TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Tiểu luận: Chuẩn đốn virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) kĩ thuật gen Giảng viên Sinh viên thực PGS TS Nguyễn Ngọc Hải Đỗ Phong Lưu Tp.HCM tháng 10/2009 06126076 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn ni nói chung hay chăn ni heo nói riêng có vị trí quan trọng ngành nơng nghiệp nguồn cung cấp thực phẩm cho nhân dân phân bón cho sản xuất trồng Không hàng năm chăn ni heo cịn đem nguồn thu nhập ngoại tệ đáng kể cho kinh tế quốc dân Trong q trình chăn ni, vấn đề dịch bệnh xem trở ngại lớn việc phát triển đàn heo Một lọai dịch bệnh thường nhắc đến nhiều thời gian gần dịch“heo tai xanh”, hay gọi “ Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp” lợn (PRRS) làm nghề chăn nuôi lợn điêu đứng Đây bệnh truyền nhiễm cấp tính virus lợn với hội chứng vừa gây rối loạn sinh sản lợn cái: sảy thai, chết thai, sinh chết yểu, vừa gây hội chứng viêm đường hô hấp lợn theo mẹ, lợn sau cai sữa Bệnh phát lần Mỹ (1987) nghiên cứu tìm virus gây bệnh Hà Lan (Viện Thú y Lelystad,1990) Bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn cho nghề chăn nuôi lợn hầu hết nứơc giới Đầu năm 2007, dịch bệnh tai xanh bùng phát, lây lan nhanh phạm vi 13 tỉnh khắp miền: Bắc – Trung – Nam, dịch nặng vùng Đồng sơng Hồng với tỉnh có dịch Tổng số lợn ốm khoảng gần 70.000 con, 15.000 bị chết phải xử lí Nguyên nhân làm cho lợn mắc bệnh chết nhiều virus PRRS có nhiễm khuẩn kế phát số vi khuẩn gây bệnh đường hơ hấp, nguy hiểm có nhiều bệnh lây nhiễm sang người gây tử vong cho người Đứng trước thực trạng đó, việc chọn phương pháp hữu hiệu để chuẩn đoán virus PRRS cấp bách cần thiết, nhằm kiểm tra nhanh chóng xác sức khỏe đàn lợn qua đảm bảo an tồn cho người sử dụng Với vấn đề này, em tập trung tìm hiểu phương pháp chuẩn đốn virus PRRS kỹ thuật gen.Có thể tiểu luận nhiều vấn đề em chưa trình bày thoả đáng, kính mong thầy bạn góp ý để hồn thiện I TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH PRRS I.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) bệnh xảy lợn với đặc điểm gây sảy thai lợn nái rối loạn đường hô hấp lợn sơ sinh lợn choai (Christianson ctv, 1992) Bệnh phát lần Bắc Mỹ vào khoảng năm 1987, sau tìm thấy Châu Âu (Albina, 1997), Pháp, Tây Ban Nha, Canada Châu Á vào đầu năm 1990 (Murakami ctv, 1994; Shimizu ctv, 1994) Cho đến nay, PRRS lan rộng vùng khắp giới với đặc trưng chủng khác vùng, gây thiệt hại kinh tế nặng nề hàng năm (Albina, 1997; Blaha, 2000; Gao, 2004) Ở Việt Nam, bệnh phát vào năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 có huyết dương tính) Các nghiên cứu bệnh trại lợn giống tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết dương tính với bệnh khác nhau, từ 1,3% 68,29% Ở nước khác, tỷ lệ đàn vùng bệnh có huyết dương tính cao, Anh 60-75%, Mỹ 36% (Phòng Dịch Tễ – Cục Thú y, 2007) II.2 