TCNCYH 23 (3) 2003 Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt Lê Thị Kim Tuyến Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng, Hà Nội Các enzym giới hạn cắt ADN kép ở các vị trí đặc hiệu ngoài hoặc trong trình tự nucleotid đợc nhận ra và để lại 3 dạng các đầu tận cùng: phẳng; chéo có ADN đơn 3 thừa, chéo có ADN đơn 5 thừa. Nghiên cứu này dùng một phơng pháp cho phép xác định kiểu cắt của các enzym giới hạn. Phơng pháp giải trình tự Sanger đợc sử dụng để phân tích ADN ở xung quanh vị trí cắt nhng dùng chất không phóng xạ. Song song các đoạn ADN tổng hợp kéo dài đợc cắt bằng enzym giới hạn. Phản ứng Klenow mang hai hoạt tính là tổng hợp ADN 5 3 và exonucleasa 3 5 cho phép xác định kiểu cắt của enzym giới hạn. Kết quả đã cho phép xác định vị trí cắt của hai enzym mới. Điểm cắt Sml I nằm trong trình tự đối xứng đợc nhận: 5- C TPuPy AG - 3. BciV I nhận ra một trình tự không đối xứng và cắt ngoài vị trí nhận : 5 - GTATCC(N) 6 - 3/3- CATAGG(N) 5 - 5. I. Đặt vấn đề Trong y học việc chẩn đoán và nghiên cứu bệnh lý ở mức độ ADN ngày càng quan trọng. Để phân tích đợc các ADN genom cần dùng đến phản ứng cắt ADN giới hạn để tạo thành các mảnh nhỏ có kích thớc nhất định. Phản ứng này đợc xúc tác bắng các enzym giới hạn thuỷ phân ADN ở các vị trí quyết định sau khi đã nhận trình tự đặc hiệu gồm từ 4 đến 8 bp. Tập hợp các enzym giới hạn là hết sức đa dạng và có nguồn gốc phong phú là các vi khuẩn không phân biệt loại chi. Hiện nay, trên thế giới đã thu thập hơn 200 enzym giới hạn có tính đặc hiệu khác nhau. Nếu tính đủ các loại trình tự từ 4 đến 8 nucleotid có tính liên tục hay không, số enzym giới hạn phải hơn 1000 [1]. Với mục đích có đợc enzym để có thể cắt ADN ở bất cứ vị trí mong muốn nào, chúng tôi tiếp tục khảo sát các enzym giới hạn có tính đặc hiệu mới [2]. Đến nay, các enzym giới hạn đợc xác định chủ yếu bằng các trình tự nucleotid đợc nhận ra trên ADN. Nhng các enzym giới hạn nhận ra cùng một trình tự có thể cắt ADN ở các vị trí khác nhau nằm trong vị trí nhận đối với các trình tự đối xứng hoặc ngoài vị trí nhận cách xa và nucleotid đối với các trình tự không đối xứng. Hai enzym mới đợc tìm ở Việt Nam, Sml I nhận ra trình tự đối xứng 5-CTPuPyAG- 3 [3] và BciV I nhận ra trình tự không đối xứng 5-GTATCC-3/3-CATAGG [4] đợc xác định vị trí cắt. Mục tiêu công trình này là xác định tính đặc hiệu các enzym giới hạn bằng phân tích vị trí cắt của nó trên ADN. II. Phơng pháp và vật liệu nghiên cứu 1. Các sinh phẩm ADN đích M13 mp18 và ADN mồi ngợc có vị trí 944-924 gắn biotin. ADN đích pUC19 và ADN mồi ngợc có vị trí 2627-2608 gắn biotin. Sml I và BciV I là hai enzym giới hạn mới đợc tìm ở hai chủng vi khuẩn thiên nhiên phân lập tại Việt Nam từ Stenotrophomonas maltophilia và Bacillus circulans. Sml I nhận trình tự 5-CTPyPuAG-3. BciV I nhận trình tự 5-GGATAC-3 /5-GTATCC-3. 106 TCNCYH 23 (3) 2003 2. Phơng pháp giải trình tự nucleotid Phơng pháp của Sanger [5] đợc sử dụng nhng dùng các hoá chất không phóng xạ. Các đoạn ADN điện di trên gel acrylamid đợc truyền lên màng nylông theo phơng pháp Southern blot [6]. Các đoạn ADN hiện lên bằng phơng pháp miễn dịch học dùng avidine, cộng hợp biotin-phosphatase và cơ chất CDP star tạo sản phẩm phát quang của Phototope-Star Chemiluminescent Detection kit (New England Biolabs). 