Nghiên cứu tính đa dạng của allele hla - DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR - SSP) ở dân tộc kinh miền trung - Việt Nam Trần Đình Bình 1 , Wang Linlin 2 , Lin Weixiong 2 và cộng sự 1 Bộ môn Vi sinh vật Y học, Đại học Y khoa Huế 2 Trờng Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc Sử dụng kỹ thuật khuyếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCR - SSP) để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố allel HLA - DQA1 ở 214 thanh thiếu niên khoẻ mạnh dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam, kết quả cho thấy: 10 allele HLA-DQA1 đã đợc tìm thấy, trong đó DQA1*0104 là phổ biến nhất với tần suất là 25.8% và thấp nhất là DQA1*0601 (1%). Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tính đa dạng allele HLA-DQA1 ở dân tộc Kinh miền trung Việt Nam có tính đặc trng dân tộc và khác với các dân tộc khác ở Trung Quốc, ở Thái Lan. I. Đặt vấn đề Hệ kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng nguyên rất phức tạp, và đa dạng. Hệ HLA không những là tiêu chí di truyền của mỗi ngời mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ với chức năng điều hoà miễn dịch và các bệnh tật khác. Những ngời không cùng một loại hình phân bố các allele của HLA thì tính cảm thụ hay sức đề kháng với một số bệnh không giống nhau. Nhiều tác giả nớc ngoài đã nghiên cứu sự khác biệt về phân bố allele HLA - DQA1 trong quần thể ngời đã phát hiện một số ngời mang những allele này sẽ có khả năng cảm thụ, hay đề kháng với một số bệnh tật nhất định. Trong thực tế, mỗi dân tộc có mỗi bối cảnh di truyền, yếu tố di truyền khác nhau, cùng một dân tộc nhng khác nhau về vị trí địa lý thì sự phân bố các alleles của hệ HLA cũng khác nhau [3, 7]. ở Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu về hệ HLA, nhất là sự phân bố của allele HLA - DQA1 trên nhiều dân tộc nh Hán, Choang, Bố y, Duy Ngô, Nhĩ, Mãn Thái Lan cũng đã có báo cáo về vấn đề này, nhng cho đến nay cha có báo cáo nào về phân bố allele HLA - DQA1 ở Việt Nam. Chúng tôi áp dụng kỹ thuật DCSVkhuyếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCR - SSP) để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố allel HLA - DQA1 ở dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam để góp phần nghiên cứu sự khác biệt về di truyền giữa các dân tộc khác nhau. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng nghiên cứu: Là 214 thanh thiếu niên khoẻ mạnh, tuổi từ 7 - 36, dân tộc Kinh, c trú tại các tỉnh Thừa Thiên Huế, Quảng Trị và Quảng Bình tỷ lệ nam nữ: 1: 1, tuổi bình quân là 14. 2. Tách DNA: trên mỗi đối tợng lấy 2ml máu tĩnh mạch, thêm 0,5ml Natri citrate 3,8% chống đông và dùng phơng pháp chiết tách DNA kinh điển có cải tiến là Phenol/chloroform. Các bớc nh sau: Với 2ml máu chống đông, thêm 5ml dung dịch gelatine 3%, trộn đều ủ ở 37 0 C/10 phút, tách lấy phần dịch phía trên, 46 ly tâm 3500 rpm/5 phút, bỏ phần dịch phía trên, thêm 2ml dung dịch TES 2mm, trộn đều, thêm 0,5ml dung dịch 10% SDS, trộn đều, thêm 2ml dung dịch Phenol bão hoà trong TES. Trộn đều, ly tâm 3500 rpm/5 phút, tách lấy phần dịch ở trên (có thể tiến hành bớc này thêm một lần nữa), thêm 2ml dung dịch Chloroform/Isoamylic (v/v: 24/1) trộn đều, ly tâm 3500 rpm/5 phút. Tách lấy phần nớc trong ở trên, thêm 5ml dung dịch cồn Ethylic 95%, nhẹ nhàng quay ống nghiệm để các sợi DNA xoắn lại, dùng ống hút nhỏ nhẹ nhàng hút lấy DNA và bảo quản ở một ống khác trong dung dịch cồn 75%. Khi sử dụng có thể dùng dung dịch TE hoặc nớc cất để hoà