Đang tải... (xem toàn văn)
Thực tập Vi Sinh Y Cần Thơ chi tiết, đầy đủ hình ảnh CTUMPThực tập Vi Sinh Y Cần Thơ chi tiết, đầy đủ hình ảnh CTUMPThực tập Vi Sinh Y Cần Thơ chi tiết, đầy đủ hình ảnh CTUMPThực tập Vi Sinh Y Cần Thơ chi tiết, đầy đủ hình ảnh CTUMPThực tập Vi Sinh Y Cần Thơ chi tiết, đầy đủ hình ảnh CTUMP
@mihkhar Thực tập VI SINH Bài 1: SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM VI SINH Kiến thức cần nắm Đèn cồn: có phần gồm phần có màu sáng xanh, nhiệt độ khoảng 400oC phần ngồi có màu đỏ, nhiệt độ khoảng 1700oC => Dùng để tiệt khuẩn dụng cụ Vòng cấy-Kim cấy: làm kim loại Platin chrome, thường sử dụng vịng cấy 10 micromet, cấy định lượng khoảng micromet, cầm nghiêng 45 độ đưa vào tâm lửa đèn cồn, tránh vi khuẩn bắn xung quanh => Dùng để lấy vi khuẩn Hộp Petri: môi trường cấy cho vào hộp Ống nghiệm: nắp ống nghiệm cặp ngón tay út vào lịng bàn tay, mở ống nghiệp phải nghiêng góc 45o, lấy vi khuẩn phải thực gần đèn cồn Kính hiển vi quang học *Độ chiết xuất: đơn vị đo lường tốc độ tương đối ánh sáng xuyên qua vật chất Bài 2: PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Bác sĩ định bác sĩ muốn sử dụng thuốc điều trị theo kinh nghiệm bác sĩ chẩn đoán cần cho thuốc liền Kiến thức cần nắm Nguyên tắc: chất cồn tẩy màu tím vi khuẩn gram âm Thuốc nhuộm: +Tím gentian +Dung dịch lugol +Cồn 95o +Đỏ safranin Thực hiện: Làm phết => Gentian (10s) => Rửa nước => DD lugol (20s, giúp VK giữ màu)=> Rửa cồn 95o (5s, tẩy màu VK gram âm) => Rửa nước => Đỏ safranin (10s, VK gram âm bắt màu)=> Rửa nước => Thấm khơ => Quan sát vật kính X100 @mihkhar Ý nghĩa: +Kết chung sớm +Kết gợi ý +Kết tin cậy để nuôi cấy, phân lập +Mẫu không cần khảo sát trực tiếp Đọc kết : Hình dạng Màu sắc Cách xếp Cầu Gram âm: đỏ Gram dương: tím Đơn Đơi => Song cầu Chùm Chuỗi Trực Đơn Đôi Dây Đám Song cầu gram âm hình hạt đậu Song cầu gram dương hình mũi giáo Song cầu=> Hình mũi giáo, Gram dương, Xếp đôi Liên cầu khuẩn,Gram dương,Xếp thành chuỗi @mihkhar Trực khuẩn, Gram âm + Gram dương, Xếp rải rác (Cầu khuẩn, Gram dương, Xếp thành chùm) + (Trực khuẩn, Gram âm, Xếp rải rác “đơn, đôi, đám”) Bài 3: PHƢƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG ACID (phƣơng pháp nhuộm Ziehl-Neelsen) Phương pháp dành riêng cho loại trực khuẩn mà ta phân biệt Gram âm hay Gram dương => Xét nghiệm thường quy bệnh lao (hoặc phong), gọi PP AFB Kiến thức cần nắm Mycobateria: trực khuẩn dài, mãnh, phân nhánh dạng sợi Vỏ tế bào có lớp dày => 40% lipid => Khơng ăn màu thuốc nhuộm hết, kháng lại xâm nhập phẩm nhuộm=> Vỏ lipid bị giãn nở nhiệt độ Ăn màu với carbonfuchsin (5-10p) đun nóng khơng tẩy màu Bệnh phẩm: mẫu đàm (bao gồm: VK thường trú, VK gây bệnh, VK lao, tế bào niêm mạc đường hô hấp=> tế bào trụ, tế bào niêm