TCNCYH 23 (3) 2003 Những đột biến gen gây thiếu hụt steroid 21- hydroxylase ở một bệnh nhi có hội chứng cờng thợng thận bẩm sinh thể mất muối, mất nớc Nguyễn Thị Ngọc Dao 1 , Nguyễn Thị Hoàn 2 , Rita Bernhardt 3 , Ebert Schulze 4 . 1 Viện CNSH - TTKHTN và CNQG 2 Viện Nhi khoa Trung ơng 3 Trờng Đại học Saarland - CHLB Đức 4 Phòng xét nghiệm gen học phân tử của Prof. F.Raue,Heidelberg - CHLB Đức i. Đặt vấn đề Cờng thợng thận bẩm sinh là một bệnh do sự sai lệch di truyền trong sinh tổng hợp cortisol gây ra. Bình thờng cortisol đợc tổng hợp từ cholesterol trong vùng bó của vỏ thợng thận với 5 bớc có sự xúc tác của các enzym khác nhau. Đầu tiên chuỗi bên của cholesterol đợc phân cắt bởi phản ứng do cholesterol desmolase xúc tác tạo ra pregnenolone, chất này sau đó đợc khử hydro ở vị trí 3 để tạo thành progesterone, 2 phản ứng thủy phân ở 2 vị trí 17- và 21 của progesterone tiếp theo sẽ tạo ra 11 deoxycortisol, chất này sau đó chuyển thành cortisol do phản ứng xúc tác bởi 11- hydroxylase (P450 c 11). Tất cả các enzym xúc tác các bớc trên đều có thể có sự thiếu hụt do đột biến gen nhng phổ biến nhất là 21- Hydroxylase và 11 -Hydroxylase. Sự thiếu hụt 21-hydroxylase dẫn tới giảm lợng glucocorticoid thợng thận, trớc hết là giảm cortisol. Sự tổng hợp mineralocorticoid cũng giảm. Mất muối là do thiếu mineralcorticoid ở ống lợn xa, nơi mà Na + đợc tái hấp thụ từ cầu thận và K + , H + đợc thải ra. Triệu chứng lâm sàng là mất Na + và nớc, toan chuyển hoá và hạ Na + huyết, tăng K + do thiểu năng thận. Triệu chứng rối loạn đặc trng là mất nớc trầm trọng đến mức đe doạ tính mạng, nôn mửa và ỉa chảy trong vài tuần đầu tiên của cuộc sống. Vào khoảng 1/3 các trờng hợp CAH cổ điển là có khả năng sản xuất đủ mineralcorticoid để hạn chế mất muối [2]. Biểu hiện khác về mặt sinh hoá của CAH là sự tăng sản phẩm androgen thợng thận, vì sự tổng hợp hormon này không cần 21-hydroxylase xúc tác và sự tổng hợp tăng lên khi con đờng chuyển hoá cần 21-OHD bị chặn. Vì không có sự điều hoà ngợc âm bởi cortisol nên tuyến yên và vùng dới đồi tăng cờng tổng hợp ACTH, chất này kích thích vỏ thợng thận và gây ra sự phì đại tuyến, mặt khác do con đờng chuyển hoá bình thờng bị khoá do thiếu men 21- Hydroxylase nên lại càng tăng tổng hợp androgen thợng thận. Những ảnh hởng này xảy ra trong dạ con và kết quả là gây ra các mức độ nam hoá khác nhau ở bộ phận sinh dục ngoài của bào thai và trẻ sơ sinh gái. Trẻ trai bị bệnh nói chung có thể coi là bình thờng khi mới sinh. Gen mã hoá cho P450 c 21 đợc ký hiệu là CYP 21. Còn có một bản sao giống hệt với CYP 21 đợc ký hiệu là Cyp 21P, gen này có 98% phù hợp với CYP 21 trong thứ tự nucleotid ở các exon. Tuy nhiên CYP 21 P là gen không 110 TCNCYH 23 (3) 2003 hoạt động, có tới 15 dạng đột biến bao gồm đột biến mất 8 bp ở exon 3, một đột biến ở vị trí gắn của intron 2, thêm 1 Thymidin (T) vào exon 7, một đột biến vô nghĩa CT ở codon 318 một số đột biến điểm gây ra mất đoạn ở exon 6 (missense mutation) Những đột biến liên quan đến biểu hiện mất muối thờng là đột biến làm biến đổi Arg 356 Trp. Đột biến ở intron 2 có thể tìm thấy trong bệnh nhân mất muối hoặc nam hoá đơn thuần. Đột biến Ile 172 Asp liên quan với nam hoá đơn thuần trong khi Pro 30 leu và Val 281 Leu thờng đợc thấy trong bệnh nhân dạng cổ điển Cả 2 gen này nằm trên nhiễm sắc thể 6 P 21.3, liền kề và xen kẽ với gen