tan DNA. 3. Kỹ thuật PCR để phân tích allele HLA - DQA1. Các cặp mồi đặc hiệu (specifiec primers) căn cứ vào bảng các nucleotides của các alleles của hệ HLA II năm 2002 và dựa vào các Primers đặc hiệu của O.Olerup, chúng tôi thấy các Primers đặc hiệu từ Trung tâm nghiên cứu Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học của Viện Khoa học Trung Quốc (tham khảo bảng 1), bao gồm 9 chuỗi 5' và 7 chuỗi 3' hợp thành 12 đôi Primers đặc hiệu để khuyếch đại và phân tích exon thứ 2 của HLA - DQA1 allele. Các cặp mồi đối chiếu: mỗi lần tiến hành PCR đều dùng một đôi mồi đối chiếu là Ctr1 1 ( 5 TAT CAT GCC TCT TTG CAC CAT TC 3 , 23 mer, TM 66 0 C) Ctrl 2 (AAT GCA CTG AAC TCC CAC ATT CC 3 , 23 mer, Tm 70 0 C) để kiểm soát và đối chiếu phản ứng khuyếch đại PCR. Kỹ thuật PCR - SSP: Dựa vào phơng pháp của O. Olerup để tiến hành, cụ thể là: mỗi ống tiến hành PCR chứa 10àl gồm có: 75ng tiêu bản DNA, dung dịch đệm 5 x PCR (50mmol KCl; 1.5mmol MgCl2; 10mmol Tris-HCl (pH 8.3); 0,001% (w/v) Gelatin) 1% BSA, 200àl dNTPs chính là các dATP, dGTP, dCTP và dTTP; 0,25 àM các đôi mồi đặc hiệu, 0,05 àM đôi mồi đối chiếu và 0,50 IU Taq DNA polymerase. Tiến hành 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ nh sau: Biến tính 94 0 C/30 giây => giảm nhiệt 62 0 C/30 giây => nối dài 72 0 C/90 giây. Sản phẩm thu đợc sau PCR đợc tiến hành điện di ở trong thạch Agarose 1,5% với điện áp 100V trong 15 phút. Xem và phân tích kết quả ở đèn cực tím hoặc ở máy vi tính để chụp ảnh và bảo lu kết quả. 4. Xử lý số liệu thống kê: dùng cách tính tần suất % theo Hardy - Weinberg để thống kê và xử ý các kết quả đạt đợc. Bảng 1: Vị trí, kích thớc và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuyếch đại allele DQA1 TT Tên gọi các allele Đôi Primers đặc hiệu Sản phẩm PCR Các allele thu hoạch sau PCR 1 DQA1 * 0101/4 A * 5'01 + A * 3'01 DQA1 *0101, DQA1*0104 2 DQA1 * 0102/4 A * 5' 02 + A * 3'01 DQA1 *0101, DQA1*0102, DQA1*0104 3 DQA1 * 0102/3 A * 5'03 + A * 3'01 DQA1 *0101, DQA1*0103 4 DQA1 * 0103 A * 5'04 + A * 3'02 149bp DQA1 *0103 5 DQA1 * 0201 A * 5'04 + A * 3'02 172bp DQA1 *0201 47 Bảng 1: Vị trí, kích thớc và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuyếch đại allele DQA1(tiếp) TT Tên gọi các allele Đôi Primers đặc hiệu Sản phẩm PCR Các allele thu hoạch sau PCR 6 DQA1 * 0301 A * 5'05 + A * 3'03 170bp DQA1 *0301 7 DQA1 * 0302 A * 5'06 + A * 3'03 183bp DQA1 *0302 8 DQA1 * 0401 A * 5'07 + A * 3'04 190bp DQA1 *01030401 9 DQA1 * 0501 A * 5'02 + A * 3'05 186bp DQA1 *0501 10 DQA1 * 0601 A * 5'02 + A * 3'05 117bp DQA1 *0601 11 DQA1 * "A" A * 5'08 + A * 3'07 196bp All DQA1 alleles except DQA1*0104 12 DQA1 * 0104 A * 5'09 + A * 3'07 170bp DQA1 *0104 II. Kết quả Kết quả phân tích HLA - DQA1 từ 214 mẫu máu (xem bảng 2). Đã kiểm tra đợc 10 loại allele DAQ1, tần suất tìm thấy cao nhất là allele DQA1 * 0140 (25,8%), tiếp đó là các allele DQA1 * 0101 và DQA1 * 0102 với tần suất tìm thấy lần lợt là 19,4% và 15,7%, các allele DQA1 còn lại đều đợc tìm thấy dới 10%. Nhiều alleles là đồng hợp tử nên tổng số các alleles là đồng hợp tử thì cần phải tiếp tục kiểm tra chuỗi DNA. Đề tài này cha tiến hành xác định các alleles là đồng hợp tử bằng kỹ thuật đọc chuỗi. Hình ảnh dới đây là kết quả điện di sản phẩm PCR sau khuyếch đại đợc phân tích và lu ảnh ở máy tính Bio - Rad Gel Doc. 2000. Bảng 2: Tần suất các allele HLA - DQA1 của ngời Kinh Việt Nam TT Tên gọi các allele Lợt tìm thấy (328) Tần suất kháng nguyên (%) Tần suất allele tìm đợc (%) 1 DQA1 * 0101/4 