mạc miệng => tế bào vẩy, tế bào bạch cầu, nấm) => lao phổi (5ml) Thuốc nhuộm: +Carbonfuchsin (đỏ hồng) +Xanh methylen (màu nền) +DD cồn-acid (cồn 70o acid chlohydric 3%) (tẩy màu) Thực hiện: phủ carbonfuchsin => hơ lam đến bốc (10s) => hơ lần => rửa nước để lớp sáp đông lại => Tầy màu dd cồn acid => Rửa nước => Phủ xanh methylen (1p)=> Rửa => Thấm khô Kết (Là BS phải đọc KQ): -Trả lời: có hay khơng AFB +TH âm tính: chưa chắn bệnh nhân khơng mắc bệnh @mihkhar +TH dương tính: chắn bệnh *Dấu (+) biểu mức độ lây lan cộng đồng -Một XN có độ đặc hiệu cao, (+) => Chắc chắn mắc bệnh -Một XN có độ nhạy thấp, (-) => Quá bình thường -Độ nhạy 100 người mắc bệnh, người xác định (+) -Độ đặc hiệu 100 người không mắc bệnh, người xác định (-) XN tìm AFB đàm có độ nhạy thấp, độ đặc hiệu cao, có nghĩa kết (-) cao, kết (+) thấp, BN (+) chắn bệnh nhân mắc bệnh Khi thi: Chỉ quan sát quang trường nên không xđ mức độ (+) => Chỉ cần trả lời có hay khơng có trực khuẩn kháng acid +Nếu có trực khuẩn dài, mảnh, bắt màu đỏ xanh : có trực khuẩn kháng acid +Khơng có: Khơng tìm thấy trực khuẩn kháng acid Hình ảnh trực khuẩn kháng acid sau thời gian bệnh nhân sử dụng phác đồ điều trị bệnh => Đứt đoạn trực khuẩn @mihkhar (Hình ảnh nhìn thấy cặn thuốc nhuộm) Bài 4: PHÂN LẬP VI KHUẨN Khi bệnh nhân mắc bệnh nhiễm trùng đến với bác sĩ => Cần nuôi cấy, phân lập vi khuẩn, định danh vi khuẩn lập kháng sinh đồ Kiến thức cần nắm Nguyên tắc: Phân lập vi khuẩn tách rời VK từ hỗn hợp dựa nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy (áp dụng phương pháp cấy vạch ba chiều) Môi trường: thạch agar NA (trong TH VK khó mọc: bỏ vào hộp thạch 5% máu cừu ngựa) Phương pháp cấy: -Chia hột thạch thành phần, khử trùng vòng cấy -Cấy lần 1: Vùng 1,2; 1/3 đường kính => Đốt vịng cấy, để nguội -Cấy lần 2: Vùng 2,3; 1/3 đường kính => Đốt vịng cấy, để nguội -Cấy lần 3: vùng 3,4, S lại @mihkhar -Đặt ngược hộp thạch, ủ 37o, 18-24h Khi thi -Đọc kết quả: Có loại khúm loại khuẩn lạc? (Lưu ý: Khi xét kích thước có loại VK phải xét đường cấy, không xét đường cấy riêng biệt tùy vào mật độ chất dinh dưỡng => Ảnh hưởng đến kích thước VK đường cấy khác nhau) (Đường cấy thứ có vị trí VK màu vàng lượng đường lactose nên VK chưa kịp lên men @mihkhar (Khi chọn tác nhân gây bệnh có loại khuẩn lạc) Thi gặp loại @mihkhar Bài 5: KHÁNG SINH ĐỒ Mục đích tìm độ nhạy VK với thuốc kháng sinh Định tính : Kirby-Bauer Định lượng: -Pha loãng ống nghiệm -E-test Kiến thức cần nắm Phương pháp Kirby-Bauer Nguyên tắc: -Đĩa giấy tẩm kháng sinh => Khuếch tán => Vịng vơ khuẩn -Đường kính vịng vơ khuẩn phản ánh mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh Vật liệu -Đĩa kháng sinh: ĐK = 6mm Bảo quản ống chứa chất chống ấm to -4oC, chuẩn bị thử nghiệm lấy 