TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LƯƠNG MỸ THUẬN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT Cần Thơ, 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LƯƠNG MỸ THUẬN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần thơ, 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM ƠN Được làm và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp là mong muốn của các sinh viên. Để hoàn thành tốt luận văn này là cả một quá trình học tập, phấn đấu cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô và anh chị. Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường. Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng đã nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang và anh Lê Hữu Thôi cùng các bạn lớp bệnh học thủy sản K31, đặc biệt là bạn Mai Thị Loan lớp BHTS-K31 đã nhiệt tình quan tâm giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian thực hiện đề tài. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. Đồng thời cũng so sánh với kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E. Đề tài được thực hiện trên 7 chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập trực tiếp từ cá tra bị bệnh xuất huyết ở các cơ quan (gan, thận và tỳ tạng) của 3 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp), A. hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E sau đó trữ trong glycerol (50%) ở -20 o C. Sau khi phục hồi trên môi trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA và nuôi tăng sinh trong NB, DNA được chiết tách theo Bartie et al (2006), chiết tách bằng 2 cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong NB và vi khuẩn trên đĩa NA pha loãng với nước muối sinh lý). Phản ứng PCR được khuếch đại DNA theo Panangala et al (2007) có chỉnh sữa bởi Đặng Hoàng Oanh và ctv (2008). Kết quả điện di sản phẩm PCR của 7 mẫu DNA chiết tách từ NB và 7 mẫu DNA chiết tách bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý, có sự hiện diện của vi khuẩn A. hydrophila, tất cả đều hiện vạch ở vị trí 209 bp. Điện di sản phẩm PCR của 7 chủng A. hydrophila mà không qua bước chiết tách DNA, do không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại được DNA của A. hydrophila, kết quả cả 7 mẫu đều không hiện vạch khi điện di. Phản ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp nhất có thể phát hiện A. hydrophila là 1ng/µl (hàm lượng DNA). Phương pháp PCR với hàm lượng thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉ cho phép phát hiện A. hydrophila hiện vạch ở (209 bp), khi thử tính đặc hiệu với các chủng (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E. ictaluri, Pseudomonas putida, Eschericchia coli). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi Chương 1: GIỚI THIỆU 1 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam 3 2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản 3 2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh 4 2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra 5 2.5 Sơ lược về vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá tra 7 2.6 Phương pháp PCR 9 2.6.1 Khái niệm về PCR 9 2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR 11 2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản 12 2.6.4 Đối chứng 13 2.6.5 Hạn chế của PCR 13 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15 3.1.1 Thời gian 15 3.1.2 Địa điểm 15 3.1.3 Nội dung thực hiện 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 15 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 16 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv 3.3.2 Nguồn vi khuẩn 16 3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn 17 3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 18 3.3.5 Phương pháp PCR 18 3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR 20 3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR 21 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A. hytrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết 22 4.2 Kết quả phục hồi vi khuẩn 23 4.3 Phát hiện vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp PCR 24 4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. 26 4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. 27 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 1 34 PHỤ LỤC 2 35 PHỤ LỤC 3 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (Panangala et al., 2007). 16 Bảng 3.2: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài. 17 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình PCR phát hiện A. hydrophila. 19 Bảng 4.1: Bảng kết quả thu mẫu cá tra bị bệnh. 22 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 10 Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất huyết và mắt lồi đục). 22 Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar + Ampicillin. 23 Hình 4.3Hình khuẩn lạc của A. hydrophila trên môi trường NA…………… 23 Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila 24 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng A. hydrophila 25 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của chủng A. hydrophila. 26 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A. hydrophila xác định độ nhạy của phương pháp. 27 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện A. hydrophila. 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 Chương 1 GIỚI THIỆU Ngày nay nghề nuôi thủy sản đặc biệt là cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là một thế mạnh hàng đầu được nuôi ở các tỉnh như: Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long,… Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, về thị trường trong và ngoài nước, đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn. Nên mật độ và diện tích nuôi cá tra ngày càng tăng đáng kể. Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước. Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, khối lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với cùng kỳ năm 2006 (Báo Cần Thơ, 2007). Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất, do chi phí đầu tư thấp hơn nghề nuôi cá tra bè, mức độ thâm canh cao có thể lên đến (50-60 con/m 2 ao), đã làm nẩy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh do khó quản lý tốt môi trường nước ao nuôi. Ở Việt Nam, đầu năm 2006 các tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài nguyên và môi trường Việt Nam, 2006; trích lược bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006). Cá tra là một loài cá kinh tế và khi có dịch bệnh đã gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên cứu về bệnh trên cá tra đã được triển khai như: nghiên cứu về bệnh đốm trắng ở nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan, 2006), bệnh trùng quả dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng da (Phạm Thanh Hương, 2006), nghiên cứu khả năng gây bệnh của Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (Ngô Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang (Phan Khắc Huy, 2008),… Bệnh xảy ra trên cá tra do nhiều tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng,…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, khó điều trị và gây tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra. Các loại bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột, trắng gan trắng mang, trắng da trắng đuôi,… Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas là một trong những bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra (Ngô Minh Dung, 2007). Hiện nay phương pháp chuẩn đoán vi khuẩn nói chung và A. hydrophila nói riêng, gây bệnh trên cá tra ở nước ta dựa vào dấu hiệu bên ngoài và phương PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2 pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E, không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Cũng như Ngô Minh Dung (2007) gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra, sau đó tái định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1 tuần để đọc kết quả, hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lương Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn mất khoảng 2 ngày để có kết quả. Cụ thể Nguyễn Trúc Phương (2008) đã ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết quả định danh vi khuẩn sau khi dùng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E để định danh E. ictaluri trên cá tra, đã kết luận phương pháp PCR cho phép phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn chỉ cần 1 ngày, Nguyễn Hà Giang (2008) cũng đã ứng dụng phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila sau khi đã định danh nhưng chưa cho kết quả tốt. Do đó để chẩn đoán nhanh và chính xác vi khuẩn A. hydrophila trên cá giúp cho người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do vi khuẩn này gây ra, thì ứng dụng phương pháp PCR. Nên đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp phát hiện vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh ở cá tra. Mục tiêu nghiên cứu Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết. Nội dung nghiên cứu - Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết. - Xác định độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. - Xác định tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... sản phẩm PCR phát hiện A hydrophila xác định độ nhạy của phương pháp Giếng M: thang đo DNA Giếng 1: đối chứng âm (mẫu nước) Giếng 2: hàm lượng DNA 10o ng/µl (10o = 100 ng/µl) Giếng 3: 10-1; Giếng 4: 10-2; Giếng 5: 10-3; Giếng 6: 10-4; Giếng 7: 10-5; Giếng 8: 10-6; Giếng 9: 10-7; Giếng 1 0: 10-8; Giếng 1 1: 10 -9 4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila Tính đặc hiệu của phương pháp là... phương pháp PCR để phát hiện A hydrophila nhằm kiểm tra tính chính xác của kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và góp phần vào vi c chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn A hydrophila gây ra trên cá tra Nghiên cứu được thực hiện phản ứng PCR bằng 2 cách chiết tách mẫu và lấy mẫu từ khuẩn lạc thuần 24 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com... thành bụng xuất huyết xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn có mùi hôi thối (Hình 4.1) Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất huyết và mắt lồi đục) Kết quả phân tích mẫu vi sinh ở 5 ao cá bị bệnh xuất huyết đã phân lập được 28 chủng vi khuẩn Aeromonas (Đồng Tháp: 6 chủng; Vĩnh Long: 4 chủng; Cần Th : 18 chủng) Dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá lúc phân tích và hình 22 PDF created... dạng khuẩn lạc của A hydrophila trên môi trường Aeromonas agar + Ampicillin Hình 4.3 Hình khuẩn lạc của A hydrophila trên môi trường NA Vi khuẩn A hydrophila được phân lập từ các cơ quan (gan, thận và tỳ tạng) của cá tra bị bệnh xuất huyết ở Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ Sau đó vi 23 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com khuẩn đã được định danh bằng phương pháp. .. cần vài ngày Vi khuẩn sau khi phục hồi tiến hành kiểm tra, thấy kết quả vi khuẩn gram âm, di động, có dạng hình que ngắn (hình 4.4) Kết quả này cũng phù hợp với kết quả ghi nhận của Ngô Minh Dung (2007) phân lập A hydrophila sau khi gây cảm nhiễm trên cá tra Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila 4.3 Phát hiện vi khuẩn A hydrophila bằng phương pháp PCR PCR là công cụ giúp phát hiện nhanh và... TN(g) 3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn - Mẫu cá bệnh thu về phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản, được giữ sống bằng cách bỏ vào thùng mướp có sục khí Mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khỏe - Ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài của c : màu sắc, vết thương, điểm xuất huyết - Mổ cá ghi nhận biểu hiện của các cơ quan nội tạng: điểm xuất huyết, mùi, màu sắc các cơ quan nội tạng - Cấy vi sinh từ các cơ quan (gan,... Âu, bệnh do A hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân-hè, nhiệt độ nước khoảng 17-22oC, đây là khoảng nhiệt độ cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993 trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007) Chẩn đoán bệnh Theo Từ Thanh Dung (2008), chẩn đoán bệnh do Aeromonas là dựa vào các dấu hiệu bệnh lý, mùa vụ xuất hiện bệnh, kết quả phân lập bằng phương pháp truyền thống Để phát hiện bệnh. .. móc 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Gyrodactylus,… cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho cá tra Trần Văn Tếch (2008) đã phân tích mẫu cá tra bị bệnh vàng da phát hiện có (Dactylogyrus, Trichodina, Myxobolus, Bucephalopsis,…) nhưng chưa xác định ký sinh trùng là tác nhân gây bệnh vàng da trên cá tra Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas Nhóm vi khuẩn. .. thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khỏe (mẫu được thu từ tháng 12/2008 đến tháng 2/2009) - Cá thu có dấu hiệu bệnh lý và còn sống - Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí và được phân tích ngay Chỉ sử dụng những mẫu còn sống 3.3.2 Nguồn vi khuẩn Các chủng vi khuẩn A hydrophila được phân lập trên cá tra bị bệnh xuất huyết ở các tĩnh Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp 16 PDF created... 2006) Theo Từ Thanh Dung (2008) cá bị bệnh sẫm màu từng vùng ở bụng, xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể, đuôi và vây bị hoại tử, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vẩy dễ rơi rụng, mắt lồi mờ đục, xoang bụng chứa dịch nội tạng hoại tử Bệnh đốm đỏ, xuất hiện vào lúc giao mùa, nhiễm trên cả cá tra, basa và nhiều loài cá khác Bệnh gây ra do một số loài vi khuẩn như A hydrophila . do vi khuẩn này gây ra, thì ứng dụng phương pháp PCR. Nên đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất. phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết. Nội dung nghiên cứu - Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết. - Xác định độ nhạy của phương. thực hiện nhằm góp phần vào vi c chuẩn hóa phương pháp phát hiện vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh ở cá tra. Mục tiêu nghiên cứu Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A. hydrophila phân