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRSV) PRRS Arterivirus gây nên – loại virus phân lập định loại vào năm 1991, xếp vào loài Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus, gần với equine arteritis virus (EAV), Lactic Dehydrogenase virus (LDHV) simian hemorrhagic fever virus (SHFV) (Dea ctv, 2000), có kích thước vào khoảng 50-70nm, chịu nhiệt độ thấp (tồn tháng nhiệt độ -70oC) II.3 Các chủng virus PRRS phân bố chúng Hiện có dịng gây bệnh Mĩ Châu Âu Các nghiên cứu phân tử cho thấy virus gây PRRS Châu Âu Mĩ tương đồng 60% nguyên liệu di truyền (bộ gene virus) Tùy theo ORF mà tương đồng gene dòng PRRSV châu Mĩ châu Âu dao động từ 52-81% I.4 Cấu trúc phân tử virus PRRS I.4.1 Cấu trúc virion PRRSV virus có vỏ bao, đường kính khoảng 50-70 nm Virus dài khoảng 15kb gồm khung đọc mở ORF Cho đến nay, người ta xác định cấu trúc PRRSV : - Gene mã hóa protein vỏ glycoprotein (ORF 5, khoảng 24-25 kDa) - Gene mã hóa protein nhân nucleocapsid (ORF7, khoảng 15 kDa) - Gene mã hóa protein màng (ORF6, khoảng 19 kDa) 4.2 Tổ chức gen PRRS virus Chuỗi hệ gen đầy đủ virus PRRS xác lập vào năm 1993, có kích thước khoảng 15,1 đến 15,5 kb chứa khung đọc mở nằm bên sườn hai vùng không dịch mã (untranslate region - UTR) 5’UTR 3’UTR, có cấu trúc mũ methyl đầu 5’ poly (A) 3’ (hình 2.2) Ngồi ra, khung đọc mở bên (internal ORF) tìm thấy ORF2 virus PRRS (Snijder ctv, 1999) ORF 1a 1b định vị xi dịng từ đầu 5’-UTR, chiếm giữ khoảng 75% gene ghi mã protein không cấu trúc, liên quan đến nhân virus (Meulenberg ctv., 1997; Dinten ctv., 1999) ORF1a dịch mã trực tiếp ORF1b dịch khung dịch chuyển ribosomal Chuỗi protein ORF1ab liên quan đến chép virus phận (Allende ctv, 1999) ORF 2-7 định vị ngược dịng từ 3'-UTR, mã hóa loạt protein cấu trúc virus như: protein vỏ (E) protein vỏ nhân capsid (N) (Nucleocapside protein) (Nelson ctv, 1995) Các protein dịch mã từ 3’ UTR định vị cố định đoạn subgenomic mRNAs (sg mRNAs) (Eric Janneke, 1998) Các sg mRNAs đựơc sản xuất thông qua mã mRNA khơng liên tục Trình tự “leader” chung thu từ đầu 5’ genomic mRNA gắn với trình tự thân 3’ (3' terminal body sequence), trình tự khơng liên tục gen (Meulenberg ctv., 1993) Sự liên kết “leader” vùng thân sg mRNA hình thành nhờ “trình tự điều hoà dịch mã” liên ứng (consensus “transcriptional regulatory sequence” - TRS) yếu tố điều khiển quan trọng cho biểu gen cấu trúc Sg mRNA chia sẻ đuôi 3’ nó, ORF đầu 5’ dịch mã việc dùng TRS promoter (Yuan ctv., 2004) Hình 1.3 Tổ chức gen mơ hình nhân virus PRRS (Nguồn: Snijder, 1998) (a) Bộ cấu trúc lồng vào RNA arterivirus; (b) mã khơng liên tục xảy q trình tổng hợp RNA sợi (+); (c) mơ hình khác kết hợp chặt chẽ với tổng hợp RNA sợi (-) không liên tục (+) sợi dương; (-) sợi âm I.5 Cơ chế gây bệnh Virus PRRS xâm nhập nhân lên đại thực bào (các tế bào có tác dụng bắt tiêu diệt tác nhân gây bệnh) Khi hình thành