2-8oC, chuẩn bị làm để nhiệt độ phòng từ 1-2h *Tiêu chuẩn lựa chọn kháng sinh: +Đại diện cho nhóm phổ tác dụng +Tùy thuộc vào loại VK +Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn +Chính sách sử dụng kháng sinh vùng -Mơi trường: MHA; MHA có trộn máu; pH 7,2-7,4; dung dịch chuẩn độ đục BaSO42H2O (McFaland 0,5) 108 CFU/ml -Mầm cấy:thuần nhất, lấy từ khuẩn lạc sau ủ 18-24h (3-4 khúm), 108 CFU/ml -Vi khuẩn kiếm chứng: +Chưa có biểu kháng thuốc +Kiếm tra chất lượng môi trường đĩa kháng sinh +Thực // với thử nghiệm KSĐ VK phân lập từ bệnh nhân +Các VK thường sử dụng: ATCC @mihkhar Thực hiện: Dùng tampon vô khuẩn trải VK hộp thạch MHA => Đặt đĩa kháng sinh lên => U 35-37 oC từ 18-24h=> Đo ĐK vịng vơ khuẩn => So sánh => Kết luận Khi thi Ví dụ: Erythomycine: Đo 32mm so với (22-30) Ta cần hiểu là: +Từ 22 trở xuống đề kháng: Resistant (R) +Tử 22-30 trung gian: Intermediate (I) +Từ 30 trở lên nhạy cảm: Sensitive (S) Vậy trường hợp kết luận nhạy cảm Ý nghĩa: -Kết định tính - Nhạy cảm (chọn lựa KS sử dụng, phụ thuộc vào địa BN, dược ĐH, dược LH); Đề kháng (không sử dụng KS); Trung gian (có thể sử dụng được) Phương pháp pha lỗng liên tiếp (có thể pha lỗng thạch ống nghiệm) Nguyên tắc -Dựa vào tương quan nồng độ kháng sinh tăng trưởng VK để xác định độ nhạy cảm VK kháng sinh @mihkhar -Xác định nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh VK (MIC: minimal ihibitory concentration) (~ nồng độ kháng sinh thấp mà VK bị ức chế) -Môi trường dinh dưỡng lỏng (NB) -Dụng cụ khác (ống nghiệm, ) Thực hiện: (chú ý độ đục mầm cấy 105 CFU/mL): theo thứ tự từ đến 10 thì: -Nồng độ kháng sinh giảm dần từ 1-9 0,5 ml KS 200um/mL -Kháng sinh pha lỗng -Ống 1: khơng có mtr dinh dưỡng -Ống 10: khơng có kháng sinh -Vi khuẩn cho hết vào ống nghiệm -Ống 2-9: có KS, MT, VK Khi thi: đọc ống MIC *Ống cuối ống có nồng độ kháng sinh thấp cịn có khả ức chế vi khuẩn (xác định MIC không đồng nghĩa xác định vi khuẩn kháng hay không kháng thuốc) Chú ý: +Trong trường hợp tất ống đồng nghĩa với việc kháng sinh pha lỗng cịn cao, phải pha lỗng thấp dần +Trong trường hợp tất ống đục kháng sinh pha loãng có nồng độ thấp 0,5 ml mtr dd -Canh cấy VK trẻ 1ml (0,5 KS 200ucm/mL + 0,5 mtrdd) Vật liệu: @mihkhar Choose the correct answer: Môi trường sau cấy thẳng xuống đáy ống nghiệm? A KIA () B SIM C Citrate D MR-VP Môi trường giúp phát VK sinh H2S? A KIA () B SIM () C Citrate D MR-VP Môi trường giúp khảo sát di động VK? A KIA B SIM () C Citrate D MR-VP Môi trường giúp phát VK sử dụng carbon nguồn lượng nhất? A KIA B SIM C Citrate () D MR-VP Chỉ thị màu mơi trường citrate là: A Đỏ trung tính @mihkhar 10 11 12 13 14 B Đỏ phenol C Bromothymol Blue () D Promo Methylene Blue Chỉ thị màu môi trường Ure là: A Đỏ trung tính B Bromothymol