Biến tính (Denature) Giai đoạn thực nhiệt độ cao (94 - 95o C) vòng 30 giây đến phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách hồn tồn thành mạch đơn Chính mạch đơn đóng vai trị mạch khn cho tổng hợp mạch bổ sung Bước 2: Bắt cặp (Annealing) Phản ứng primer tác động lên dây nền, primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã dây template để có phân tử DNA Ở giai đoạn nhiệt độ hạ thấp đến mức cho phép primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ dao động khoảng 30 – 70oC, kéo dài khoảng 30 giây đến phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) primer sử dụng Bước 3: Kéo dài (Extension) Đây giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ - 3’ primer nhờ hoạt động polymerase Nhiệt độ tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Hình 3: Nguyên tắc phản ứng PCR Nguyên tắc phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen quan tâm primer chuyên biệt kết hợp với hoạt động enzym chịu nhiệt polymerase Taq DNA polymerase chu trình nhiệt hợp lý Tác động primer xem yếu tố đánh dấu cho hoạt động polymerase gắn kết vào DNA mạch đơn làm khuôn giai đoạn bắt cặp Primer bên trái tác động dây DNA 3’ - 5’ gọi forward primer, kí hiệu F Primer bên phải tác động dây 5’ - 3’ gọi reverse primer, kí hiệu R Sự xếp đảm bảo vùng bị can thiệp tăng cường hoạt động, theo trình tự nói Tóm lại, primer kết hợp với sợi DNA đối lập điều kiện khoảng cách kích hoạt, đoạn DNA khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase II.3 Nguyên lý chung phương pháp RT-PCR Về nguyên lý, kỹ thuật RT-PCR giống kỹ thuật PCR thơng thường nhằm mục đích khuếch đại đoạn gen từ khn RNA thay DNA Trong kỹ thuật có hai giai đoạn khuếch đại thực hiện: giai đoạn đầu trình tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu sợi RNA giai đoạn sau trình tổng hợp DNA từ khn mẫu sợi cDNA vừa tổng hợp Khác với kỹ thuật PCR sử dụng enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide, kỹ thuật RT-PCR có tham gia hai loại enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzym phiên mã ngược enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide Do enzym reverse transcriptase chịu nhiệt nên trình phiên mã ngược đẻ tổng hợp cDNA thường phải thực nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-45 oC) II.4.Nguyên lý chung phương pháp nested PCR Kỹ thuật nPCR phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR Trong kỹ thuật này, có hai cặp primer khác sử dụng để nhằm khuếch đại đặc hiệu đoạn gen phản ứng PCR phải thực hai lần Lần đầu, phản ứng PCR thực 15-30 chu kỳ, với cặp mồi thứ Cặp mồi thứ nhất, lần chạy PCR thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài đoạn gen cần xác định đoạn gen cần xác định nằm đoạn gen khuếch đại lần Sản phẩm PCR lấn 1, sau mẫu cho PCR