virion, virus phá hủy đại thực bào làm suy yếu sức đề kháng thể I.6 Phân bố bệnh Tuy phát lần vào năm 1987 Mĩ số nghiên cứu dịch tễ học cho bệnh lưu hành trước Canada Bệnh xuất Châu Âu vào năm 1990 hiên lưu hành nhiều nước thuộc châu lục Các kiểm tra huyết học virus học cho thấy PRRS có mặt Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mĩ, nước vùng Ca-ri-bê Trong ngày gần đây, bệnh xuất nhiều địa phương nước ta Cũng virus khác, virus gây PPRS tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn cư trú thể liên cầu khuẩn tăng độc lực gây bệnh I.7 Triệu chứng lâm sàng Căn vào biểu triệu chứng bệnh, người ta chia thành hai giai đoạn khác nhau: giai đoạn biểu triệu chứng rối loạn sinh sản lợn nái giai đoạn hai biểu triệu chứng hô hấp Trong khoảng 6-12 tuần có biểu bệnh đàn lợn Các triệu chứng giai đoạn hay triệu chứng sinh sản bao gồm: - Sốt 39-40 độ - Bỏ ăn - Mệt mỏi - Giảm tỷ lệ thụ thai số đẻ - Sảy thai (tỷ lệ đến 50% đàn bị nhiễm virus) - Giảm tiết sữa sữa hoàn tồn - Thai khơ (thai gỗ), chết thai - Đẻ non - Chậm động dục không động dục trở lại - Rối loạn sinh sản kéo dài đến vài tháng Giai đoạn biểu triệu chứng hô hấp: - Loạn hô hấp - Lợn biểu đau thở Các triệu chứng lợn con: - Tỷ lệ chết trước cai sữa cao - Lợn gày yếu - Bỏ ăn Các triệu chứng thuộc giai đoạn lợn con: - "Hắt hơi" - Tăng tần số hơ hấp, thở khó, thở đứt qng - Gày, yếu - Phù mắt, nốt phồng rộp da - Ỉa chảy, không vững run, đứng chỗi chân Lợn lớn có biểu sốt nhẹ, bỏ ăn Các triệu chứng khác nhẹ Lợn đực giống có biểu giảm hưng phấn, giảm thể tích chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực nồng độ tinh trùng) I.8 Bệnh tích - Đối với lợn nái, triệu chứng sảy thai, tăng tỷ lệ thai chết, lợn mắc bệnh thường khơng có bệnh tích đặc thù - Lợn thường mang bệnh tích rõ lợn lớn, bao gồm: + Dịch thẩm xuất đướng tiêu hóa đường hơ hấp (đặc biệt phế quản) + Phù + Thanh dịch xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc tung cách mạc + Sưng hạch bạch huyết + Da nhiều vùng có màu xanh tím Lưu ý : a/ Các bệnh sau gây triệu chứng rối loạn sinh sản - Bệnh Aujesszky - Bệnh xoắn khuẩn (Leptospirosis) - Bệnh lở mồm long móng - Bệnh sốt lợn cổ điển - Viêm dày ruột truyền nhiễm (do virus) - Parvovirus - Viêm não Nhật Bản b/ Các bệnh gây triệu chứng hô hấp dễ nhầm lẫn: - Bệnh cúm lợn - Viêm phế quản, phổi - Viêm phổi cúm không điển hình I.9 Đường truyền lây - Tiếp xúc lợn ốm lợn khỏe đường truyền lây bệnh nên bệnh lây cá thể đàn hay từ đàn sang đàn khác (nếu lợn bị bệnh chuyển đàn, chuyển trại ) Lợn mang virus giải phóng virus thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho cơng tác theo dõi phát khống chế bệnh - Tinh dịch lợn có khả nhiễm virus bệnh truyền qua đường sinh dục - Các chất tiết phân, nước tiểu lợn bệnh có khả có virus - Virus từ lợn bệnh truyền sang lợn khỏe qua dung cụ chăn ni - Virus có mặt hạch lâm ba, phổi