Blue C Đỏ phenol () D Đỏ cánh sen Môi trường sau môi trường bán lỏng? A KIA B SIM () C Citrate D MR-VP Môi trường sau môi trương đặc? A KIA () B SIM C Citrate () D MR-VP Tỉ lệ đường Glucose/Lactose môi trường KIA là: A 1/10 () B 1/100 C 10 D 100 Chỉ thị màu nhận biết môi trường KIA thị màu sau đây? A Đỏ phenol () B Đỏ trung tính C Xanh methylene D Bromothymol Blue Thành phần môi trường KIA giúp phát sinh H2S? A Lactose B FeS () C H2S D Glucose Môi trường cấy 2/3 thạch? A KIA B SIM () C Citrate D MV-VP Môi trường phát VK sinh Urease? A KIA B SIM C Citrate D Ure () Môi trường phát VK sinh men tryptophanase? @mihkhar A B C D KIA SIM () Citrate Ure *Quy triình định danh VK: Bệnh phẩm => Cấy phân lập (MC, EMB, SS) => Chọn khúm, nhuộm gram => Thử nghiệm sinh hóa => Cấy vào mtr sinh hóa => Định danh, lập KSĐ *Cách lấy bệnh phẩm -Đúng thời điểm -Đúng nơi -Đúng cách -Bảo quản -Vật chứa bệnh phẩm thích hợp BÀI 7: ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN Kiến thức cần nắm Các thử nghiệm định danh cầu khuẩn Gram dương (Chủ yếu nắm nguyên tắc cách đọc kết quả): Tiêu huyết: Nguyên tắc: -Một số loại VK sinh hemolysin làm ly giải hồng cầu -Steptococci gây ly giải hồng cầu hoàn tồn (tiêu huyết ) khơng hồn tồn (tiêu huyết ) -Quan sát môi trường Blood Agar Đọc kết quả: @mihkhar Tiêu huyết 𝛽 (tiêu huyết hoàn toàn) Hồng cầu bị ly giải hồn tồn, tạo nên vịng tiêu huyết sáng Hồng cầu bị ly giải khơng hồn tồn, tạo nên vòng tiêu huyết mờ, ánh lên màu xanh, vàng Khơng tạo vịng tiêu huyết Thử nghiệm Catalase (Không thử nghiệm môi trường thạch máu=> Gây (+) giả) Nguyên tắc: 2H2O2 2H2O +O2 (sủi bọt) (pư men Catalase thủy phân) -Men catalase có tụ cầu, dùng để phân biệt tụ cầu với liê ncầu phế cầu Đọc kết quả: @mihkhar Thử nghiệm Coagulase: dùng để định danh tụ cầu vàng (phân biệt S.aureus với Staphylococci khác) Nguyên tắc: -Coagulase gây đông huyết tương -Coagulase diện dạng: +Coagulase tự +Coagulase liên kết Đọc kết quả: Thử nghiệm lam => Tìm Coagulase liên kết Thử nghiệm lên men Mannitol Nguyên tắc: Thử nghiệm ống nghiệm => Tím Coagulase tự @mihkhar -S aureus có khả lên men đường mannitol mtr MSA, acid sinh làm đổi màu môi trường từ đỏ sang vàng -Môi trường MSA (Mannitol Salt Agar): NaCl 7,5%, Mannitol, Chất thị màu đỏ phenol Đọc kết quả: Thử nghiệm Taxo A Nguyên tắc: Streptococcus tiêu huyết nhóm A (S.pyogennes) nhạy cảm với bacitracin => Phân biệt Streptococcus tiêu huyết nhóm A với Streptococcus thuộc nhóm khác Đọc kết quả: Thử nghiệm Taxo P Nguyên tắc:Pneumococci nhạy cảm với Optochin=> Phân biệt Pneumococcus với Streptococcus tiêu huyết khác Đọc kết Thử nghiệm kháng Novobiocin Nguyên tắc: S.saprophyticus đề kháng với novobiocin Đọc kết quả: @mihkhar Thử nghiệm CAMP Nguyên tắc: Streptococci