lần Cặp mồi thứ hai bắt cặp phía (nested) sản phẩm PCR lần Phản ứng PCR lần sau khuếch đại đoạn gen cần xác định Hình 4: Nguyên tắc phản ứng nested PCR II.5 Nguyên lý phương pháp RT-nPCR ống Sử dụng film plastic, cho phép phiên mã ngược nested PCR ống hỗn hợp phản ứng cho phăn ứng khuếch đại PCR lần hai cách ly nắp ống phăn ứng suốt chu kỳ khuếch đại phận film plastic sau đưa vào phản ứng PCR từ chu kỳ phản ứng băng ly tâm không mở nắp phản ứng Thuận lợi chủ yếu phương pháp độ nhạy cao, độ chuyên biệt cao, đơn giản, hiệu quả, nguy tạp nhiễm thấp dễ dàng việc thiết lập điều kiện nested PCR Phương pháp thích hợp cho việc phát mục tiêu III Phương pháp tiến hành: III.1.Ly trích RNA -RNA ly trích từ 250 µl huyết từ 20-50 mg mô, sử dụng kit ‘ Total RNA Prep Plus’ Sau ly trích, RNA tách rửa với 100 µl nước khơng Rnase -Tồn RNA sử dụng làm khuôn phản ứng RT-nPCR ống đặc biệt cho ORF5 EU-PRRSV III.2.Thực phản ứng RT-nPCR ORF5 Bước 1: µl trehalose 22 % sử dụng để bảo quản trì hỗn hợp bên dung dịch ống Eppendorf 0.2 ml: 20pmol cho mồi (inners) ORF5F(5'ATGAGATGTTCTCACAAATTGGGGCG3') ORF5R(5'CTAGGCCTCCCATTGCTCAGCCGAAGT3') (Suarez et al., 1996 ) µl dNTPs (10 mM) 25 µl Taq Polymerase (1·25 U, Fermentas, Vilnius, Lithuania) -Để bảo quản ống sấy khơ khoảng 2h nhiệt độ phòng Bước -Tiến hành phản ứng RT-PCR đáy ống chứa chất làm khô, sử dụng chất phản ứng xử lý trehalose nắp ống Eppendorf Sự khuếch đại thực 50 µl thể tích có chứa: µl RNA chất phản ứng sau: µl 10x PCR buffer [100 mM Tris–HCl (pH 8·8) 500 mM KCl], 0·8% Nonidet P40 (Fermentas) µl MgCl2 (25 mM, Fermentas) µl dNTPs (10 mM, Sigma) pmol cho mồi outer EUORF5B (5' CAATGAGGTGGGCIACAACC 3') EUORF5C (5' TATGTIATGCTAAAGGCTAGCAC 3') (Oleksiewicz et al., 1998 ) µl 10% Triton X-100 (Sigma) 0·5 µl (2·5 U) Taq DNA polymerase (Fermentas) 0·25 µl (10 U) RNasin (Promega) 0·5 µl (100 U) MMLV phiên mã ngược -Dầu khống tính đến để hoạt động vật cản nước phản ứng RT-PCR chất phản ứng làm khô nắp ống Eppendorf Sau đó,những ống bắt buộc phải trải qua chu trình nhiệt sau: 42 °C 30 phút 95 °C phút -Sau 20 chu kỳ ở: 94 °C phút 55 °C phút 72 °C 1.5 phút -Tiếp sau đó,những ống nghiệm đảo ngược vài lần để hòa tan chất phản phản ứng khô nắp để bắt đầu phản ứng nestedPCR Những ống nghiệm sau ly tâm trước trở lại chu trình nhiệt phản ứng nestedPCR Bước 3: Phản ứng nestedPCR tiến hành 35 chu kỳ với chu trình nhiệt sau: 94 °C phút 55 °C phút 72 °C 1.5 phút -Một bước kéo dài 72 oC for 10 hồn thành q trình khuếch đại.Sản phẩm cuối khuếch đại 606 bp III.3.Thực phản ứng RT-nPCR ORF7 -Từ RNA chọn lọc, ORF7 khuếch đại µl RNA trộn với 8.25 µl nước, µl 5X MMLV RT buffer, µl dNTPs( 10mM loại), 0.5 µl MMLV, 0.25 µl Rnasin µl hexanucleotide ngẫu nhiên(100ng) 10 -Dầu khống thêm vào để hoạt động vật cản nước -Để tiến