với số lượng lớn nhiều thịt có khả độc lực điều kiện lạnh (khi thức ăn) Tuy vậy, khả truyền bệnh cho ăn phụ phẩm trình giết mổ gia súc bênh chưa xác định Tuy nhiên, tốt hết nên cách ly toàn đàn lợn có nguy với loại nguồn bệnh không cho ăn nội tạng từ lợn nghi mắc bệnh II Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đốn virus PRRS Có nhiều phương pháp để chuẩn đốn PRRS phịng thí nghiệm.Cụ thể : - Chẩn đốn PRRSV mơi trường ni cấy tế bào - Phương pháp kháng thể huỳnh quang (Fluorescent Antibody Staining - FA) hố mơ miễn dịch (immunohistochemistry staining - IHC) - Kỹ thuật miễn dịch peroxidase lớp(Immunoperoxidase Monolayer Asssay) - Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunoflourescence assay – IFA) - Kỹ thuật RT-PCR chẩn đốn PRRSV Trong tiểu luận em xin trình bày phương pháp chuẩn đoán virus PRRS sử dụng kỹ thuật RT-PCR RT-PCR phương pháp hữu dụng cho việc phát PRRSV (Van Woensel et al., 1994; Suarez et al., 1994) Bằng cách thiết lập cặp mồi chun biệt, RT-PCR phân biệt gữa dịng virus châu Mĩ dòng virus châu Âu (Mardassi et al 1994) Phương pháp đánh giá nhạy so với phương pháp ly trích virus từ tế bào PAM, dẫn đến kết dương tính giả Tuy vậy, RT-PCR công cụ hiệu việc xét nghiệm PRRSV từ mẫu tinh dịch mẫu mà hoạt động lây nhiễm virus bị suy yếu 10 II.1 Chuẩn bị mẫu PRRSV ly trích từ nhiều mơ thể khác nhau, thông thường, người ta thường sử dụng huyết thanh, tế bào lách phổi.Các tế bào tiến hành ly trích từ 4-6 tuần sau PRRSV xâm nhiễm heo (Ohlinger et al 1992; Butner et al., 1994) Sự xuất kháng thể chuyên biệt PRRSV chứng khẳng định có mặt PRRSV đại thực bào in vitro (Choi et al 1992) hay thể tiêm chủng (Christianson et al., 1993) Khi sử dụng đại thực bào túi phổi heo (PAM), không nên lấy mẫu từ heo bú mẹ, kháng thể nhận từ sữa heo mẹ làm tăng tính nhạy cảm PAM PRRSV Thơng thường, người ta thường lấy mẫu heo từ 4-7 ngày tuổi cho xét nghiệm heo Ngoài ra, người ta lấy mẫu từ huyết heo trưởng thành nái đẻ Sử dụng mẫu PAM cho kết xác việc xét nghiệm PRRSV heo Sự lựa chọn mẫu phụ thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh (cấp tính, hồi phục hay mãn tính) Trong trường hợp bệnh thể cấp tính, nên lựa chọn loại mẫu huyết thanh, phổi dịch phế nang để phân lập virus Nhưng bệnh thể mãn tính nên dùng loại mẫu hạch bạch huyết, hạch hạnh nhân, dịch khí quản dịch phế nang Các mẫu bệnh phẩm cần phải bảo quản nhiệt độ 40C hay thấp q trình vận chuyển mẫu đến phịng thí nghiệm thời gian giữ mẫu nhiệt độ tốt không 48 Những mẫu bệnh phẩm lưu giữ thời gian dài bắt buộc phải bảo quản nhiệt độ -700C, không giữ mẫu -200C, không đông rã đơng mẫu nhiều lần II.2 Ly trích RNA từ huyết Quy trình ly trích RNA theo kit QIAamp Viral RNA Mini Kit Ổn định mẫu điều kiện nhiệt độ phòng (15 – 250C) Ổn định buffer nhiệt độ phòng Kiểm tra buffer AW1 AW2 pha để ổn định nhiệt độ phòng 11 Hoà tan lại khối kết