nhóm B tiết yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với -hemolysin S.aureus Đọc kết quả: Thử nghiệm Bile-Esculin Nguyên tắc: Đọc kết quả: Màu đen (+) Khơng có màu đen (-) @mihkhar 10 Thử nghiệm tan muối mật Đọc kết quả: 11 Thử nghiệm ASLO Nguyên tắc: -Độc tố Streptolysin O liên cầu gây ly giải hồng cầu -Kháng thể ASLO có khả trung hịa độc tố streptolysin O, hồng cầu khơng bị ly giải -Thử nghiệm ASLO xác định hiệu giá Kháng thể ASLO huyết bệnh nhân Đọc kết quả: -Không tan máu (+) -Tan máu (-) 12 Thử nghiệm phồng nang: Nguyên tắc: -Pneumococcus gây bệnh có lớp vỏ nang bên ngồi tế bào -Lớp vỏ phồng to gặp kháng tương ứng Đọc kết quả: @mihkhar Cầu khuẩn *Staphylococci (Tụ Cầu Khuẩn): Đặc điểm: -Cầu khuẩn Gram dương (+), chùm nho -Môi trường nuôi cấy thông thường -Mọc NaCl 7,5% (tính chất mà nhóm cầu khuẩn gram dương khác khơng có) -30 loại, thường gặp là: S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus, Tính chất sinh hóa: -Gây tiêu huyết (tiết hemolysin) không tiêu huyết môi trường BA -Thử nghiệm Calase (+), phân biệt với liên cầu, phế cầu -Mọc môi trường MSA (NaCl 7,5%) *Streptococci (Liên Cầu Khuẩn) -Cầu khuẩn Gram dương (+), xếp thành chuỗi -Môi trường ni cấy giàu dinh dưỡng -Mọc khí trường 5-10% CO2 (ủ bình nến) -Gây tiêu huyết , tùy VK môi trường BA @mihkhar *Pneumococci (Phế cầu khuẩn) -Cầu khuẩn gram dương (+), hình nến, xếp đơi -Mơi trường ni cấy giàu dinh dưỡng -Mọc khí trường 5-10% CO2 (ủ bình nến) -Tiêu huyết mơi trường BA *Song cầu Gram âm (Neisseria) @mihkhar -Gram âm (-), hạt coffee, đứng thành đôi, mặt lõm quay vào -Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng -Mọc khí trường 5-10% CO2 Tính chất sinh hóa: Oxidase (+) Calalase (+) Test lên men đường nhanh BÀI 8: THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH GIANG MAI Xoắn khuẩn: -Borrelia: B recurrentis => Sốt hồi quy -Treponema: T pallidum => Bệnh giang mai -Leptospira => Bệnh leptospira Kiến thức bổ sung bệnh giang mai: -Tác nhân: Xoắn khuẩn Treponema pallidum, phân lập 1905 +Hình sóng sin +Chuyển động xoay trịn +Khơng ni cấy -Gồm: @mihkhar +Giang mai mắc phải: thời kí => thời kì => thời kì Thời kì Đặc điểm Thời kì Thời kì Thời kì -Từ 10-90 ngày sau -Từ 2-12 tuần sau -Từ vài năm-vài chục nhiễm khuẩn có săng năm -Có săng giang mai, -Sốt, rụng tóc, nốt -Gơm giang mai, lây hạch hồng ban -Lây lan mạnh -Lây lan mạnh +Giang mai bẩm sinh: Xoắn khuẩn qua thai => Sẩy thai, thai chết lưu, thai đẻ non + Giang mai bẩm sinh sớm/muộn Kiến thức cần nắm Thử nghiệm không đặc hiệu: Nguyên tắc: Dùng kháng nguyên cardiopipin tìm reagin máu bệnh nhân Gồm: -Phản ứng lên VDRL (Veneral Disease Research Laboratories) -Phản ứng kết hợp bổ thể BW (Bordet-Wassemann) -Phản ứng ngưng tụ RPR (Rapid Plasma