hành phiên mã ngược, hỗn hợp ủ 370 C 10 phút -5 µl cDNA tổng số khuếch đại phản ứng RT-PCR thể tích 50 µl : 28.8 µl nước, 10 µl 5x dung dịch đệm phản ứng Taq polymerase, µl 25 mM MgCl2, µl dNTPs, U Taq Polymerase (Fermentas) 20 pmol primer: 5' GCCCCTGCCCAICACG 3' 5' TCGCCCTAATTGAATAGGTGA 3' (Oleksiewicz et al., 1998) -Chu trình nhiệt thực 35 chu kì với chu trình nhiệt sau: 94 oC 15 giây 52oC 30 giây 72 oC 30 giây -Một bước kéo dài 72 oC 10 phút hoàn thành trình khuếch đại Kích thước mong chờ ORF7 khuếch đại 637 bp III.4.Phân tích trình tự nucleotide Để giải trình tự,những sản phẩm PCR chạy điện di gel agar 1.5% Sau nhuộm ethidium bromide khử muối nước siêu lọc(ultafiltered water) - Kích thước băng mong muốn cắt bỏ từ gel, sử dụng dụng cụ máy lọc quay trịn 0.45 µm Ultrafree-MC để phục hồi DNA, sản phẩm PCR tinh đươc giải trình tự kit BigDye Terminator Cycle Sequencing máy giải trình tự ABI310 -Trình tự từ hai sợi ORF5 sản phẩm PCR xác định với mồi giống mồi dùng cho phản ứng khuếch đại nestedPCR -Trình tự ORF7 xác định mồi R133(5' TCGCCCTAATTGAATAGGTGACTC 3') F132 (5' GTGCTGGGCGGCAAACGAGCTGGT 3'),(Drew et al.1997 ) Những trình tự tập hợp việc sử dụng SeqMan (Lasergene program package DNASTAR Inc) Phản ứng RT-nPCR chiến lược giải trình tự mơ tả cho phép việc xác định phần trình tự ORF5 (432 nucleotid tương ứng từ vị trí 97-528 ORF5) tồn trình tự ORF7 Tất trình tự ghi nhận nghiên cứu đưa vào ngân hàng gen 11 Table Sequence summary 12 -CLUSTAL X dùng để xếp trình tự tỉ lệ đồng hóa/dị hóa ước lượng với TREE-PUZZLE 5.0(tỉ lệ biểu diễn biến đổi qua lại nucleotide trình tự) Những tỉ lệ sử dụng để đưa vào chương trình DNADIST gói (package) PHYLIP để thành lập khoảng cách di truyền, ước lượng cho số lượng nucleotide thay cho vị trí, cặp trình tự Những tính tốn DNADIST dựa vào mơ hình thay F48, đồng hóa dị hố xuất tỉ lệ khác Dựa vào khoảng cách chất (matrix), sinh dòng xây dựng phù hợp với phương pháp Fitch-Margoliash, dùng chương trình DNADIST gói PHYLIP.Độ tin cậy việc lấy mẫu thực 100 liệu để đánh giá giới hạn tin cậy mơ hình nhánh IV Kết IV.1.Cơ sở địa lý cho đa dạng PRRSV Châu Âu -Tổng số 22 trình tự ORF5 khơng hồn chỉnh đại diện cho dịng PRRSV gây bệnh xác định: 15 từ Ba Lan, từ Đức, từ Anh từ Lithuania Hơn nữa, hai vaccin nhược độc chủng Châu Âu dùng , Porcilis PRRS (Porcilis PRRS > 86-98%,) Pyrsvac183 giải trình tự Dựa vào 24 trình tự ORF5, trình tự ORF5 chủng Châu Âu chọn lọc có sẵn ngân hàng gen, sinh dòng xây dựng Cây sinh dịng cho thấy nhóm kín trình tự từ Netherland, Anh, Pháp Belgium gần trình tự ORF5 Lelystad ngun thủy Nó đại diện dòng Hà Lan phân lập từ năm 1991 Tất trình tự nhóm kín giống Lelystad (Lelystad-like) từ năm 1991-1992 Một vài nhóm nhỏ khác sinh dịng giải thích dịch tể học: Ví dụ: PL9 PL11 từ nơng trại có trao đổi heo LT2 LT4 từ hai nông trại gần mặt địa lý PL2,PL7 PL15 từ nông trại khác biệt thời gian -Một vài nhóm khơng có giải thích rõ ràng mặt địa lý không mặt thời gian mặt dịch tễ học Ví dụ: nhóm có chứa ES1 (Tây Ban Nha, 1992) PL12 (Ba Lan, 2000) 13 Fig 5:Phylogenetic tree of EU-type ORF5 sequences The tree was made with the FITCH program of the PHYLIP package -Những trình tự từ Tây Ban Nha, Đan Mạch, Cộng Hịa Czech Ý khác biệt từ nhóm kín giống Lelystad, ghi nhận trước Bởi vài trình tự củaTây Ban Nha, trình tự đơn Đan Mạch Ý thu năm 1991-1992, điều nước khác chứa chủng PRRS khác thời điểm Tuy nhiên, việc xác định 14 trình tự dịch bệnh xuất nước Châu Âu cần thiết để xác định trình tự chung, Đan Mạch, Ý Tây Ban Nha.Ở Ba Lan, PRRSV phát sớm vào năm 1994, trình tự bắt nguồn từ dịch bệnh bùng nổ Ba Lan gọi Bie94 Bei94 khơng nhóm với nhóm giống Lelystad (Lelystad-like) , khơng nhóm với ‘Lek’, nhóm phân lập khác Ba Lan từ 1994 Do đó, xuất quy luật chung, dựa vào trình tự từ Nhật Bản, Ý, Đan Mạch Ba Lan, nhiều nước Châu Âu khác có dịng PRRS khác lúc dịch bệnh bùng nổ, mà đa dạng di truyền PRRS Châu Âu có sở địa lý Điều quan trọng, sở địa lý khơng thể giải thích tiến hóa tổ tiên chung PRRS dòng Châu Âu sau dịch bệnh bùng nổ.Những PRRS phân lập khác có xuất độc lập phần lớn xuất đồng thời nước Châu Âu khác (hình 1: so sánh NL1, ES1, ES2, DK1, IT1, tất từ năm 1991-1992, PL1 PL2 từ năm 1994) IV.2.Trình tự PRRS Lithuania đa dạng khác thường -Dựa vào hình thức phân tích đơn giản nhất, việc xem xét tỉ lệ nucleotide giống từ hai trình tự Châu Âu khác biệt liệu ‘Nie’ từ Ba Lan-PL9 ‘Aus’ từ Lithuania-LT1 ‘Nie’ ‘Aus’ cho thấy có 71.5% nucleotide giống chúng Ngoại trừ trình tự Polish Lithuania từ liệu, trình tự Châu Âu khác biệt ‘2156’ (IT1’ ‘Olot/91’ (ES1), chúng có 82.4% nucleotide giống Do đó, trình tự Polish Lithuania mở hiểu biết vùng đa dạng PRRS chủng Châu Âu -Khi việc phân tích bị giới hạn trình tự từ năm 2000, hai trình tự khác biệt liệu ‘Sid’ từ Lithuanian ‘Krz’ từ Ba Lan (LT2 LT3) ‘Sid’ ‘Krz’đã cho thấy có 72.2% nucleic acid giống chúng Tuy nhiên, trình tự Lithuania dường khác so với trình tự kiểu gen Châu Âu khác ghi nhận trước ( LT1-LT4) Xa hơn, đa dạng cao trình tự Lithuanian vài trình tự Châu Âu khác IV.3.Dấu vết phân tích trình tự tổ tiên chung cho kiểu gen Châu Âu Châu Mỹ -Để thấy trình tự khác biệt từ Lithuanian đặt phả hệ EU-US PRRSV, sinh dòng xây dựng Hơn bao gồm chọn lựa trình tự ORF5 từ 15 nước châu Âu nghiên cứu nay, bao gồm Lithuania, 64% giống mức độ nucleotide 70% mức độ amino acid so với trình tự US-ORF5, hiểu rõ chủng virus đa dạng khác thường Lithuania liên kết phía nhánh EU-US Kiểu nhánh có hỗ trợ độ tin cậy cao Để nghiên cứu xa điều phát này, chúng tơi xác định tồn trình tự ORF7 cho