tủa Buffer AVL/Carrier RNA nhiệt cần thiết giữ nhiệt độ phòng trước sử dụng Tất bước ly tâm thực nhiệt độ phòng Bước 1: Cho 560 µl Buffer AVL có chứa Carrier RNA vào tube 1.5 ml Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào tube có chứa buffer Vortex nhẹ để trộn 15 giây Nếu mẫu cần phải rã đơng nên rã đơng lần Bước 3: Ủ nhiệt độ phòng (15-250C) vòng 10 phút (thời gian kéo dài chút) Bước 4: Ly tâm nhẹ Bước 5: Thêm 560 µl ethanol (96-100%), vortex nhẹ 15 giây, sau ly tâm nhẹ để mẫu dính bên rơi xuống Bước 6: Hút 630µl dịch cho vào QIAamp spin column (trong tube 2ml) Chú ý khơng làm dính vành, đóng nắp, ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) phút Cho QIAamp spin column vào tube ml loại bỏ tube có chứa dịch lọc (có thể ly tâm với tốc độ cao ) Bước 7: Mở QIAamp spin column lặp lại bước Bước 8: Mở nắp QIAamp spin column cách cẩn thận thêm 500 µl Buffer AW1, đóng nắp lại tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) phút Lấy QIAamp spin column cho vào tube ml Bỏ tube có chứa dịch Bước 9: Mở nắp QIAamp spin column cách cẩn thận, thêm 500 µl buffer AW2, đóng nắp lại ly tâm với tốc độ 20000 x g (14000 vòng) phút Có thể thực bước 10 hay thực bước 9a Bước 9a: Chuyển QIAamp spin column vào tube ml mới, loại bỏ tube cũ có chứa dịch lọc Ly tâm với tốc độ 14000 vòng phút Bước 10: Chuyển QIAamp spin column vào tube ly tâm 1,5 ml Loại bỏ tube cũ có chứa dịch lọc Cẩn thận mở nắp QIAamp spin column thêm 60 µl AVE Đóng nắp lại, giữ nhiệt độ phịng phút Sau ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) phút 12 II.3 Thực phản ứng RT-PCR RT-PCR thực với nhiều cặp mồi khác nhau, cho phép phát gene ORF7, ORF6 hay ORF1b virus RT-PCR thực với nhiều loại mẫu khác : máu, huyết thanh, mô, tinh dịch, dịch phế quản, dịch phổi…trên thể thú sống thú chết Đây ưu điểm quan trọng RT-PCR Một vài cặp mồi sử dụng kỹ thuật RT-PCR : - Rovira cộng sự, 2002 5’ CCT CGT CAA GTA TCG CCG GTA 3’ 5’GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC 3’ - Meritxel Donadeu, 1999 5’ CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG 3’ 5’ GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG 3’ - Helmi mardassi cộng sự, 1994 5’ ATG GCC AGC AGT CAA TCA 3’ 5’ TCG CCC TAA TTG AAT AGG TG 3’ Dưới thí nghiệm cho thấy khả chẩn đoán PRRSV PCR mẫu tinh dịch a/ Vật liệu thí nghiệm phương pháp - Mẫu tinh dịch : Nuôi cấy chủng virus PRRS ATCC VR-2402 đại thực bào túi phổi Heo dùng lấy mẫu tiêm 2ml chủng virus nuôi cấy nồng độ 106.5 Tinh dịch lấy lần tuần suốt tuần sau tiêm - Primers : Sử dụng loại primer khác : + Primer thiết kế từ ORF chủng virus VR-2332 Trong - Primer cho phản ứng outer PCR : 13 5’-TCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGC- 3’ (nucleotides 2763-2785) 5’-GCCATTCACCACACATTCTTCC- 3’ (nucleotides 3247-3225) -Primer cho phản ứng nested PCR : 5’-CCAGATGCTGGGTAAGATCATC-3’ (nucleotides 