Reagin) Đối với phản ứng ngưng tụ RPR, thì: -Nguyên tắc: Dùng kháng nguyên cardiopipin gắn hạt carbon tìm kháng thể reagin máu bệnh nhân -Bộ thuốc thử: -Thực hiện: Trộn huyết bệnh nhân vài giọt dung dịch chứa kháng nguyên gắn hạt carbon => Để lên máy lắc vòng 1p -Đọc kết @mihkhar +Kết cụm hạt màu đen => (+) +Không kết cụm => (-) Thử nghiệm đặc hiệu: Gồm: -TPI (Treponema pallidum immobillisation) (dùng chủ yếu nghiên cứu) -FTA (Flourescene Treponema Antibody) (Thử nghiệm kháng thể huỳnh quang) (so complex and expensive => For study and research) -TDIA (Treponema pallidum immunoadherence) -TPHA (Treponema pallidum hemmaglutination assay) (phổ biến) Đối với thử nghiệm TPHA: -Nguyên tắc: Dùng hồng cầu già phủ kháng ngun Treponema pallidum (dịng Nichol) liên kết với kháng thể chuyên biệt có huyết bệnh nhân => Phát kháng thể đặc hiệu xoắn khuẩn giang mai máu bệnh nhân -Bộ thuốc thử: -Đọc kết quả: Thử nghiệm cho kết định tính định lượng @mihkhar +Thử nghiệm định tính: Nhỏ tế bào thử nghiệm huyết BN vào giếng, sau đỏ đem ủ +Thử nghiệm định lượng: Đọc kết quả: Hồng cầu kết thành mạng bao phủ toàn đáy giếng => (+) Hồng cầu đọng thành nút đỏ => (-) Đọc giếng dương tính cuối cùng, nồng độ huyết pha loãng => Hiệu giá kháng thể (tử 1, mẫu số lớn chứng tỏ nồng độ kháng thể huyết người cao) Nhận định kết phản ứng kháng nguyên kháng thể: -KQ định tính -KQ định lượng: pha loãng huyết thanh, nồng độ thấp cho dương tính => Hiệu giá kháng thể -Ranh giới hiệu giá:giá trị hiệu giá trung bình quần thể người định (ngồi cộng đồng) -KQ dương tính giả: KQ xét nghiệm dương tính thực khơng có kháng thể -KQ âm tính giả: máu BN có kháng thể kết lại âm tính -XN sàng lọc/ XN xác định: @mihkhar +XN sàng lọc: Dùng xét nghiệm khơng đặc hiệu để sàng lọc ngồi cộng đồng (có thể xuất dương tính giả) +XN xác định: Dùng xét nghiệm đặc hiệu để loại số người dương tính giả Kiến thức cần lưu ý: Một số lưu ý xét nghiệm huyết học: -XN HTH => Tìm kháng thể máu -Thời gian xuất kháng thể: (IgG + IgM => Liên quan mật thiết với tình trạng nhiễm trùng, IgG kháng thể truyền từ bà mẹ qua thai) -Hiệu giá kháng thể -Lấy máu lần ... Gram dương (Chủ y? ??u nắm nguyên tắc cách đọc kết quả): Tiêu huyết: Nguyên tắc: -Một số loại VK sinh hemolysin làm ly giải hồng cầu -Steptococci g? ?y ly giải hồng cầu hoàn toàn (tiêu huyết ) khơng hồn... Shigella, cần c? ?y Shigella môi trường sau đ? ?y? A MC () B EMB () C SS () (Riêng mtr SS c? ?y mọc Shigella) D BA Môi trường MC, EMB, SS, ta chọn kĩ thuật c? ?y sau đ? ?y? A C? ?y vạch ba chi? ??u B C? ?y định... @mihkhar (Hình ảnh nhìn th? ?y cặn thuốc nhuộm) Bài 4: PHÂN LẬP VI KHUẨN Khi bệnh nhân mắc bệnh nhiễm trùng đến với bác sĩ => Cần nuôi c? ?y, phân lập vi khuẩn, định danh vi khuẩn lập kháng sinh đồ