BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * PHẠM MINH NHỰT BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÖ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM MINH NHỰT ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * STANDARD CHALLENGE TEST MODEL AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY PRIMARILY INVESTIGATING PATHOGENESIS OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. NGUYEN VAN HAO PHAM MINH NHUT MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: BGH Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM và các thầy cô ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TS. Nguyễn Văn Hảo, ThS. Ngô Xuân Tuyến, CN. Đoàn Văn Cƣờng đã tận tình chỉ bảo, giải đáp các vƣớng mắc, các khó khăn mà tôi gặp phải trong suốt quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. KS. Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. TS. Lý Thị Thanh Loan đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập tại Viện. Các anh chị ở phòng Mô học tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở phòng Sinh Học Thực Nghiệm và Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình bố trí thí nghiệm. Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt và các bạn thân yêu ở lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã cùng tôi chia sẻ những cảm xúc vui buồn trong thời gian học tập và giúp đỡ, động viên tôi để tôi hoàn thành khóa luận này. Và con vô cùng biết ơn cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ con để con có thể hoàn thành khóa luận này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Phạm Minh Nhựt v TÓM TẮT PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN Bệnh đốm trắng do virus đốm trắng (WSSV) gây ra là nguyên nhân gây chết hàng loạt đối với tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên tại Việt Nam và trên thế giới. Các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm hiện nay rất ít. Do đó việc hiểu rõ hơn về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng sẽ giúp cho việc tạo ra những phƣơng thức kiểm soát bệnh. Kết hợp mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phƣơng pháp hóa mô miễn dịch trên tôm sú không mang các virus thông thƣờng nhằm xác định vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng, phân tích sự xâm nhiễm và tìm ra nguyên nhân gây chết trên tôm. Tiến trình thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau: tôm không mang các virus thông thƣờng đƣợc gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ với liều thấp (10 1,5 SID 50 /ml) và liều cao (10 4,0 SID 50 /ml). Ở mỗi liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo từng thời điểm sau khi gây nhiễm. Sử dụng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch để khảo sát các mẫu theo từng thời điểm nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú. Các kết quả thu đƣợc: Các biểu hiện lâm sàng của tôm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết, đƣợc phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao. Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú ở liều thấp xảy ra vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 33,3 % và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của chúng là các tế bào của tim với cƣờng độ nhiễm là (+) vi Ở liều cao, các cơ quan phát hiện dƣơng tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm sau khi nhuộm bằng hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 50 %. Và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng ở liều cao là các tế bào của tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten và các tế bào của màng bao bên ngoài gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+). Ở thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và ở cả 2 liều gây nhiễm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm virus đốm trắng. Cƣờng độ nhiễm virus đốm trắng trên các cơ quan khi gây nhiễm với liều cao và liều thấp có sự khác biệt trên các cơ quan lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày, biểu mô dƣới vỏ và mô liên kết của màng bao gan tụy. vii MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ iv TÓM TẮT v MỤC LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi DANH SÁCH CÁC BẢNG xii PHẦN I: GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú 3 2.1.1. Miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác 3 2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác 3 2.1.3. Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase 3 2.1.4. Hệ thống đông máu 6 2.1.5. Các chất ức chế proteinase 7 2.1.6. Hệ thống nhận diện không chuyên biệt 7 2.1.7. Các peptide kháng khuẩn 8 2.1.8. Peroxynectin 9 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 9 2.2.1. Bệnh đốm trắng 9 2.2.1.1. Lịch sử và phân bố 10 2.2.1.2. Triệu chứng, bệnh tích 11 2.2.2. Virus đốm trắng 11 2.2.2.1. Phân loại và tên gọi 11 2.2.2.2. Hình thái 12 2.2.2.3. Cấu trúc 13 2.3. Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng 15 viii 2.3.1. Vật liệu gây bệnh 15 2.3.2. Cơ chế gây bệnh 16 2.3.3. Cơ chế lây lan 17 2.4. Mô hình cảm nhiễm chuẩn virus trên tôm 18 2.5. Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch 19 2.5.1. Nguyên lý 19 2.5.2. Kháng nguyên 20 2.5.3. Kháng thể 20 2.5.4. Phƣơng pháp nhuộm 21 2.5.4.1. Phƣơng pháp trực tiếp 21 2.5.4.2. Phƣơng pháp gián tiếp 22 2.5.4.3. Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) 23 2.5.4.4. Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) 23 2.5.4.5. Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) 24 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 25 3.1. Thời gian và địa điểm 25 3.1.1. Thời gian 25 3.1.2. Địa điểm 25 3.2. Vật liệu 25 3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm 25 3.2.1.1. Vật liệu 25 3.2.1.2. Dụng cụ 25 3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC 26 3.2.2.1. Hóa chất 26 3.2.2.2. Vật tƣ 26 3.2.2.3. Thiết bị 26 3.3. Bố trí thí nghiệm 27 3.3.1. Tôm và điều kiện thí nghiệm 27 3.3.2. Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) 27 3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú 27 3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh 28 ix 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus 28 3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tôm 29 3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC 30 3.4.4. Xử lý thống kê 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1. Độc lực của virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) 35 4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ gây chết 35 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm theo từng thời điểm 36 4.2. Khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dòng Việt Nam trên tôm sú 37 4.2.1. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều gây nhiễm thấp (10 1,5 SID 50 /ml) 38 4.2.2. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều cao (10 4,0 SID 50 /ml) 42 4.2.3. So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh 46 4.3. Thảo luận 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1. Kết luận 50 5.2. Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 57 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSSV White Spot Syndrome Virus WSSV-VN White Spot Syndrome Virus – Việt Nam WSSV-TL White Spot Syndrome Virus – Thailand WSD White Spot Disease MBV Monodon Baculovirus YHV Yellow Head Virus proPO Prophenoloxidase PO Phenoloxidase AMPs Antimicrobial Peptides LPS Lipopolysaccharide PG Peptidoglycan PPAE Prophenoloxidase Activating Enzyme CP Clotting Protein TGase Transglutaminase PAMPS Pathogen-associated Molecular Patterns PRR (PRP) Pattern Recognition Receptor (protein) GBP Beta Glucan Binding Protein LPBP Lipopolysaccharide binding protein ICTV International Committee on Taxonomy for Virus SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SID Shrimp Infectious Dose LD Lethal Dose IHC Immunohistochemistry ctv cộng tác viên [...]... gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry)” 1.2 Mục đích Thực hiện gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tôm sú sử dụng liều virus SID50/ml đã đƣợc chuẩn độ xác định nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch 1.3 - Nội dung Gây nhiễm thực nghiệm chuẩn với liều virus SID50/ml thấp và cao trên tôm sú 45... dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và các kỹ thuật nhuộm miễn dịch đặc hiệu sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 của WSSV để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ cơ quan, mô, tế bào và phân tử Với phƣơng pháp này, cho phép chúng ta biết đƣợc về quá trình xâm nhiễm của WSSV theo thời gian, tiến trình, mức độ xâm nhiễm của virus ở các cơ quan đích khác nhau Việc nghiên cứu quá trình. .. protein của virus đốm trắng 13 Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng 14 Hình 2.5: Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng 20 Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC 21 Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm 26 Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tôm thí nghiệm 27 Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tôm 28 Hình 3.4: Các giai đoạn thực hiện IHC 29 Hình. .. 30 Hình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC 31 Hình 4.1: Tôm bị nhiễm virus đốm trắng 35 Hình 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm 36 Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN 37 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều thấp 38 Hình 4.5: Các tế bào của các... peroxide và do đó nó có chức năng nhƣ là một hệ thống tấn công vi sinh vật hiệu quả chống lại sự xâm nhập của chúng (Sritunyalucksana, 2001) 10 2.2 Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1 Bệnh đốm trắng 2.2.1.1 Lịch sử và phân bố Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là một trong những nhóm virus đƣợc xếp vào nhóm virus gây chết cấp tính trên tôm nuôi WSSV gây chết trên hầu hết các loài tôm thuộc... giai đoạn trứng tôm khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998) 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tôm Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn là mô hình đƣợc xây dựng nghiêm ngặt theo những điều kiện, tiêu chí nhất định đƣợc duy trì trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm nhằm gây nhiễm mầm bệnh virus, vi khuẩn trên vật chủ với liều lƣợng xác định nhằm khảo sát đặc tính, đánh... tôm sú (ở mức độ cá thể, quần thể, ao nuôi, khu nuôi, khu vực nuôi, vùng nuôi và quốc gia) Từ cơ sở quan trọng đó, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và sự chấp thuận của Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II, tôi đã thực hiện đề tài “Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm. .. trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú là rất cần thiết, nó làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu và các thí nghiệm đánh giá độ mẫn cảm của các dòng tôm đối với virus, hay tác dụng của các thuốc, chế phẩm, vaccine trên hệ miễn dịch của tôm đối với việc đề kháng lại virus, đồng thời nhằm phát triển các chiến lƣợc kiểm soát WSSV và sự bùng nổ bệnh đốm 2 trắng ở các mức độ khác nhau trên. .. đƣờng miệng 2.5 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch 2.5.1 Nguyên lý Hóa mô miễn dịch (IHC) là kỹ thuật sử dụng kết hợp giữa miễn dịch học và mô học để phát hiện kháng nguyên trong mô Kháng nguyên đƣợc nhận biết bằng kháng thể chuyên biệt Phản ứng miễn dịch đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi bằng cách thêm một enzyme, một cơ chất của enzyme và một chất tạo màu để tạo nên một phản ứng màu Hóa mô miễn dịch là một kỹ... bên ngoài Tôm nhiễm bệnh xuất hiện dấu hiệu đỏ thân cùng với đốm trắng bên trong lớp vỏ đầu ngực, các đốm trắng có kích thƣớc từ 0,5 đến 2 mm xuất hiện đầu tiên trên lớp vỏ đầu ngực và ở đốt đuôi cuối cùng (Chou và ctv, 1995; Kou và ctv, 1998) (Hình 2.1A) Tôm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tôm nhỏ (juvenile) và sắp trƣởng thành (sub-adult) b Dấu hiệu bên trong Tế bào tôm bị bệnh đốm trắng có . tháng 8/2006. “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH”. Giáo viên. nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch. 1.3. Nội dung - Gây nhiễm thực nghiệm chuẩn với liều virus SID 50 /ml thấp và cao trên tôm. đã thực hiện đề tài “Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm thực