PHẢN ỨNG PHẢN ỨNG Kháng nguyên – Kháng thể Kháng nguyên – Kháng thể PGS. TS. PGS. TS. Cao Minh Nga Cao Minh Nga BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP. HCM BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP. HCM KHÁI NIỆM KHÁI NIỆM  ĐN: ĐN: Là những ph Là những ph ươ ươ ng pháp miễn dịch học (MDH) ng pháp miễn dịch học (MDH)  Mục Mục đ đ ích: ích: Xác Xác đ đ ịnh hoặc / và ịnh hoặc / và - chuẩn - chuẩn đ đ ộ một KN ộ một KN - - đ đ ịnh l ịnh l ư ư ợng hiệu giá một KT ợng hiệu giá một KT - - đ đ o l o l ư ư ờng một phức hợp KN-KT ờng một phức hợp KN-KT - - đ đ o l o l ư ư ờng các nhân tố ờng các nhân tố ≠ ≠ tham gia / hệ thống MD. tham gia / hệ thống MD. VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể. VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể. Nguyên lý phản ứng KN-KT Nguyên lý phản ứng KN-KT  Tính Tính đ đ ặc hiệu ặc hiệu αa αb b a c Kháng nguyên A αc [...]... ngưng kết (agglutination reaction) A Kháng nguyên Kháng nguyên IgG IgM B C Phản ứng ngưng kết - A: không xảy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một KN - B: xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các KN - C: rất dễ xảy ra khi KT là loại IgM Tạo mạng Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp (thụ động) * NK hồng cầu thụ động KN hoặc hapten gắn trên giá khoác KT / mẫu Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp (thụ động)... tranh ELISA: Nguyên lý kỹ thuật định lượng KT Phủ KN đã biết trên bề mặt của giếng KT / mẫu gắn vào KN đã biết trên bề mặt giếng KT đã biết có enzyme sẽ gắn với KN còn lại trong giếng Rửa, nhỏ TMB, giếng phản ứng: chuyển sang màu xanh Nhỏ H2SO4, giếng phản ứng: màu vàng λ max = 450 - 610nm E TMB H2SO4 E E E E E E E E E E E E E E MD cạnh tranh ELISA Phản ứng màu tỉ lệ nghịch với nồng độ kháng thể b ELISA... quang: nguyên lý Định týp virus DEN bằng IF với KT đơn dòng (thuốc nhuộm fluorescein ) Virus sởi tạo hợp bào từ các TB Vero bị nhiễm Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi đã biết (thuốc nhuộm rhodamin ) 2 PHẢN ỨNG ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ) * Mục đích: định lượng KN hoặc KT hòa tan / dịch sinh học * Nguyên lý cơ bản: KT/pha rắn + KN/mẫu + KTE + Subtrate KN/pha rắn + KT/mẫu + Kháng. .. * NK hồng cầu thụ động đảo ngược KT / giá khoác KN / mẫu PHẢN ỨNG NGĂN NGƯNG KẾT HỒNG CẦU (Hemagglutination Inhibition - HI) B Các phản ứng MD đánh dấu 1 MD huỳnh quang (immunofluorescence - IF) VD: ∆ RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, … * Đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry): đếm & phân loại TB 2 MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA) VD: ∆ HBV, HCV, HIV, Rubella, … 1 PƯ MD huỳnh quang... phẩm + KN đặc hiệu tương ứng - phát hiện phức hợp KN-KT bằng cộng hợp α-KT gắn enzyme - phản ứng hiện màu với cơ chất: đọc được bằng mắt  các băng màu ở vị trí có KT đặc hiệu với KN tương ứng BIỆN LUẬN KẾT QUẢ WB (-): không có băng nào WB (+): : có ít nhất 2 băng tương ứng với proteine vỏ HIV 1: gp 160, gp 120, gp 41 HIV 2: gp 140, gp 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen... làm nhiều chứng CÁC THỬ NGHIỆM NHANH (test nhanh)  Nguyên lý - Agglutination - Immunodot - Immunofiltration - Immunochromatography Nhỏ mẫu Ghi nhận kết quả (1) : dương tính (2) : âm tính (3) : không ý nghĩa CÁC THỬ NGHIỆM NHANH (test nhanh)  Ưu điểm:  - xét nghiệm với số lượng mẫu nhỏ  - dễ thực hiện, cho kết quả nhanh  - không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, sinh phẩm dễ bảo quản  - có thể thực hiện... bảo quản  - có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở  - xét nghiệm viên có thể được đào tạo nhanh CÁC THỬ NGHIỆM NHANH (test nhanh)  Nhược điểm:  - giá thành cao  - không thuận lợi khi xét nghiệm số mẫu lớn  - không lưu được dữ liệu kỹ thuật  - một số test nhanh có độ nhạy kém hơn so với ELISA XÉT NGHIỆM KHẲNG ĐỊNH WESTERN BLOT Nguyên lý : - điện di proteine virus  phân tách theo PM / gel polyacrylamide... 125, gp 36 ngoài ra có các băng tương ứng với sản phẩm của gen gag/pol WB chưa xác định : có băng ở vị trí khác tiêu chuẩn WB (+) NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ 1 Độ nhạy (ngưỡng phát hiện hàm lượng KN&KT): Mỗi phản ứng có ngưỡng phát hiện ≠ nhau > nên định lượng 2 Hiệu giá ranh giới: ranh giới giữa bình thường & bệnh lý VD: hiệu giá ranh giới của ASLO là 1:200 (200 đơn vị/ml huyết thanh) > (+) khi ≥ 400... tỉ lệ nghịch với nồng độ kháng thể b ELISA theo phương pháp “sandwich” c ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA (IgM antibody capture-ELISA) Đo Mật độ quang (OD) Cơ chất Máy ủ Máy rửa Cộng hợp KN đã biết IgM /maãu Kháng IgM Máy đo quang Giếng đã được gắn một lượng KN nhất định ELISA       Ưu điểm của kỹ thuật ELISA - xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu - dùng máy tự động (±) => ↓ thao tác cá nhân - đọc kết quả . PHẢN ỨNG PHẢN ỨNG Kháng nguyên – Kháng thể Kháng nguyên – Kháng thể PGS. TS. PGS. TS. Cao Minh Nga Cao Minh. bổ thể. VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể. Nguyên lý phản ứng KN-KT Nguyên lý phản ứng KN-KT  Tính Tính đ đ ặc hiệu ặc hiệu αa αb b a c Kháng nguyên