TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất kháng nguyên streptolysin O, sử dụng trong chẩn đoán thấp tim và viêm cầu thận cấp ở trẻ em Nguyễn Thị Tuyến 1 , Nguyễn Văn Dịp 2 1 Bộ môn Vi sinh Y học, trờng Đại học Y Hà Nội 2 Vụ Khoa học và Đào tạo, Bộ Y tế Nghiên cứu đã đa ra đợc các bớc cụ thể hoá về mặt kỹ thuật và tìm ra các điều kiện tối u trong quy trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới. Đồng thời áp dụng sản xuất thành công kháng nguyên streptolysin O dới dạng lỏng với hiệu giá ổn định là 1: 16. Ngoài ra nghiên cứu cũng đã đa ra đợc điều kiện giữ chủng liên cầu nhóm A kinh tế nhất là môi trờng BHI huyết thanh ngựa 50% và nhiệt độ bảo quản là - 70C. I. Đặt vấn đề Hiện nay ở Việt Nam cũng nh trên thế giới, phản ứng ASLO đợc sử dụng trong chẩn đoán ở hầu hết các phòng xét nghiệm ở các bệnh viện tuyến trung ơng và một số bệnh viện tuyến tỉnh. Ngoài ra còn sử dụng trong chơng trình phòng chống bệnh thấp tim. Vì vậy, nhu cầu sử dụng kháng nguyên streptolysin O là rất lớn. Song cho tới nay ở Việt Nam vẫn cha có cơ quan nào nghiên cứu thành công sản xuất kháng nguyên streptolysin O. Do đó các phòng xét nghiệm vẫn phải mua kháng nguyên của nớc ngoài với giá thành cao. Xuất phát từ tình hình thực tế trên, nghiên cứu của chúng tôi tiến hành nhằm mục tiêu sau: + Nghiên cứu các điều kiện giữ chủng chuẩn liên cầu nhóm A: C203S. + Nghiên cứu cụ thể hoá về mặt kỹ thuật của từng bớc trong quy trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) năm 1983 và 1996. II. Đối tợng, Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu: 1. Đối tợng nghiên cứu: - Quy trình giữ chủng liên cầu nhóm A. - Quy trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O 2. Vật liệu Môi trờng nuôi cấy vi khuẩn: - Môi trờng thạch máu, BHI (Brain Heart infusion) của hãng Sanofi diagnostics Pasteur. - Môi trờng Kalbak broth tự sản xuất theo công thức và quy trình của TCYTTG 1983, 1996. Các sinh phẩm và hoá chất chính - Kháng thể kháng streptolysin O của Mỹ. - Hoá chất pha đệm PBS. - Methiolate, hồng cầu thỏ, huyết thanh ngựa Chủng chuẩn quốc tế để sản xuất kháng nguyên streptolysin O C203S do Trung tâm Kiểm định liên cầu Quốc gia Thái Lan cung cấp. 3. Phơng pháp nghiên cứu: 3.1. Phơng pháp giữ chủng mẫu liên cầu nhóm A C203S: - Phơng pháp chúng tôi thử nghiệm trên môi trờng BHI huyết thanh ngựa so sánh với các phơng pháp hiện đang lu giữ nh: + Giữ trên môi trờng thạch máu, giữ trên môi trờng BHI glycerol 20%, giữ dới dạng đông khô. 3.2. Phơng pháp tách chiết kháng nguyên streptolysin O: 94 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Theo thờng quy của TCYTTG 1983, 1996, nhng đã đợc đề tài nghiên cứu cụ thể hoá từng bớc trong quy trình và áp dụng sản xuất. 3.3. Phơng pháp chuẩn độ kháng nguyên streptolysin O: Theo thờng quy của TCYTTG 1996. iii. Kết quả 1. Kết quả nghiên cứu các điều kiện giữ chủng liên cầu nhóm A C203S. Bảng 1. Kết quả nghiên cứu giữ chủng liên cầu nhóm A C203S ở các môi trờng và các điều kiện bảo quản khác nhau Môi trờng bảo quản Nhiệt độ bảo quản Thời gian vi khuẩn sống Thạch máu 4C 48 giờ BHI và glycerol - 20C 1 - 2 tuần BHI và glycerol - 70C 2 tuần - 1 tháng BHI và huyết thanh ngựa - 20C 1 - 2 năm BHI và huyết thanh ngựa - 70C > 4 năm vẫn đang sống Đông khô 4C > 4 năm vẫn đang sống * Nhận xét: - Trong