75 0.35 0.194 2 DQA1 * 0102/4 62 0.29 0.157 3 DQA1 * 0102/3 8 0.04 0.020 4 DQA1 * 0103 96 0.45 0.258 5 DQA1 * 0201 24 0.11 0.056 6 DQA1 * 0301 24 0.11 0.056 7 DQA1 * 0302 6 0.03 0.015 8 DQA1 * 0401 22 0.10 0.051 9 DQA1 * 0501 7 0.03 0.015 10 DQA1 * 0601 4 0.02 0.010 III. Bàn luận Cho đến nay, hệ kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA) đợc coi là hệ kháng nguyên di truyền phức tạp và đa dạng nhất. Chúng không chỉ có sự phân bố khác nhau giữa các cá thể khác nhau, mà còn sự khác biệt giữa các dân tộc do khác nhau về bối cảnh di truyền, yếu tố di truyền và ngay cả cùng một dân tộc nhng khác nhau về vị trí 48 địa lý. Nghiên cứu tính đa dạng của hệ kháng nguyên bạch cầu ngời có vị trí rất quan trọng vì nó là một tiêu chí di truyền học vô cùng chắc chắn, ứng dụng nhiều trong việc xác định con cái, bố mẹ, trong khoa học hình sự để tìm tội phạm, trong nghiên cứu nhân chủng học, dân tộc học để tìm hiểu nguồn gốc của một dân tộc [1]. Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu gần đây còn khẳng định mối liên hệ mật thiết giữa HLA và một số bệnh tật nh: đái tháo đờng không phụ thuộc Isulin, Viêm cứng cột sống, viêm đa khớp dạng thấp, viêm khớp thiếu niên Vì thế nghiên cứu HLA còn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại, chuẩn đoán và hỗ trợ chuẩn đoán, tiên lợng bệnh, dự phòng và điều trị một số bệnh tật. Theo đà phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, việc nghiên cứu HLA ngày càng đơn giản, thuận tiện và chính xác. Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về HLA vẫn còn khu trú tại các Viện nghiên cứu, Phòng Khoa học hình sự còn cha đợc sử dụng nhiều trong bệnh viện và các phòng thí nghiệm y học. Đây có lẽ là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về HLA, dẫu rằng có tài liệu đề cập đến hệ HLA của ngời Việt Nam nhng không ghi rõ nơi nghiên cứu [1]. Theo kết quả nghiên cứu trên đây, ngời dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có tần suất tìm thấy allele HLA - DQA1 * 0104 là cao nhất 25,8%, tiếp đó là các allele DQA1 * 0101 và DQA1 * 0102 với tần suất tìm thấy lần lợt là 19,4% và 15,7%, các allele khác đợc tìm thấy với tần suất rất thấp. So sánh với các dân tộc khác ở Trung Quốc thấy rằng tần suất tìm thấy các allele phân bố khá giống với dân tộc Choang (đã tìm thấy allele HLA - DQA1 * 0104 với tần suất 22,1% và allele HLA - DQA1 * 0401 là 1,1%). Dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có các allele HLA - DQA1 * 0301 và HLA - DQA1 * 0501 đợc tìm thấy rất thấp, đều thấp hơn cả 10 dân tộc ở Trung Quốc (xem bảng 3). Nh vậy, tần suất allele HLA - DQA1 * 0401 cao, HLA - DQA1 * 0301 và HLA - DQA1 * 0501 thấp có lẽ là đặc trng phân bố allele HLA - DQA1 của ngời Kinh miền Trung Việt Nam. So sánh với nghiên cứu trên ngời Thái Lan thấy HLA - DQA1 * 0101, HLA - DQA1 * 0102 có tần suất tơng tự nhng tần suất HLA - DQA1 * 0501 (12,8%) cũng cao hơn nhiều so với ngời Kinh miền Trung Việt Nam. (p < 0,005). Dân số Việt Nam hiện nay khoảng 80 triệu ngời, với 54 dân tộc anh em, trong đó ngời Kinh chiếm tỷ lệ rất lớn (khoảng 90%) phân bổ khắp toàn quốc. Dân tộc Kinh có truyền thống, lịch sử, văn hoá rất lâu đời. Nghiên cứu về dân tộc học cần tập trung trên nhiều phơng diện nh văn hoá, lịch sử, truyền thống, nhân chủng học trong đó di truyền học giữ một vai trò quan trọng. Báo cáo này có lẽ là nghiên cứu đầu tiên về phân bố các alleles của HLA - DQA1 trên ngời Kinh ở miền Trung Việt Nam, với những số liệu ban đầu này, chúng tôi hy