2885-2907) 5’-CAGTGTAACTTATCCTCCCTGA-3’ (nucleotides 3121-3099) + Primer thiết kế từ ORF 1b chủng virus Lelystad (LV) Trong : -Primer cho phản ứng outer PCR : 5’-CCGTCACCAGTGTGTCCAA-3’ (nucleotides 8751-8771) 5’-CCGTTCTGAAACCCAGCAT-3’ (nucleotides 9003-8984) -Primer cho phản ứng nested PCR : 5’-ACATGGTATTGTCGGCCTT-3’ (nucleotides 8803-8822) 5’-CGTTCTGAAACCCAGCATC-3’ (nucleotides 9002-8983) - RNA PRRSV phiên mã ngược kit GeneAmp RNA PCR (Applied Biosystems, Foster City, Cali) Phản ứng thực ống tube dầu (oil-free) Phản ứng thực sau : microliters dịch RNA hòa vào hỗn hợp có nồng độ cuối bao gồm : 5mM MgCl2, 1X buffer II ( 10X dung dịch đệm PCR bao gồm 500mM KCl 100mM Tris-HCl), 1mM loại dNTP, U enzyme Rnase cho µl, 2.5 U enzyme reverse transcriptase µl, 0.75 µM mồi ngược µl nước cất cho 20 µl dung dịch Tất hỗn hợp giữ đá lạnh chạy máy luân nhiệt chu kỳ gồm 420C 15 phút, 990C phút 50C phút - Quá trình PCR thực qua giai đoạn outer nested Giai đoạn : cho 80 µl hỗn hợp thực phản ứng PCR với nồng độ : 2mM MgCl2, 1X PCR buffer II, 0.15 µM primer outer, 2.5 U enzyme DNA Taq polymerase cho 100 µl, 65.5 µl nước cất vào sản phẩm trình phiên mã ngược Hỗn hợp (100 µl) 14 tiến hành phản ứng máy luân nhiệt 40 chu kỳ, bao gồm : 950C 25 giây, 580C giây 740C 25 giây Giai đoạn : cho µl sản phẩm outer PCR vào tube có nồng độ 3mM MgCl2, 0.4mM loại dNTP, 2.5 U enzyme DNA Taq polymerase cho 50 µl, 2.4 µM cho primer nested, µl dung dịch đệm PCR II 10X, 19.5 µl nước cất (tube chứa tổng cộng 50 µl) Quá trình thực 30 chu kỳ với thời gian nhiệt độ Sau kết thúc q trình phóng đại, µl sản phẩm đem hịa với µl dung dịch đệm 1X Hỗn hợp tiến hành điện di gel SeaKem agarose 1% ( FMC Bioproducts, Rockland, Maine) chứa µg ethidium bromide cho 2ml agarose Sử dụng thang đo DNA 100bp Các đoạn 484bp outer ORF 7, 252bp outer ORF 1b, 236bp nested ORF 7, 200bp nested ORF 1b quan sát thấy đèn chiếu UV b/ Kết : - Quan sát điều kiện khuếch đại tối ưu cho phản ứng PCR Để gia tăng mức độ đặc hiệu độ nhạy phản ứng PCR, nồng độ MgCl2 thử nghiệm từ 1.6-5 mM ; nồng độ primer dao động từ 0.2-0.4 µM ; nhiệt độ biến tính thay đổi 94, 95 980C ; nhiệt độ để primer bắt cặp với khuôn từ 50-580C số chu 30, 40 45 chu kỳ Kết thí nghiệm cho thấy với 5mM MgCl2, 0.4 µM primer, nhiệt độ bắt cặp biến tính 58 950C, thực 30 chu kỳ cho kết cao II.4 Điện di sản phẩm PCR Cách tiến hành: • Pha dung dịch TBE 0,5X 15 • Pha gel agarose với nồng độ 1% : cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml dung dịch TBE 0,5X Đun sơi lị vi ba 550W phút để agarose tan • Để nguội đến 50-550C Chuẩn bị khuôn Đổ agarose vào khuôn Chờ 30 phút để agarose đơng • Gỡ lược ra, để miếng gel vào bồn điện di Cho TBE 0,5X ngập miếng gel • Đặt mẫu vào giếng với tỉ lệ 1,5 µl loading dye µl sản phẩm PCR • Điện di 75 V, 30 phút • Nhuộm ethidium bromide 15 phút Sau rửa gel nhiều lần nước để loại