PL8, PL9, LT1, LT2 Một sinh dòng dựa vào trình tự ORF7 chứng minh kiểu nhánh tìm thấy cho bảng phả hệ ORF5 có hổ trợ độ tin cậy thấp Kiểu nhánh giống quan sát chung cho ORF5 ORF7 ngoại trừ khả vị trí mẫu Lithuania kết tái tổ hợp tổ tiên chủng Châu Âu Châu Mỹ PPRSV Nhánh sinh dịng trình tự ORF5 trình tự ORF7 chứng minh giá trị độ tin cậy cao, đề nghị trình tự châu Âu giống US-PRRSV EU-PRRSV 16 Fig 6: Phylogenetic trees of EU-type and most diverse of US-type PRRSV sequences The large tree (A) depicts the phylogenetic relationship of the ORF5 sequences The small tree (B) was based on the ORF7 sequences V.Thảo luận: -Từ dịch bệnh bùng nổ năm sau thập niên 80, PPRSV tiếp tục nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nông trại heo 17 Ở Bắc Mỹ, bùng nổ dịch bệnh gần PRRSV khơng điển hình đề nghị trách nhiệm với bùng nổ dòng PRRS , việc chống lại vaccin dường không cung cấp bảo hộ Về mặt lý thuyết, viễn cảnh không bị giới hạn Bắc Mỹ, kiến thức đa dạng di truyền EU-PRRSV cải thiện điều kiện đánh giá trường hợp tương tự có khả xảy Châu Âu Dự đốn bao gồm nước Đơng Âu cộng đồng Châu Âu có liên quan cách đặc biệt khía cạnh này, liệu có giá trị đưa giả thiết Nga Cộng Hịa Séc có chủng PRRSV mà có khác biệt so với phát nước Châu Âu khác Cho đến hay lúc đó, số lượng trình tự ghi nhận từ Cộng Hịa Séc có liên hệ thấp với trình tự Nga nên hiểu biết chưa đưa vào sở liệu chung Vì thế, nghiên cứu đảm bảo khám phá xa đa dạng trình tự PRRSV Đơng Âu việc phân tích trình tự PRRSV từ Ba Lan Lithuania Khám phá nghiên cứu Lithuania có dịng PRRSV đa dạng khác thường Tất bốn trình tự huyết heo Lithuania lấy từ sản phẩm RT-PCR Theo ý kiến chúng tơi, điều làm giống trình tự Lithuania lấy từ toàn virion PRRSV Chúng tơi lấy trình tự virus trực tiếp từ trình tự hai sợi sản phẩm PCR khơng tạo dòng để giảm tối thiểu việc tạo Taq nhân tạo Tuy nhiên, có ngạc nhiên lớn trình tự Lithuania, chúng tơi tiến hành thêm đối chứng để điều tra RTPCR kế hoạch giải trình tự: -Đầu tiên, lặp lại RT-PCR giải trình tự mẫu huyết chọn lọc xác định trình tự DNA -Bước thứ hai: giải trình tự ORF5 ORF7 cho virus Lithuania, thu nhóm sinh dịng xác định Xa hơn, đánh giá đa dạng PRRSV Lithuania giống với đa dạng dòng PRRSV Nga, trình tự nucleotid ORF7 có khác biệt tới 16% so với virus Lelystad ghi nhận -Những trình tự Lithuania cho thấy có ngạc nhiên lớn kiểu nhánh bất thường sinh dịng EU-US Trong đó, chúng dường có nguồn gốc từ trình tự tổ tiên giống Châu Mỹ (US-like) thấy trước Châu Âu Sự giải thích chứng minh quan sát kích thước protein ORF7 PRRSV Lithuania (124 residues) trung gian kích thước protein ORF7 chủng Châu Âu (128 residues ) chủng Châu Mỹ (123 residues) (hình 3b) Tuy nhiên, trình tự ORF7 Lithuanian cung cấp ví dụ đa hình kích thước xảy protein ORF7 dòng