Đang tải... (xem toàn văn)
KẾ HỌACH ĐỊNH TÍNH E COLI TRONG SỮA ĐẬU NÀNH 1 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37°C 1°C và 44°C 1°C Tủ sấy hoặc buồng s.
KẾ HỌACH ĐỊNH TÍNH E.COLI TRONG SỮA ĐẬU NÀNH DỤNG CỤ, THIẾT BỊ - Thiết bị khử trùng khô (tủ) khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) - Tủ ấm, trì nhiệt độ 37°C - Tủ sấy buồng sấy thơng gió, trì nhiệt độ từ 25°C 1°C 44°C 1°C 1°C đến 50°C 1°C, tủ thổi khơng khí - Tủ lạnh (dùng để bảo quản môi trường chuẩn bị), trì nhiệt độ 5°C 3°C - Máy đo pH, có độ phân giải 0,01 đơn vị pH, có độ xác đến 0,1 đơn vị pH 25°C - Ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm 20 mm 160 mm 18 mm 180 mm 200 mm - Pipet xả hết, có dung tích danh định ml 10 ml, chia vạch 0,1 ml - Vòng lấy mẫu, platin/iridi niken/crom, đường kính khoảng mm, vịng lấy mẫu vơ trùng sử dụng lần dung tích 10 - Đĩa petri, đường kính khoảng 90 mm HĨA CHẤT 2.1 Mơi trường glutamat khống cải biến ( mơi trường tăng sinh chọn lọc) a) Thành phần Môi trường Môi nồng độ kép nồng độ đơn Natri glutamat Lactoza Natri focmat L-xystin L-(-)axit aspactic L(+)-arginin Thiamin Axit nicotinic Axit pantothenic Magie sunft ngậm bảy phân tử 12,7 g 20,0 g 0,5 g 0,04 g 0,048 g 0,04 g 0,002 g 0,002 g 0,002 g 0,2 g 6,35 g 10,0 g 0,25 g 0,02 g 0,024 g 0,02 g 0,001 g 0,001 g 0,001 g 0,1 g nước (MgSO4.7H2O) Sắt (III) amoni xytrat Canxi clorua ngậm hai phân tử 0,02 g 0,02 g 0,01 g 0,01 g 1,8 g 0,9 g nước (CaCl2.2H2O) Dikali hydro phosphat (K2HPO4) Bromocresol tía Amoni clorua Nước trường 0,02 g 0,01 g 5,0 g 2,5 g 1000 ml 1000 b) Chuẩn bị - Hòa tan amoni clorua nước Bổ sung thành phần, môi - trường hồn chỉnh khơ cịn lại, đun nóng cần Để tăng thời gian bảo quản môi trường khơ, thêm natri glutamat cách riêng lẽ - Nếu cần, chỉnh pH để sau khử trùng pH phải 6,7 - Phân phối môi trường theo lượng 10 ml vào ống nghiệm có kích thước 16 mm 160 mm trường hợp mơi trường đơn phân phối vào ống nghiệm có kích thước 18 mm mm - 0,1 25°C 180 mm 20 200 mm trường hợp môi trường nồng độ kép Khử trùng 10 phút nhiệt độ 116°C nồi hấp áp lực Cách khác đun nóng 100°C 30 phút ngày liên tếp 2.2 Thạch trypton-mật-glucuronid (môi trường chọn lọc thứ hai) a) Thành phần Sản phẩm thủy phân casein 20,0 g enzym Muối mật No.3 1,5 g Axit-5-brom-4-clo-3-indolyl- D-glucuronid (BCIG) Dimetyl sulfoxit (DMSO)b Thạch Nước 114 a ml g tới 18 g 1000 ml Ví dụ: 0.075 g muối xyclohexylamon Dimetyl sulfoxit độc hít tiếp xúc phải Cần sử dụng tủ hút khói Vì độc tính nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng Tùy thuộc vào sức đơng thạch b) Chuẩn bị - Hịa tan BCIG dimetyl sulfoxit Hòa tan tất thành phần nước đun đến sôi - Chỉnh pH để sau khử trùng phải 7,2 0,2 25°C, cần - Khử trùng môi trường 15 phút nhiệt độ 121°C nồi hấp áp lực c) Chuẩn bị đĩa thạch - Rót lượng từ 12 ml đến 15 ml môi trường tan chảy vào đĩa petri vô trùng đông đặc - Làm khơ đĩa thạch Các đĩa bảo quản đến ngày 5°C - 3°C Các đĩa thạch cần phải đủ khô để nước không xuất 15 phút dàn dịch cấy d) Kiểm tra hiệu việc đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy Đối với phép thử hiệu mơi trường glutamate khống cải biến thạch trypton mật glucuronid, xem Bảng 2.2.1 Bảng 2.2.2 Bảng 2.2.1 – Kiểm tra hiệu môi trường glutamat khoáng cải biến Chức Ủ Chủng kiểm Phương pháp kiểm Tiêu chí Phản ứng đặc chứng trưng chứng Khả