số các môi trờng giữ chủng liên cầu nhóm A C203S, môi trờng BHI và huyết thanh ngựa là môi trờng tốt nhất. - Điều kiện bảo quản các môi trờng này tốt nhất là ở - 70C. - Đã giữ đợc chủng liên cầu nhóm A C203S trong môi trờng BHI và huyết thanh ngựa ở - 70C từ tháng 4 năm 2000 đến tháng 6 năm 2004 vi khuẩn vẫn còn sống và không có sự thay đổi về đặc điểm sinh vật học. - Vi khuẩn giữ theo phơng pháp đông khô trên 4 năm vi khuẩn vẫn sống và không có sự thay đổi về đặc điểm sinh vật học. 2. Kết quả sản xuất kháng nguyên streptolysin O. * Bớc 1: Theo quy trình khuyến cáo của TCYTTG: cấy chuyển chủng mẫu sang môi trờng thạch máu: Bảng 2. Mối liên quan giữa số lần cấy chuyển chủng trên môi trờng thạch máu với hiệu giá kháng nguyên SO Lần cấy chuyển Môi trờng Nhiệt độ Thời gian CO2 Hiệu giá KN (chuẩn độ sơ bộ) Lần 1 TM 37C 18 - 24 giờ không 1: 4 Lần 2 TM 37C 18 - 24 giờ không 1: 16 Lân1 TM 37C 18 - 24 giờ 5% 1: 4 - 1: 8 Lần 2 TM 37C 18 - 24 giờ 5% 1: 16 - 1: 32 * Bớc 2: Theo khuyến cáo của TCYTTG: cấy chuyển chủng từ môi trờng thạch máu sang môi trờng tách chiết kháng nguyên streptolysin O. Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi thu đợc mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên streptolysin O với các hình thức cấy chuyển nh sau: 95 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Bảng 3. Mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên SO với các hình thức cấy chuyển khác nhau: Hình thức cấy chuyển Hiệu giá kháng nguyên SO TM MT ặ trung gian MT ặ cần tách chiết KN SO 1: 16 - 1: 32 TM MT ặ cần tách chiết KN SO 1: 8 * Nhận xét: - Để tách chiết đợc một lợng lớn kháng nguyên SO, chúng ta cần cấy chuyển vi khuẩn từ môi trờng thạch máu qua một lợng nhỏ môi trờng (1/10 tổng môi trờng tách chiết kháng nguyên) để tăng sinh vi khuẩn, sau 6 - 8 giờ mới cấy chuyển vào môi trờng cần tách chiết kháng nguyên, sẽ thu đợc lợng kháng nguyên SO cao. * Bớc 3: Ly tâm lạnh để tách kháng nguyên streptolysin O: - Bớc này ly tâm nhằm mục đích để vi khuẩn lắng xuống đáy ống, còn kháng nguyên streptolysin O nằm trong phần nớc nổi phía trên. Vì vậy vấn đề đặt ra là: ly tâm với số vòng là bao nhiêu? và trong thời gian bao nhiêu? để kháng nguyên streptolysin O không bị lắng xuống đáy ống cùng vi khuẩn? trong quy trình khuyến cáo của TCYTTG không nêu cụ thể, vì vậy chúng tôi đã phải thử nghiệm để tìm ra các điều kiện tối u sau: - Nếu ly tâm cỡ lớn (mỗi ống ly tâm có thể chứa đợc số lợng 100 - 200ml môi trờng), nh vậy một lần ly tâm chúng ta có thể ly tâm đợc khoảng 1 1ít môi trờng, thì số vòng là 2000 vòng/1 phút, trong thời gian là 30 phút. - Nhng nếu ly tâm loại nhỏ (mỗi ống ly tâm chỉ chứa đợc 15 - 20 ml môi trờng, thì số vòng 2000 vòng/ 1 phút, trong vòng 10 - 15 phút. * Bớc 4: Theo đúng nh quy trình khuyến cáo của TCYTTG: - Phần nớc nổi chắt đợc (kháng nguyên streptolysin O) sau ly tâm đợc bổ sung thêm methiolate với tỷ lệ 1% (methiolate1/10000) hoặc sodium azid với nồng độ 0,02%. * Bớc 5: Theo quy trình khuyến cáo của TCYTTG là lọc vô trùng bằng lọc seitz. + Trớc tiên lọc qua giấy lọc có kích thớc 0,45àm, lọc đợc một l ợng dịch khoảng 100ml thì phải thay giấy lọc 1 lần (để dịch lọc chảy nhanh không kéo dài quá trình lọc). + Dịch lọc đợc lọc lại lần 2 qua giấy lọc có kích thớc 0,22 àm. * Bớc 6: Đóng gói và bảo quản loại bỏ kháng nguyên streptolysin S (theo quy trình của TCYTTG bảo quản dịch lọc ở 4C trong vòng 1 tháng để loại bỏ kháng nguyên streptolysin S). Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới: kháng nguyên sau khi sản xuất có thể bảo quản ở 4C sử dụng đợc trong vòng nhiều năm. Qua nghiên cứu thử nghiệm ở một số điều kiện nhiệt độ bảo quản khác nh: 4C, - 20C, ngăn đá tủ lạnh, kết quả theo dõi trong vòng 2 năm nh sau: Bảng 5. Mối liên quan giữa hiệu giá kháng nguyên SO với nhiệt độ bảo quản khác nhau Nhiệt độ bảo quản Hiệu giá KNSO sau sản xuất Hiệu giá KNSO sau 6 tháng Hiệu giá KNSO sau 12 tháng Hiệu giá KNSO sau 18 tháng Hiệu giá KNSO sau 24 tháng 4C 1: 32 1: 32 1: 32 1: 16 1: 16 Ngăn đá 1: 32 1: 32 1: 32 1: 16 1: 16 - 20C 1: 32 1: 32 1: 32 1: 32 1: 32 96 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 * Nhận xét: - Mặc dù theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới: kháng nguyên SO sau khi sản xuất có thể bảo quản ở 4C trong nhiều năm, nhng theo kết quả chúng tôi thử nghiệm, thì nhiệt độ tối u nhất để bảo quản kháng nguyên SO là - 20C (trong vòng 2 năm hiệu giá không thay đổi). - Kết quả bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh và ở 4C (ngăn lạnh của tủ lạnh), trong vòng 1 năm hiệu giá kháng nguyên ổn định không thay đổi, nhng sau 1 năm bị giảm hiệu giá. Nh vậy qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã cụ thể hoá và tìm ra đợc các điều kiện tối u trong từng bớc của quy trình sản xuất kháng nguyên mà TCYTTG đã khuyến cáo năm 1983 và năm1996. 3. Nghiên cứu hiệu quả sản xuất kháng nguyên streptolysin O trên các môi trờng khác nhau. Bảng 6. Hiệu quả sản xuất kháng nguyên streptolysin O trên các môi trờng khác nhau: Môi trờng Hiệu giá KNSO Giá 1 1ít môi trờng (đồng) Todd - Hewith 1: 16 - 1: 32 315.000 BHI 1: 16 - 1: 32 45.000 Kalbak (tự điều chế) 1: 16 - 1: 32 25.000 * Nhận xét: - Kết quả tách chiết kháng nguyên streptolysin O trên 3 loại môi trờng tơng tự nhau. - Giá thành của môi trờng kalbak là rẻ nhất vì điều chế từ nguyên liệu thô sẵn có trong nớc (tim bò), nhng mất thời gian điều chế hơn. iv. Bàn luận 1. Bàn luận về các điều kiện giữ chủng liên cầu nhóm A Mục đích đầu tiên của giữ các chủng vi khuẩn là làm sao cho chúng sống đợc lâu dài, không bị nhiễm bẩn và không thay đổi các đặc tính di truyền. * Cấy chuyển và phơng pháp giữ chủng liên cầu nhóm A C203S trong môi trờng BHI glyxerol 20%: - Cả 2 phơng pháp này không phù hợp trong việc lu giữ chủng liên cầu nhóm A C203S để phục vụ quá trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O vì: - Phơng pháp cấy chuyển có khả năng bội nhiễm cao. - Dễ xuất hiện chọn lọc các biến thể. * Phơng pháp giữ chủng liên cầu nhóm A C203S trong môi trờng BHI huyết thanh ngựa 50%: Trong phơng pháp này chúng tôi đã thay thế glyxerol bằng huyết thanh ngựa là chất chống tinh thể hoá và kết quả thu đợc đã loại trừ đợc những nhợc điểm của các phơng pháp trên và kinh tế hơn (Kết quả bảng 3.1). * Phơng pháp giữ chủng bằng đông khô: Là phơng pháp bảo quản dài hạn và cũng là một trong những phơng pháp bảo quản vi khuẩn hiệu quả hiện nay. Tuy nhiên kỹ thuật đông khô khá phức tạp. Ngoài ra không phải cơ sở nào cũng có máy đông khô để phục vụ quá trình giữ chủng phục vụ sản xuất kháng nguyên. * Bàn luận về nhiệt độ bảo quản chủng: Nhiệt độ bảo quản