3. Xác định dạng cắt của các đoạn ADN giới hạn Đoạn dài ADN đợc tổng hợp và cắt với enzym giới hạn phân tích, 30 phút, 37C. Tiếp theo 3 àg ADN cắt đợc sử lý với 2U Klenow, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. III. Kết quả Sml I cắt ADN của phagơ M13mp18 tại bốn vị trí. Một trong các vị trí cắt là 868. Hình 1 chỉ trình tự ADN của M13mp18 xung quanh vị trí đó là: 3-GAGTAGTAATTGGG CTTGAG ATGGTTT-5. Đoạn ADN cắt với Sml I [Hình 1, (-)] kết thúc bằng nucleotid C nằm trong trình tự nhận ra. Sau khi phản ứng với Klenow, đoạn ADN đợc dài ra thêm 4 nucleotid là TTGA. Sự tổng hợp này chứng tỏ rằng đầu tận cùng do Sml I để lại có chuỗi đơn 5 thừa gồm có 4 nucleotid. Kết quả này cho phép xác định vị trí cắt của Sml I là: 5- C TPuPy AG - 3. BciV I nhận trình tự 5-GGATAC-3 /5- GTATCC-3 và cắt pUC19 hai lần. Vị trí cắt đợc phân tích là 2542 (Hình 2). Trình tự đợc xác định trên gel nucleotid là 5- CGACCCTGCCGCTTACC GGATAC CC-3. Các đoạn ADN cắt kết thúc bằng C nằm trớc trình tự nhận ra GGATAC cách 5 nucleotid. Phản ứng Klenow để lại một đoạn ADN nhỏ hơn một nucleotid kết thúc bằng G. Kết quả chỉ rằng phần exonucleasa của Klenow đã phân huỷ chuỗi ADN đơn 3 thừa gồm có một nucleotid. Vị trí cắt của BciV I là: 5- GTATCC(N) 6 -3/3-CATAGG (N) 5 -5. + A T G C - C - T A G C + Hình 1: Vị trí cắt Sml I: 5C T Pu Py A G 3 3G A Py Pu T C 5 -: không có Klenow +: có Klenow Hình 2: Vị trí cắt BciV I: 5GTATCC(N) 6 3 3CATAGG(N) 5 5 -: không có Klenow +: có Klenow 107 TCNCYH 23 (3) 2003 IV. Bàn luận Đến nay, các enzym giới hạn đợc xác định chủ yếu bằng các trình tự nucleotit đặc hiệu nhận ra. Nhng vị trí cắt có thể xẩy ra ở nhiều điểm khác nhau hoặc ngay trong các trình tự có tính chất đối xứng hoặc ở ngoài các trình tự không đối xứng cách vài nucleotit [7]. Các enzym giới hạn nhận cùng một trình tự có khả năng cắt ở các vị trí khác nhau nh trờng hợp của Sma I và Xma I [8]. Tuy nhiên những vị trí cắt này sẽ gần nhau cách xa một vài nucleotit thôi. Do vậy các hình vạch của một ADN chuẩn cắt với các enzym giới hạn nhận ra cùng một trình tự sẽ hiện lên giống nhau khi quan sát trên gel agarose. Phơng pháp dùng trên cho phép xác định dạng ADN tận cùng do enzym giới hạn để lại, trên cơ sở đó có thể kết luận vị trí cắt một cách chính xác. Dựa vào phơng pháp giải trình tự Sanger kết quả thu đợc cho phép quan sát các đoạn ADN khác nhau một nucleotit đối với các phân tử gồm từ 30 đến 200 nucleotit. Do đó các ADN chuẩn M13mp18 và pUC19 đợc tổng hợp từ các ADN mồi nằm từ 50 đến 100 nucleotit trớc vị trí cắt của enzym giới hạn đang xác định. Song song ADN đợc tổng hợp kéo dài và cắt bằng enzym giới hạn cho biết nucleotit cuối cùng của phần kép ở các tận cùng cắt. Ba dạng tận cùng có thể xuất hiện: Phẳng do ADN là hoàn toàn kép; chéo với ADN đơn 3 thừa; chéo với ADN đơn 5 thừa. Phản ứng Klenow cho phép phân biệt giữa 3 khả năng đó vì enzym mang 2 hoạt tính exonucleasa thuỷ phân ADN đơn 35 và endonucleasa tổng hợp ADN đơn 53 [9]. Hai hoạt tính đó kết thúc tạo ra các chuỗi ADN hoàn toàn kép. Nh thế kết luận dựa vào 3 tình huống có thể xảy ra là: ADN đơn 3 thừa, phần exonucleasa của enzym Klenow để lại sản phẩm ADN nhỏ hơn; ADN đơn 5 thừa, phần endonucleasa tổng hợp để lại sản phẩm ADN dài hơn; ADN cắt phẳng có đặc điểm hoàn toàn kép, Klenow không có tác động và ADN vẫn giữ nguyên. Phơng pháp đợc áp dụng trong trờng hợp của hai enzym giới hạn đợc tìm ở Việt Nam. Vị trí cắt của Sml I là 5- C TPuPy AG - 3 nằm ngay trong trình tự đối xứng đợc nhân ra. Vị trí cắt của BciV I là: 5- GTATCC(N) 6 - 3/3- CATAGG(N) 5 - 5 nằm phía ngoài trình tự không đối xứng cách vài nucleotit. Phơng pháp này không dùng phóng xạ hoàn toàn phù