phát triển 37ºC/24h E.Coli ATCC Bán định lượng Sinh axit Chuyển sang màu vàng 25922 8739 Tính chọn lọc 37ºC/24h E.faecalis ATCC 29212 19433 Định lượng Không phát triển - Bảng 2.2.2 – Kiểm tra hiệu môi trường thạch trypton mật glucuronid Chức Ủ Chủng kiểm chứng Phương pháp Tiêu chí Phản ứng đặc kiểm chứng Khả 44ºC/20h đến phát triển 24h E.Coli ATCC 25922 8739 trưng Định lượng Phát triển tốt Các khuẩn lạc (2) có màu xanh đến xanh da trời E.Coli NCTC Định lượng Phát triển tốt Các khuẩn lạc (2) có màu xanh đến xanh da 13216 (dương tính yếu βtrời glucuronidaza) Tính chọn lọc 37ºC/24h E.faecalis ATCC Định lượng 29212 19433 Không phát triển 2.3 Dung dịch pha loãng mẫu: a) Dịch muối peptone THÀNH PHẦN G/ML Pepton từ casein 1,0g Natriclorua 8,5 g Nước 1000ml Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH cho sau khử trùng, pH ± 0,2 25oC, cần b) Dung dịch đệm peptone - THÀNH PHẦN G/ML Pepton từ mô động vật 10g Natri clorua 5g Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử 9g nước (Na2HPO4.12H2O) Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,5g Nước 1000ml Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH cho sau khử trùng, pH ± 0,2 25oC, cần 3 QUY TRÌNH 3.1 Lấy mẫu - Điều quan trọng mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi thành phần trình vận chuyển bảo quản 3.2 Chuẩn bị mẫu thử - Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm bên tự thỏa thuận vấn đề 3.3 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng - Pha đủ số lượng độ pha loãng để đảm bảo tất ống nghiệm ứng với độ pha lỗng cuối cho kết âm tính 3.4 Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc a) Về nguyên tắc chung, theo quy trình cần ba ống cho độ pha loãng - Đối với động vật nhuyễn thể có vỏ tươi sống sản phẩm đặc biệt khác và/hoặc yêu cầu độ xác cao kết cần cấy năm ống cho độ pha loãng b) Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép - Dùng pipet vô trùng cho vào ống 10 ml mẫu thử dạng lỏng, 10 ml huyền phù ban đầu trường hợp mẫu thử dạng khác c) Lấy ba ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ - Dùng pipet vô trùng cho vào ống ml mẫu thử dạng lỏng, ml huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) mẫu thử dạng khác d) Đối với dung dịch pha loãng (10-1 10-2 tùy theo mẫu thử), tiến hành theo3.4.3 Sử dụng pipet vơ trùng cho độ pha loãng Trộn kỹ dịch cấy với môi trường 3.5 Nuôi Ấm Ủ ống nghiệm chứa môi trường chọn lọc nồng độ kép cấy ống chứa môi trường chọn lọc nồng độ đơn cấy 3.4.3 đến3.4.4 tủ ấm 37ºC 24 h ± h 3.6 Cấy truyền Từ ống ủ cho thấy có axit, có màu vàng, cấy truyền vịng cấy vào đĩa thạch trypton mật glucuronid ria cấy để thu khuẩn lạc tách biệt rõ 3.7 Ủ lần hai Ủ đĩa cấy từ 20 h đến 24 h tủ ấm 44ºC Không chồng cao ba đĩa ... (dương tính yếu βtrời glucuronidaza) Tính chọn lọc 37ºC/24h E. faecalis ATCC Định lượng 29212 19433 Khơng phát triển 2.3 Dung dịch pha lỗng mẫu: a) Dịch muối peptone THÀNH PHẦN G/ML Pepton từ casein... trưng chứng Khả phát triển 37ºC/24h E. Coli ATCC Bán định lượng Sinh axit Chuyển sang màu vàng 25922 8739 Tính chọn lọc 37ºC/24h E. faecalis ATCC 29212 19433 Định lượng Không phát triển - Bảng 2.2.2... chứng Khả 44ºC/20h đến phát triển 24h E. Coli ATCC 25922 8739 trưng Định lượng Phát triển tốt Các khuẩn lạc (2) có màu xanh đến xanh da trời E. Coli NCTC Định lượng Phát triển tốt Các khuẩn lạc