chủng từ - 12 đến - 20C trong các ngăn đá tủ lạnh hiệu quả thờng thay đổi vì quá trình xả đá tự động làm nhiệt độ của các khoang này không ổn định và điều đó làm tổn hại tới tế bào vi khuẩn. Vì vậy giữ vi khuẩn ở lạnh sâu - 70 C trong quầy lạnh chuyên dụng sẽ tốt hơn ngăn đá tủ lạnh rất nhiều. Quá trình lạnh sâu liên quan đến việc đông băng hỗn dịch vi khuẩn có chứa các chất chống tinh thể hoá nh: glyxerol, 97 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 huyết thanh ngựa để ngăn ngừa tổn hại tế bảo trong quá trình đông lạnh. 2. Bàn luận về kỹ thuật tách chiết kháng nguyên streptolysin O: Quá trình tách chiết kháng nguyên streptolysin O phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhng có hai yếu tố quyết định đó là: sự phát triển tốt của chủng vi khuẩn liên cầu nhóm A mẫu và chống đợc quá trình oxy hoá kháng nguyên streptolysin O trong quá trình tách chiết. 2.1. Cấy chuyển chủng mẫu liên cầu nhóm A C203S để tách chiết kháng nguyên streptolysin O. Khi chủng liên cầu nhóm A C203S đợc lu giữ ở lạnh sâu, vi chất lỏng trong và ngoài tế bào vi khuẩn bắt đầu đông và hình thành dần các tinh thể, các enzym trong tế bào ngừng hoạt động và tế bào chuyển sang dạng tiềm sinh. Quá trình bảo quản chủng dới dạng đông khô cũng tơng tự nh vậy nhng sau quá trình đông băng là làm mất nớc trong huyền dịch vi khuẩn bằng cách cho chúng bay hơi dới áp lực âm. Vì vậy, khi chủng đợc chuyển từ điều kiện bảo quản sang môi trờng dinh dỡng, chúng ta nên cấy chuyển 2 lần để vi khuẩn thích nghi trở lại trạng thái phát triển bình thờng rồi mới chuyển vào môi trờng tối u để tách chiết kháng nguyên Để tách chiết đợc lợng kháng nguyên streptolysin O cao, cần phải có một lợng lớn vi khuẩn ở cùng một thời gian và đang ở giai đoạn phát triển mạnh, nếu không lợng kháng nguyên streptolysin O đợc sản xuất ra từ một lợng nhỏ vi khuẩn sẽ bị oxy hoá ngay mà không còn để chúng ta tách chiết nữa. 2.2. Tách chiết kháng nguyên streptolysin O: Đặc điểm của kháng nguyên streptolysin O là rất dễ bị các thành phần lipid, cholesterol, pH acid vv làm biến đổi tính kháng nguyên. Vì vậy quá trình tách chiết kháng nguyên streptolysin O bắt buộc phải loại vi khuẩn liên cầu nhóm A C203S ra khỏi dung dịch tách chiết. Để thực hiện đợc mục đích này trong quá trình tách chiết kháng nguyên streptolysin O chúng tôi đã sử dụng cùng một lúc 3 phơng pháp để loại vi khuẩn ra khỏi dung dịch tách chiết: - Phơng pháp ly tâm: mục đích của ly tâm là để vi khuẩn lắng xuống đáy ống còn phân tử kháng nguyên streptolysin O nằm trong phần n ớc nổi phía trên. Vì vậy số vòng ly tâm chỉ cần đủ để vi khuẩn lắng xuống đáy ống là đạt yêu cầu (thông thờng chỉ cần 2000 vòng/1 phút), thời gian ly tâm tuỳ thuộc vào ống ly tâm lớn hay bé. - Phơng pháp sử dụng methiolate: Mục đích để diệt các vi khuẩn còn sót lại sau khi ly tâm: phần nớc nổi đợc chắt sau khi ly tâm đợc bổ sung thêm 1% methiolate của (1/10000) và lọc vô trùng. - Phơng pháp lọc vô trùng: là phơng pháp cuối cùng sử dụng để loại vi khuẩn ra khỏi hỗn dịch kháng nguyên streptolysin O. Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng 2 loại giấy lọc: kích thớc 0,45àm và 0,22 àm là phù hợp cho việc tách chiết kháng nguyên streptolysin O. Vì nếu chúng ta sử dụng giấy lọc có kích thớc lớn hơn 0,22àm thì sẽ không loại bỏ hết đợc vi khuẩn liên cầu nhóm A C203S, nhng nếu sử dụng giấy lọc có kích thớc nhỏ hơn 0,22àm thì phân tử kháng nguyên streptolysin O cũng bị giữ lại trên lỗ lọc và nh vậy quá trình tách chiết kháng nguyên không thực hiện đợc. 3. Bàn luận về hiệu giá kháng nguyên streptolysin O tự sản xuất: Theo quy trình và khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới: hiệu giá kháng nguyên chuẩn độ sơ bộ ngay sau khi sản xuất (cha bất hoạt treptolysin S) ít nhất đạt 1: 8 là đạt yêu cầu [4]. Trong sản xuất thử nghiệm của chúng tôi các lô sản xuất đều đạt hiệu giá cao hơn trong khoảng: 1: 16 - 1: 32. Sau khi đã bất hoạt streptolysin S, hiệu giá kháng nguyên streptolysin O hầu hết ở các lô sản xuất đều đạt hiệu giá từ 1: 16 trở lên. Kết quả này đã đợc Trung tâm Kiểm định Vacxin và Chế phẩm sinh học Quốc gia kiểm tra 3 lô liên tiếp và ghi nhận kết quả. V. Kết luận 1. Điều kiện giữ chủng liên cầu nhóm A tốt nhất và kinh tế là trong môi trờng BHI huyết thanh ngựa 50% và nhiệt độ bảo quản là - 70C. 2. Đã nghiên cứu cụ thể hoá từng bớc chi tiết và tìm ra các điều kiện tối u trong quy trình sản xuất kháng nguyên streptolysin O theo khuyến cáo 98 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 của Tổ chức Y tế Thế giới nh: số lần cấy chuyển chủng chuẩn trên môi trờng thạch máu, hình thức cấy chuyển chủng vào môi trờng tách chiét, số vòng ly tâm, kích thớc giấy lọc phù hợp nhất là trên môi trờng Kalbak, nhiệt độ bảo quản kháng nguyên tối u là - 20C, để giúp các cơ sở sản xuất có thể áp dụng quy trình để sản xuất hàng loạt. 3. áp dụng quy trình sau khi đã đợc cụ thể hoá với các điều kiện tối u sản xuất thành công kháng nguyên streptolysin O dới dạng lỏng với hiệu giá ổn định là 1: 16. Tài liệu tham khảo 1. Kaplan EL. (1992). The anti streptolysin O test in clinical medicin. Background and guidelines for the clinical laboratory. Printed by SANOFI Diagnostics Pasteur, Inc chaska, Minesota. Vas, Janury. 1992, p1 - 4. 2. Vandepite J, Engback, et al (1991). Upper respiratory track infection. Basis laboratory procedures in clinical bacteriology. WHO Geneva 1991, p44 - 51. 3. WHO (1983). Menual of microbiological diagnostic methods for streptococcal infection and their sequelae. 1983, p1 - 69. 4. WHO (1996). Laboratory diagnosis of group A streptococcal infection. 1996, p1 - 106. 5. WHO, UNESO, ISFC (1992). Streptococcal sore throat rheumatic fever. Rheumatic heart diseases. 1992, p1 - 16. Summary Apply procedure for producting antigen streptolyssin O using in diagnosis of rheumatic fever and acute glomerulonephritic in children The authours specified steps of procedures of producsion antigen streptolysin O and optimized technical conditions during the prossesss of applying methods proposed by WHO. The antigen streptolysin O was produced in sold fomation stably with the titer 1: 16. The results also pointed out the conditions for storing group A streptococci with low - cost by using media BHI composed 50% hose serum at - 70 C. 99 . 32 (6) - 2004 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất kháng nguyên streptolysin O, sử dụng trong chẩn đoán thấp tim và viêm cầu thận cấp ở trẻ em Nguyễn Thị Tuyến 1 ,. u trong từng bớc của quy trình sản xuất kháng nguyên mà TCYTTG đã khuyến cáo năm 1983 và năm1996. 3. Nghiên cứu hiệu quả sản xuất kháng nguyên streptolysin