Đang tải... (xem toàn văn)
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đề tài XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG DỰA TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT NỘI DUNG 01 Giới thiệu chung 02 Quy trình thu nhận KT dựa trên NCMTBĐV 03 T.
XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG DỰA TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đề tài: NỘI DUNG 01 Giới thiệu chung Quy trình thu nhận KT 02 dựa NCMTBĐV 03 Thu nhận KT đơn dòng 04 So sánh phương pháp 05 Ứng dụng GIỚI THIỆU Giới thiệu Kháng thể đơn dòng tổng hợp từ dòng tế bào lympho B sau hoạt hóa phản ứng với kháng nguyên Các kháng thể đơn dòng nhận biết epitope kháng nguyên cho sẵn Giới thiệu Tương tác KN-KT không chuyên biệt Dễ sản xuất Giới hạn số lượng Tương tác KN-KT chuyên biệt Địi hỏi kỹ thuật cao Khơng giới hạn số lượng Giới thiệu Kháng thể đơn dòng (mAb) thuốc thử quan trọng sử dụng nghiên cứu y sinh, chẩn đoán bệnh điều trị bệnh nhiễm trùng ung thư Các kháng thể tạo dòng tế bào dịng vơ tính thu từ động vật miễn dịch với chất đối tượng nghiên cứu Giới thiệu Dòng tế bào: Các dòng tế bào tạo cách kết hợp tế bào B miễn dịch tế bào u tủy (myeloma cells) Để tạo mAb mong muốn, tế bào phải nuôi cấy theo hai cách: Bằng cách tiêm vào khoang phúc mạc chuột chuẩn bị thích hợp (phương pháp in vivo, cổ trướng chuột) Bằng cách nuôi cấy mơ ống nghiệm Giới thiệu Ngun tắc Chính phủ Hoa Kỳ sử dụng chăm sóc Động vật có Xương sống dùng làm thí nghiệm: Động vật chọn cho quy trình phải có lồi chất lượng thích hợp số lượng tối thiểu cần thiết để có kết hợp lệ Nên xem xét phương pháp mơ hình tốn học, mơ máy tính hệ thống sinh học ống nghiệm Việc sử dụng động vật cách hợp lý, bao gồm việc tránh giảm thiểu khó chịu, đau khổ đau đớn phù hợp với thực hành khoa học đắn điều bắt buộc QUY TRÌNH Quy trình Sự hình thành tế bào lai Hydridoma: Hybrid = lai tế bào lympho B x tế bào ung thư dòng tủy myeloma ; -oma = tumor (khối u) Kháng thể đơn dòng là chuỗi tế bào Hybridoma sản sinh kháng thể đơn dịng "bất tử" sản sinh kháng thể giống hồn tồn Q trình bắt đầu cách tiêm cho chuột kháng nguyên gây phản ứng miễn dịch Một loại tế bào bạch cầu, tế bào B, tạo kháng thể liên kết với kháng nguyên tiêm Quy trình Phương pháp ni cấy khối mơ: Điều bất lợi phương pháp thể tích lớn môi trường nuôi cấy mô phải xử lý, nồng độ kháng thể đơn dòng thu thấp ( khoảng vài microgam mililit) vài kháng thể đơn dịng bị biến đổi suốt q trình cô đặc tinh Trên thực tế, chọn lọc kháng thể đơn dòng cho thấy độ hoạt động bị giảm sút 42% một nồng độ chuẩn Quy trình Sản xuất KT đơn dịng phương pháp in vivo (phương pháp tràn dịch ổ bụng chuột): Quy trình Một số hình ảnh phương pháp chọc dò: THU NHẬN Thu nhận Thu nhận kháng thể đơn dòng thực theo nhiều kỹ thuật khác tùy thuộc vào mục đích sử dụng chất kháng thể Một số kỹ thuật thường sử dụng thu nhận kháng thể đơn dòng: Sắc ký lỏng cao áp HPLC Ngưng tụ ammonium sulfate, nồng độ 50% Sắc ký trao đổi ion Sắc ký lọc gel Thu nhận Sắc ký lỏng cao áp HPLC Sắc ký lọc gel Thu nhận Kháng thể đơn dịng thu nhận không cần tinh khiết phương pháp ly tâm phân đoạn Trong trường hợp cần kháng thể tinh khiết sử dụng phương pháp sắc ký cột lực với protein A, protein G Các protein có trọng lượng phân tử cao kết tủa nồng độ ammonium sulfate thấp (50%) không thu protein tinh khiết cao hỗ trợ loại bỏ số protein không mong muốn SO SÁNH So sánh Ưu điểm: Phương pháp in vivo Thường sản xuất mAb nồng độ cao Nồng độ cao mAb dịch tràn ổ bụng chuột Phương pháp in vitro Giảm việc sử dụng chuột giai đoạn sản xuất kháng thể Phương pháp lựa chọn hạn chế việc nhiễm cho cho sản xuất quy dịch nuôi cấy in vitro số lượng mô lớn tương đương mAb sử dụng Giảm nhân viên phòng thí nghiệm việc xử lý động vật So sánh Ưu điểm: Phương pháp in vivo Tránh phải hóa kháng Phương pháp in vitro Sử dụng hệ thống màng thể sản xuất phương bán thấm sản xuất mAb có pháp ni cấy mơ nồng độ thường cao Đơn giản, dễ triển khai rộng rãi phương pháp dịch tràn ổ bụng Tránh tạp nhiễm từ thể chuột So sánh Nhược điểm: Phương pháp in vivo Là nguyên nhân gây đau đớn nguy hại đến chuột mAb sản xuất phương pháp in vivo chứa nhiều protein chuột chất gây ô nhiễm khác mà yêu cầu phải làm Phương pháp in vitro Giảm lực miễn dịch, thay đổi chức sinh học kháng thể So sánh Nhược điểm: Phương pháp in vivo Phương pháp dịch tràn ổ bụng Phương pháp in vitro Một số tế bào lai hybridoma chuột kéo theo việc tiếp tục sử dụng không phát triển tốt chuột yêu cầu phải theo dõi chết q trình ni ngày cấy Yêu cầu việc sử dụng FBS (huyết thai bê) ỨNG DỤNG Ứng dụng Nghiên cứu y sinh Chẩn đoán bệnh điều trị bệnh nhiễm trùng ung thư ... Hybrid = lai tế bào lympho B x tế bào ung thư dòng tủy myeloma ; -oma = tumor (khối u) Kháng thể đơn? ?dòng? ?là chuỗi tế bào? ?Hybridoma sản sinh kháng thể đơn dòng "bất tử" sản sinh kháng thể giống... Giới thiệu chung Quy trình thu nhận KT 02 dựa NCMTBĐV 03 Thu nhận KT đơn dòng 04 So sánh phương pháp 05 Ứng dụng GIỚI THIỆU Giới thiệu ? ?Kháng thể đơn dòng tổng hợp từ dòng tế bào lympho B sau... nồng độ kháng thể đơn dòng thu thấp ( khoảng vài microgam mililit) vài kháng thể đơn dịng bị biến đổi suốt q trình cô đặc tinh ? ?Trên thực tế, chọn lọc kháng thể đơn dòng cho thấy độ hoạt động bị