C4A và C4B mã hoá cho cấu tử thứ 4 của bổ thể huyết thanh. Cho đến nay ngời ta đã công bố 56 đột biến khác nhau của CYP 21. Vì 21-hydroxylase chỉ biểu hiện ở vỏ thợng thận nên rất khó xác định hoạt tính enzym này trong máu hoặc tổ chức. Progesteron và 17-OHP là những hợp chất đợc tích lũy và tăng cao ở bệnh nhân thiếu hụt enzym cyp 21-Hydroxylas. Việc định lợng các nội tiết tố trên cũng là những xét nghiệm quan trọng giúp cho chẩn đoán. Gần đây, chẩn đoán gen học phân tử của bệnh thiếu hụt 21-hydroxylase qua sự phân tch trực tiếp gen CYP 21 đã đợc khảo nghiệm là phù hợp và chính xác. Phơng pháp phân tích gene tiến hành qua 2 bớc: Bớc thứ nhất, một đoạn gen đặc hiệu CYP 21 đợc nhân ra, đoạn này sẽ trở thành khuôn cho phản ứng phát hiện đột biến ở bớc 2. Sự khuếch đại đặc hiệu CYP 21 thờng đợc tiến hành bởi những mồi đặc hiệu allele, kết quả thu đợc 2-3 đoạn khuôn. Sản phẩm PCR sau đó là đối tợng để tìm đột biến bằng các phơng pháp khác nhau nh: lai các nucleotid đặc hiệu allele, SSCP (single- strand conformation polymorphism) hoặc đọc trình tự trực tiếp DNA. ii. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu: Mẫu DNA tách từ máu tĩnh mạch (chống đông bằng EDTA) theo phơng pháp chuẩn sử dụng phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Hàm lợng và độ sạch của DNAsau khi tách đợc kiểm tra bằng quang phổ ở 2 bớc sóng 260/280 nm và điện di gel agarose 0,8%. Sau đó 2 đoạn gen đặc hiệu 21-OH( fragment III ở exon 6 và I ở exon 3) đợc khuếch đại bằng phản ứng PCR.Các cặp mồi cyp5/cyp14 và cyp 11/cyp12 đã đợc sử dụng. Trình tự các cặp mồi: cyp-5:5 AGC TAT AAG TGG CAC CTC AGG 3 cyp-11: 5 CTT GGG AGA CTA CTC CCT GCT 3 cyp-12: 5 GTT CGT ACG GGA GCA ATA ÂAG 3 cyp -14 :5 GCA TCT CCA CGA TGT GA 3 Chơng trình chạy: 94 o C trong 4 phút 94 o C trong 45 giây 56 o C trong 45 giây x 25 lần 72 o C trong 2,5 phút 94 o C trong 45 giây 58 o C trong 45 giây x 10 lần 72 o C trong 4 phút 10 o C kết thúc Sản phẩm PCR dài khoảng 700-850 bp đợc đọc trình tự trực tiếp trên máy DNA sequencer của hãng Global Edition IR 2 9(NEN) Readir 4200 để tìm các đột biến. Mỗi bản gel acrylamid cùng lúc phân tích trình tự đợc 15 111 TCNCYH 23 (3) 2003 mẫu DNA (60 giếng).Sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang đê phát hiện các base nucleotid. iii. Kết quả Kết quả đọc trình tự gene cho thấy: Tất cả các thành viên trong gia đình bệnh nhân đều có đột biến gen CYP 21 với các thể loại khác nhau. Dới đây là kết quả cụ thể của từng ngời: Hình 1: Sơ đồ về sự di truyền các đột biến gen CYP 21ở gia đình bệnh nhân Ngo Đuc M. Mẹ Dị hợp tử 12 (nt 656) G/C Bố Dị hợp tử P30L, 12 (nt 656) G/A, mất đoạn 8 cặp base (cả 3 đột biến này nằm trên một allel) Bệnh nhân Em trai bệnh nhân: dị hợp tử Đột biến nhận từ bố: P30L, 12 (nt 656) G Mất đoạn 8bp (exon 3) Đột biến nhận từ mẹ: 12(nt 656) G Vị trí 12 (nt 656) G/G đồng hợp tử Dẫn tới: - 0% hoạt tính enzym 21-OH - Mất muối Đột biến 12 (nt 656) G/A nhận từ mẹ nhận từ bố Khỏe mạnh về lâm sàng Ghi chú: 12 (nt 656) G là bệnh lý, 12 (nt 656) A hoặc C là bình thờng. Bệnh nhân Ngô Đức M.: Trên Allel 1: Đột biến điểm ở nucleotid 656 (A/C G) ở intron 2 của CYP 21 (gen hoạt động của 21-hydroxylase). A hoặc C là polymorphismen bình thờng, G là bệnh lý. Đột biến ở intron 2 dẫn tới sự rối loạn cơ chế 112 TCNCYH 23 (3) 2003 gắn (splicing-mechanismus) và dẫn tới sự đứt quãng