bỏ bớt ethidium bromide dính bên ngồi miếng gel Chụp gel tia UV • Đọc kết điện di: kích thước vùng gene ORF5 723bp; ORF7 670 bp 723bp 660 bp 500 bp b 500 bp A B Hình 3.1 Sản phẩm sau điện di phản ứng RT-PCR (A) Sản phẩm sau điện di phản ứng RT-PCR đoạn ORF5 (723 nt); (B) Sản phẩm sau điện di phản ứng RT-PCR đoạn ORF5 (660 nt) - Độ đặc hiệu độ nhạy phản ứng PCR Các giống Arteriviruses khác (virus Arteritis ngựa virus Lactate dehydrogenase) không phản ứng với hai primer thiết kế từ đoạn ORF1b ORF7 genome PRRSV Primer thiết kế từ đoạn ORF7 không phản 16 ứng với sáu loại virus khác gây bệnh heo (transmissible virus, gastroenteritis virus, porcine respiratory coronavirus, rotavirus, pseudorabies virus, parvovirus swine influenza virus) Bảy chủng PRRSV phân lập thu nhận từ phòng nghiên cứu chẩn đoán bệnh thú thuộc trường đại học Nam Dakota kiểm tra với mồi ORF1b ORF7 Tất mẫu cho phản ứng với hai loại cặp mồi Nhóm nghiên cứu cho chạy phản ứng PCR, dùng hai loại primer với chủng PRRSV LV châu Âu Kết cho thấy LV phát primer thiết kế từ gene mã hóa polymerase (ORF1b LV) không phát primer thiết kế từ gene mã hóa nhân nucleocapsid (ORF7 VR-2332) Chủng VR-2332 dịng châu Mĩ lại phát hai loại primer (Hình 2.1) Hình 2.2 : Lai probe 32P-oligonucleotide đánh dấu phóng xạ lên sản phẩm PCR outer (O) (484bp) nested (N) (236bp) primer ORF7 Hình 2.1 : Bảng gel agarose 1% nhuộm Ethidium bromide cho thấy khả phát PRRSV chủng LV chủng VR2332 Primer thiết kế từ ORF1b ORF7 sử dụng cho phản ứng outer (O) nested (N) PCR Ta sử dụng ladder (L)100bp DNA làm thước đo 17 Hình 2.3 : Độ nhạy phản ứng outer (O) nested (N) PCR thể qua phản ứng nồng độ khác mẫu Kết điện di gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide Ladder (L) có độ dài 100bp Số lượng phân tử virus nồng độ 101 10 virion/ml 18 III Kết luận Trong kinh tế thị trường đòi hỏi người sản xuất tạo nhiều sản phẩm Việc nuôi heo thâm canh đáp ứng địi hỏi thị trường, tạo điều kiện thuận lợi cho chủng virus PRRS có hội phát triển đột biến tạo nhiều chủng có độc lực cao.Thơng qua tiểu luận ta phần hiểu rõ virus PRRS,nắm cấu tạo tác hại mà mang đến cho q trình chăn ni … Vì ,việc chọn phương pháp hiệu để chuẩn đoán virus PRRS cần thiết Trong tiểu luận em tập trung vào tìm hiểu phương pháp chuẩn đoán virus PRRS sử dụng kỹ thuật RT-PCR phương thức chuẩn xác nhanh chóng Tuy nhiên bên cạnh mặt tích cực phương pháp ta cần kể đến số hạn chế chi phí để tiến hành cịn cao vật liệu thiết bị sử dụng cho kỹ thuật đa phần nhập từ nước ngồi Bên cạnh độ nhạy phương pháp cao nên dễ dẫn đến tượng dương tính giả gây ảnh hưởng đến kết xét nghiệm cần ý trình tiến hành xem xét kỹ quy trình thực để có kết đáng tin cậy 19 IV Tài liệu tham khảo Nguyễn Thái Sơn ,Vai trò gây bệnh người H.pylori luận án tiến sỹ y khoa , Hà Nội ,2002,13-15 Đỗ Ngọc Liêm ,miễn dịch học sở , nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Ngọc Lanh , Văn Đình Hoa ( chủ biên năm 2003 ) miễn dịch học xuất lần II nhà xuất y học Hà Nội Vũ Triệu An , Jean claude Homberg (2001 )miễn dịch học in lần II có sủa chữa bổ sung , nhà xuất y học Hà Nội Nguyễn Ngọc Hải (2007), Công nghệ sinh học thú y, Nhà xuất Nông Nghiệp Phan Văn Chinh, giảng môn học bệnh truyền nhiễm, Khoa chăn nuôi thú Y, Trường Đại Học Nơng Lâm Hướng dẫn phịng trị bệnh ký sinh trùng,bệnh nội khoa nhiễm độc bò sữa PGS.TS Phạm Sỹ Lăng – PGS.TS Lê Văn Tạo NXB Nông Nghiệp Hà Nội,2006 Đỗ Ngọc Liêm ,miễn dịch học sở , nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội CHO H.J., MCNAB B., DUBUC C., JORDAN L., AFSHAR A., MAGAR R., PRINS S & EERNISSE K (1997) Comparative study of serological methods for the detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus Can J Vet Res., 61, 161–166 10 E KOSINOVA, I PSIKAL, Restriction fragment length polymorphism of ORF6 and ORF7 genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine strains registered in the Czech Republic, Veterinarni Medicina, 51, 2006 (8): 414–422 11 S INDIK, L VALÍČEK , Differentiation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus European vaccine strains from Czech field isolates by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF5 gene, Vet Med -Czech, 47, 2002 (10–11): 295–301 20 12 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (bệnh tai xanh) bệnh liên cầu khuẩn lợn PGS.TS Phạm Sỹ Lăng, TS Văn Đăng Kỳ, nhà xuất Nông Nghiệp 13 trang web: http://online.tvu.edu.vn/mod/scorm/player.php?a=1220¤torg=eXeTDL YBAI2470051721c248b61832&scoid=10682 www.porcilis-prrs.com http://aa.wrs.yahoo.com http://www.asifac.com.vn/sanpham/sanpham.php?Act=sp&Ca=1&xem=2 ……… 21 MỤC LỤC Đặt vấn đề I Tình hình dịch bệnh PRRS .5 I.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn I.2 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRSV) I.3 Các chủng virus PRRS phân bố chúng I.4 Cấu trúc phân tử virus PRRS I.5 Cơ chế gây bệnh I.6 Phân bố bệnh I.7 Triệu chứng lâm sàng I.8 Bệnh tích .10 I.9 Đường truyền lây 11 II Một số phương pháp chẩn đốn phịng thí nghiệm 12 II.1 Chuẩn bị mẫu 13 II.2 Ly trích RNA từ huyết .13 II.3 Thực phản ứng RT-PCR 15 III Kết luận 20 IV Tài liệu tham khảo 21 22 ... sáu loại virus khác gây bệnh heo (transmissible virus, gastroenteritis virus, porcine respiratory coronavirus, rotavirus, pseudorabies virus, parvovirus swine influenza virus) Bảy chủng PRRSV phân... chọn phương pháp hiệu để chuẩn đoán virus PRRS cần thiết Trong tiểu luận em tập trung vào tìm hiểu phương pháp chuẩn đốn virus PRRS sử dụng kỹ thuật RT-PCR phương thức chuẩn xác nhanh chóng Tuy... porcine reproductive and respiratory syndrome virus Can J Vet Res., 61, 161–166 10 E KOSINOVA, I PSIKAL, Restriction fragment length polymorphism of ORF6 and ORF7 genes of porcine reproductive and respiratory