hợp với nhiều phóng thí nghiệm không có điều kiện làm thí nghiệm với các chất phóng xạ. V. Kết luận Phơng pháp đợc tả trong công trình này cho phép phân tích các đầu tận cùng của các đoạn ADN giới hạn. Trên cơ sở đó có thể xác định thêm một đặc điểm quan trọng của một enzym giới hạn nhất định là điểm cắt của nó. Hai enzym giới hạn mới tìm ở Việt Nam đã đợc phân tích. Vị trí cắt Sml I là 5- C TPuPy AG - 3. Vị trí cắt BciV I là 5- GTATCC(N) 6 - 3/3- CATAGG(N) 5 - 5 Tài liệu tham khảo 1. Schildkraut I. (1984). Screening and characterizing restriction endonucleases. Genet. Eng., 6: 117-140. 2. Lê Thị Kim Tuyến, Vũ Thị Kim Liên, Vũ Hồng Nga (1996). Phát hiện enzym giới hạn trong vi khuẩn tự nhiên phân lập ở Việt- Nam. Hội nghị khoa học chuyên đè vi sinh học, dịch tễ học, miễn dịch học, tháng 1/1996, Thành phố Hồ Chí Minh: 112-116. 3. Lê Thị Kim Tuyến, Vũ Thị Kim Liên (1997). Sml I, một enzym giới hạn mới tách chiết từ chủng Stenotrophomonas maltophilia. Tạp chí Y học Dự phòng, VII, 4 (34): 11-16. 108 TCNCYH 23 (3) 2003 4. Lª ThÞ Kim TuyÕn, Vò Hång Nga. Ph¸t hiÖn vµ x¸c ®Þnh mét enzym giíi h¹n míi BciV I, t¸ch tõ Bacillus circulans. T¹p chÝ Y häc Dù phßng, 1997, VII, 4 (34): 5-10. 5. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977, 74:5463-67. 6. Southern E.M Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 1975, 98 : 503-517. 7. Szybalski W., Kim S. C., Hasan N. and Podhajska A. J. Class-IIs restriction enzymes-a review. Gene, 1991, 100: 13-26. 8. Endow S.A., Roberts R.J. Two restriction-like enzymes from Xanthomonas malvacearum. J. Mol. Biol., 1977, 112: 521- 529. 9. Klenow H., Henningsen I. Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli B by limited proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci., 1970, 65:168. Summary Nucleotide analysis of restricted fragment DNA extremities for characterizing the restriction enzyme cutting activity The analysis of genomic DNA requires mostly its restriction into small fragments of definite sizes. This reaction is catalyzed by restriction enzymes recognizing specific sequences 4-8 nucleotides long. Each restriction enzyme is characterized by one recognition nucleotide sequence and its cut site on DNA. So far, more than 200 restriction enzymes with different specificities have been found. If considering all the possibilities of palindrome sequences of 4-8 nucleotides, interrupted or not, the number of restriction enzymes should be more than one thousand. With the purpose to get a collection of restriction enzymes that cut DNA anywhere, we still continue to find restriction enzymes having new specificities. This study presents a method able to characterize unknown restriction enzymes by analyzing the cutting extremities of restricted fragments. The method is based on the Sanger sequencing of DNA around the cut site. The non-radioactive chemical biotin has been used instead of 32P. The cut sites of two new enzymes have been determined. For Sml I, the cut site occurs within the recognition nucleotide sequence: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’. Bci VI recognizing a non-palindrome sequence cuts outside this sequence: 5’- GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’. 109 . TCNCYH 23 (3) 2003 Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt Lê Thị Kim Tuyến Viện Vệ. 3. Xác định dạng cắt của các đoạn ADN giới hạn Đoạn dài ADN đợc tổng hợp và cắt với enzym giới hạn phân tích, 30 phút, 37C. Tiếp theo 3 àg ADN cắt