trong tổng hợp protein. Trên Allel 2: Có 3 đột biến gồm: - Đột biến điểm ở codon 30 (CCG CTG) làm thay đổi aminoacid từ Prolin thành leucin (pro 30 leu) trong exon 1 của CYP 21. - Đột biến điểm ở vị trí 656 (A/C G) ở intron 2 của CYP 21 - Mất đoạn 8 bp (GÂGACTAC) ở exon 3 3 đột biến này phù hợp với sự trao đổi ADN đáng kể giữa CYP 21 và CYP 21P. Những đột biến này cũng nằm trên allel của cha. Do đột biến ở intron 2 (vị trí 656) và mất đoạn ở exon 3 nên cả 2 allele hoàn toàn bất hoạt.Từ đó có thể khẳng định bệnh nhân Ngo Đức M. bị bệnh CAH thể cổ điển với triệu chứng mất muối. Bố bệnh nhân ( Ngô Văn.Th.): Đột biến điểm dị hợp tử ở codon 30 (CCG CTG) với sự thay đổi Pro 30 thành leu trong exon 1 của CYP 21. Đột biến điểm dị hợp tử ở nucleotid 656 (A G) ở intron 2 của CYP 21 (gen hoạt động của 21-hydroxylase), G là bệnh lý, A là bình thờng. Mất đoạn gen dị hợp tử của 8 bp (GAGACTAC) ở exon 3 của CYP 21. Tất cả 3 đột biến này nằm trên cùng một allele và di truyền cho con là Ngô Đức. M. Mẹ bệnh nhân, (Hoàng Thị Hiền L).: Đột biến điểm dị hợp tử ở nucleotid 656 (G/A) ở intron 2. G là bệnh lý, A là bình thờng. Nh vậy là cha và mẹ bệnh nhân đã di truyền dị hợp tử cho con và bệnh ở con họ là thiếu hụt 21-hydroxylase thể cổ điển (classic). Em trai bệnh nhân,( Ngô Minh Q).: Đột biến điểm dị hợp tử ở codon 656 (G/A) ở itron 2. Đột biến này nằm trên allele của mẹ, không có ở allele do bố di truyền nên Ngô. Minh Q. là ngời mang dị hợp tử của nguy cơ bệnh thiếu hụt 21-hydroxylase thể cổ điển. Bệnh nhi là con trai đầu, già tháng, phải mổ đẻ. 18 ngày tuổi đã phải cấp cứu vào viện do quấy khóc, bỏ bú. Khám tháy da khô, thóp lõm. Trẻ tỉnh táo nhng mệt,vã mồ hôi, chân tay lạnh. Da đen xạm nhất là vùng bộ phận sinh dục.Chẩn đoán ban đầu là viêm phế quản va theo dõi hội chứng sinh dục thợng thận. Xét nghiệm máu cho thấy Na+ giảm (112mmol/l), K+ tăng (>7 mmol/l), testosteron cao (14,6nmol/l), progesteron 17,4nmol/l. Điều trị bàng DCA tiêm và Prednisolon. Dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, các bác sĩ đã chẩn đoán bệnh nhi bị hội chứng sinh dục thợng thận thể mất muối, nớc. Bố mẹ và em của bệnh nhi đều không có biểu hiện bệnh lý. Qua phân tích gen mới biết đợc cả bố mẹ và em bệnh nhân đều là ngời mang gen bệnh dị hợp tử. Chẩn đoán phân tích gen là phơng pháp hiện đại giúp phát hiện và phân loại bệnh một cách chính xác để có hớng điều trị đúng.Từ bệnh nhân có thể phát hiện các thành viên có liên quan di truyền trong gia đình là những ngời dị hợp tử có mang gen bệnh.Trên cơ sở đó có thể quản lý,theo dõi đợc bệnh nhân cũng nh ngời lành mang bệnh. Góp phần t vấn phòng tránh nguy cơ di truyền các đột biến tạo thành bệnh và có thể chủ động diều trị bầng Dexametason cho ngời mẹ có nguy cơ ngay từ khi mang thai.Hiện nay,các nhà khoa học đang nghiên cứu liệu pháp điều trị gene cho một số bệnh di truyền,trong đó có bệnh thiếu hụt 21- Hydroxylase. ở nhiều nớc trên thế giới, thiếu hụt 21-hydroxylase đã đợc đa vào chơng trình sàng lọc sơ sinh để phát hiện sớm và điều trị kịp thơi giúp trẻ có thể có cuooc sống tốt hơn.Những chẩn đoán trớc sinh có giá trị quan trong trong điều trị các thai nhi gái trong việc hạn chế biểu hiện bệnh. 113 TCNCYH 23 (3) 2003 Những nghiên cứu phân tích gene trên số lơng lớn bệnh nhân để tìm dạng đột biến đặc trng cho cộng đông hoặc tìm ra các dạng mới ở ngời Việt nam cũng là việc làm cần thiết để góp phần tìm hiểu đặc điểm di truyền,cơ sở phân tử của bệnh đồng thời góp phần vào chẩn đoán nhanh,chính xác và điều trị có hiệu quả căn bệnh này. Tài liệu tham khảo 1. Maria I, New at al. Prenatal Diagnosis for congenital adrenal hyperplasia in 532 Pregnancies: Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2001, 86 (12): 5651-5657. 