vọng có thể tiếp tục nghiên cứu thêm về phân bố kháng nguyên hệ HLA nhằm tìm ra đợc đặc trng phân bố kháng nguyên HLA trên ngời Kinh Việt Nam, điều này có ý nghĩa lớn trong Y học (chuẩn đoán, dự phòng, tiên lợng, điều trị một số bệnh ), trong nhân chủng học nhằm nghiên cứu các nguồn gốc các dân tộc và mối liên hệ giữa các dân tộc khác nhau. Để hoàn thành nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trờng Đại học Y khoa Huế, Bệnh viện thực hành Trờng Đại học Y khoa Huế, Bộ môn Vi sinh, Khoa Xét nghiệm trờng Đại học Y khoa Huế, Trung tâm thí nghiệm Trờng Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc và các thầy cô, đồng nghiệp. Xin chân thành biết ơn. Tài liệu tham khảo 1. Cao Mengde, Tai Dongchun, Sun Hanxiao et al: Biological molecular and Clinincal applies of HLA. Human Medical University Publishing, 1998, 1 - 58. 49 2. Meng Haiying, Hou Yiping: New reseach hotpots of HLA, Chin. J.Med Genet, 2000 17 (5), 355 - 357. 3. Xu xingpei, Wang Shaoying, Cao Jianying: Study on DNA typing of HLA - II class genes of Chinese Buyi nationality. Chin. J. Microbiol. Immnol. 1992 12(5), 285 - 289. 4. Long Guifang, Ahmed Abdi Mohamed: HLA - DQA1, DQB1 alleles genotyping by PCR - SSP in Guangxi Chinese Zhuang nationality. Chin. J. Microbiol. Immnol. 1999 19(6) 504 - 505. 5. Shen Jingjing, Guan Xiaofan, Yang Ze et al: Allels at five HLA - II class determined in Weiwuer nationality in North - Western of China. Chin.J.Med. Genet. 2000, 17 3), 219 - 220 6. Li Xiaofeng, Chang Chang, Hong Shenxue et al: Association of alleles HLA - DRB1, DQA1, DQB1 with SLE in Han populations in Yunnan, China. Chin. J. Med. Genet 2001, 18(5), 408 -409. 7. D. Chandanayingyong, Henry A.F.Stephens, R.Claythong et al: HLA - A, -B, - DQA1 and - DQB1 Polymorphism in Thais. Human Inmmunology, 17, 53, 174 - 182. 8. O. Olerup, A.Aldener, A. Fogdell: HLA - DQB1 and DQA1 typing by PCR - SSP in 2 hours. Tissue Antigens, 193, 41(3), 119 - 134. 9. Zhou Xiaoling, Lin Weixiong: DNA detection from peripheral blood. Chinese Guangxi Medical University Magazine, 1999, 16(2), 223. 10. Zhao Tongmao: Genetics of Human Blood Group, Chinese Science Publishing, 187, 226 -236 Summary Analysis of HLA – DQA1 alleles of jing nationality in central vietnam Objective: To analyse of HLA-DQA1 alleles in Jing nationality of Central Vietnam. Methods: Applied PCR-SSP technique to determine the polymorphism of the HLA-DQA1 alleles of 214 healthy children and yoth, unrelated individuals in Centre of Vietnam. Results: 10 HLA-DQA1 alleles were detected, of which DQA1*0104 were the most common alleles with frequency of 25.8%, and lowest frequency is DQA1*0601 (1%). Conclusion: The results indicate that HLA-DQA1 alleles polymorphism of Jing nationality in Central Vietnam have national characteristics and that are different from the other Chinese and Thais. (Key word: Human leucocyte antigen, HLA-DQA1, PCR-SSP, Jing nationality of Vietnam) 50 . Nghiên cứu tính đa dạng của allele hla - DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR - SSP) ở dân tộc kinh miền trung - Việt Nam Trần Đình Bình 1 ,. (1%). Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tính đa dạng allele HLA- DQA1 ở dân tộc Kinh miền trung Việt Nam có tính đặc trng dân tộc và khác với các dân tộc khác ở Trung Quốc, ở Thái Lan. I. Đặt. phân bố allele HLA - DQA1 ở Việt Nam. Chúng tôi áp dụng kỹ thuật DCSVkhuyếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers (PCR - SSP) để nghiên cứu tính đa dạng của sự