PRRSV phân lập 18 chủng Châu Âu Khám phá có liên quan rõ ràng, ví dụ: sử dụng kích thước ORF7 sau phản ứng RT-PCR để phân biệt chủng virus -Trong đoạn ORF5 giải trình tự, chúng tơi phát vài dịng EU-PRRSV có 71.5% nucleotid giống (PL9 LT1) -Những nghiên cứu đa dạng di truyền EU-PRRSV bao gồm số lượng phân lập lớn từ tất nước Châu Âu ưu tiên giai đoạn từ năm 1991 (virus Lelystad phân lập PRRSV phân lập đầu tiên) đến Rõ ràng, điều khơng thể thực Do đó, việc mơ tả đa dạng trình tự EU-PRRSV phát triển dần dần, có liên tiếp nhiều nghiên cứu bổ sung Nghiên cứu tính đa dạng chủ yếu Châu Âu, dòng PRRSV chủng Châu Âu bổ sung vào tính đa dạng EU-PRRSV nghiên cứu trước (Suarez et al., 1996 ; Oleksiewicz et al., 2000 ; Indik et al., 2000 ; Forsberg et al., 2001 , 2002 ) Hướng mơ tả dường cho thấy dịng PRRS thay đổi khác đặc trưng riêng biệt quốc gia nào, quy luật chung Châu Âu, ngoại trừ nước Hà Lan, Belgium, Pháp Anh nơi diện nhiều dịng PRRSV có quan hệ gần gũi ( Lelystad-like) giải thích đường thương mại Figure Sequence alignment of Lelystad Virus Porcilis®PRRS VI Kết luận Sự đa dạng PRRSV Châu Âu nhiều nguyên nhân: - Sự tiến hóa tổ tiên chung PRRS dịng Châu Âu sau dịch bệnh bùng nổ -Một vài nhóm giải thích dịch tể học mặt địa lý -Có đa dạng lớn trình tự Lithuania 19 - Những trình tự châu Âu giống US-PRRSV EUPRRSV VII Tài liệu tham khảo Công nghệ sinh học thú y Nguyễn Ngọc Hải www.porcilis-prrs.com/pathogensis prrs.asp 20 Mục lục: I.Đặt vấn đề II Tổng quan II.1.Giới thiệu virus PRRS II.1.1 Lịch sử phát virus PRRS II.1.2 Kích thước hình thái học virus PRRS II.1.3 Tổ chức gen virus PRRS II.2 Nguyên lý chung phương pháp PCR II.3 Nguyên lý chung phương pháp RT-PCR II.4.Nguyên lý chung phương pháp nested PCR II.5 Nguyên lý phương pháp RT-nPCR ống 10 III Phương pháp tiến hành 11 III.1.Ly trích RNA 11 III.2.Thực phản ứng RT-nPCR ORF5 11 III.3.Thực phản ứng RT-nPCR ORF7 12 III.4.Phân tích trình tự nucleotide 13 IV Kết 15 IV.1.Cơ sở địa lý cho đa dạng PRRSV Châu Âu 15 IV.2.Trình tự PRRS Lithuania đa dạng khác thường 17 IV.3.Dấu vết phân tích trình tự tổ tiên chung cho kiểu gen Châu Âu Châu Mỹ 17 V.Thảo luận: 19 VI Kết luận 21 VII Tài liệu tham khảo 22 21 ... phút -Một bước kéo dài 72 oC for 10 hồn thành q trình khuếch đại. Sản phẩm cuối khuếch đại 606 bp III.3.Thực phản ứng RT-nPCR ORF7 -Từ RNA chọn lọc, ORF7 khuếch đại µl RNA trộn với 8.25 µl nước,... Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Hình 3: Nguyên tắc phản ứng PCR Nguyên tắc phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen quan tâm primer... chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo virus thuộc nhóm Arterividae có khả xâm nhiễm vào đại thực bào vào mô Các đại thực bào với "chân giả" có tác dụng bắt giữ tác nhân gây bệnh vi khuẩn, virus