2. Lee HH: CYP 21 mutations and congenital adrenal hyperplasia. Clinical Genetics. 2001, 59: 293-301. 3. Paulo Ferrez Collett Solberg. CAH: From genetics and Biochemistry to clinical practice Part I and II. Clin.Pediatrics. 2001, 40: 1-16 and 125-132 4. Perin C.White and Phyllis W.Speiser: CAH due to 21-hydrroxylase deficiency. Endocrine Reviews. 2000, 21: 245-291. 5. Weisenpecharova R. Abtracts of 2 nd international FEBS advanced course: Cyt-P450 systems: from Structur to application. Distribution of CYP 21 gene mutatión in Slovak Patients with Congenital adrenal hyperplasia (enzym P450 C21 deficiency). 2002. 6. Catherine E. Keegan and Anthony A.Killeen.An Overrview of molecular diagnosis of steroid 21-Hydroxxylase deficiency. Journal of molecular diagnostics. 2001, Vol.3 N 2; May 2001: 49-54. Summary The mutations caused steroid 21-hydroxylase deficiency on a patient with symptom of congenital adreanal hyperplasia-SW Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a common inherited disorders of adrenal steroidogenesis caused maindly by defecfs in the steroid 21- hydroxylase (CYP21) gene. More than 90% of CAH cases are caused by mutations of the CYP 21 gene on chromosome 6 p 21.3. The wide range of CAH phenotype is associated with multiple mutaion known to affect 21- Hydroxylase enzyme activity. To date, 56 different CYP-21 mutations have been reported, mostly point mutations, but small deletation or insertions have been described too, as well as complete gene deletions. A reliable and accutate detection of CYP 21 mutation is not only important for clinical diagnosis, but also for carrier detection as there is a high variability in the basal level of 17- hydroxy progesterone between normal and heterorygous individuals. Several strategies based on polymerase chain reaction (PCR)- driven amplification with allele- specific oligonucleotides to the CYP 21 gene have been developed.There is a direct relation between the severity of the disease and the reduction in enzym activity caused by mutations. In this article, the DNA sequence results of a patient with CAH ( salt wasting variation) and his family members have been described. This patient have been in herited all mutations from his parents. This results are agreed with clinical diagnosis and experimental estimation of blood and urine hormon levels. Keyword: 21-Hydroxylase,CAH,CYP 21 mutations 114 . TCNCYH 23 (3) 2003 Những đột biến gen gây thiếu hụt steroid 21- hydroxylase ở một bệnh nhi có hội chứng cờng thợng thận bẩm sinh thể mất muối, mất nớc Nguyễn Thị Ngọc Dao 1 ,. bp ở exon 3, một đột biến ở vị trí gắn của intron 2, thêm 1 Thymidin (T) vào exon 7, một đột biến vô nghĩa CT ở codon 318 một số đột biến điểm gây ra mất đoạn ở exon 6 (missense mutation) Những. Những đột biến liên quan đến biểu hiện mất muối thờng là đột biến làm biến đổi Arg 356 Trp. Đột biến ở intron 2 có thể tìm thấy trong bệnh nhân mất muối hoặc nam hoá đơn thuần. Đột biến Ile