TCNCYH 23 (3) 2003 Nghiên cứu sử dụng các phơng pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể Nghiêm Xuân Dũng 1 , Trần Minh Đôn 1 , Lơng Thị Yến 1 và Lê Đức Đào 2 1 Cục Kỹ thuật Hóa Sinh, Tổng cục Khoa học kỹ thuật và Công nghệ - Bộ Công an. 2 Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng trung ơng Kỹ thuật huyết học xác định đợc 4 nhóm máu là A, B, O, AB. Sử dụng kĩ thuật PCR và các loại enzym cắt giới hạn có thể xác định kiểu gen của hệ kháng nguyên này, cho phép xác định đợc 6 trạng thái gen là AA, BB, OO, AB, AO, BO. Phơng pháp mới sử dụng có độ nhạy rất cao, có thể xác định đợc các mẫu ADN từ vết máu, nớc bọt, tóc nên đợc áp dụng có hiệu quả trong công tác giám định hình sự. I. Đặt vấn đề Những nghiên cứu về các dòng cADN mã hoá kháng nguyên nhóm máu ABO [6] đã xác định đợc trình tự đoạn gen ABO với kích thớc 1000bp. Đồng thời qua những nghiên cứu này, ngời ta chứng minh đợc rằng gen mã hoá kháng nguyên A và B có một số gốc bazơ khác nhau ở những vị trí xác định. Điều này dẫn đến những thay đổi một số trình tự axit amin làm cho hoạt tính của A và B-transferase khác nhau. Sự khác nhau đó đã đợc các tác giả tìm ra tại nucleotit 700 của gen B. Tại vị trí này, bazơ G đợc thay thế bằng bazơ A có ở thể dại. Vị trí đột biến này tạo ra điểm nhận biết của enzym giới hạn AluI. Đồng thời, nghiên cứu trên gen O chứng minh sự vắng mặt của bazơ G ở vị trí 258, do đó gen mã hoá tổng hợp protein không có hoạt tính transferase. Đột biến này tạo thêm một vị trí nhận biết nữa đối với gen O bởi enzym giới hạn KpnI. Tiếp theo những nghiên cứu trên, Carll Ladd và cộng sự 1996 [2] đã đa ra một phơng pháp nhằm xác định kiểu gen nhóm máu ABO. Sử dụng đôi mồi thứ nhất (DHF1 và DHR2) bằng kỹ thuật PCR, nhóm tác giả đã nhân đoạn gen ABO tạo ra một sản phẩm có kích thớc 209/210bp. Sản phẩm này sẽ mang vị trí đột biến tại bazơ 258 nếu allen O có mặt. Đôi mồi tiếp theo (DHF3 và DHR3) sẽ nhân đoạn gen ABO tạo ra một sản phẩm có kích thớc 175bp. Sản phẩm này mang vị trí đột biến tại bazơ 700 nếu allen B có mặt. Sau đó, các tác giả sử dụng kỹ thuật cắt sản phẩm PCR bằng hai loại enzym KpnI và AluI. Đối với sản phẩm 210/209pb, nếu allen O có mặt, KpnI sẽ cắt thành các đoạn 177bp và 32bp. Còn sản phẩm 175bp nếu có mặt allen B, AluI sẽ cắt sản phẩm thành các đoạn 94bp và 81bp. Cuối cùng, dựa vào sự thể hiện của các băng ADN trên điện di đồ (gel agarose), ngời ta có thể phân tích tính đa hình của đoạn gen ABO thể hiện ở 6 kiểu gen khác nhau là: AA, BB, OO, AO, BO, AB. Những nghiên cứu trên đã tạo cơ sở để khắc phục một loạt khó khăn gặp phải khi xác định nhóm ABO bằng kỹ thuật huyết thanh học, đồng thời với các kỹ thuật hiện đại, có độ nhạy và tính đặc hiệu cao của sinh học phân tử, việc xác định nhóm máu ABO không chỉ dừng lại ở mức độ xác định kiểu hình với 4 nhóm nh 74 TCNCYH 23 (3) 2003 trớc kia mà thay vào đó có thể xác định đợc 6 kiểu gen khác nhau, do đó tăng khả năng phân biệt hệ thống nhóm ABO. Với những cơ sở lý thuyết và nghiên cứu thực tế đã nêu, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể bằng các kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần bổ sung một phơng pháp mới có độ nhạy rất cao phục vụ việc giám định truy nguyên nhóm dùng cho công tác giám định hình sự. Mục tiêu nghiên cứu: - Nghiên cứu các điều kiện tối u để thực hiện phản ứng nhân bội gen mã hoá kháng nguyên nhóm máu ABO. - Nghiên cứu lựa chọn những phơng pháp thích hợp để tách chiết ADN từ các mẫu sinh học (máu, lông, nớc bọt ) cho phản ứng PCR. - Phân tích tính đa hình của đoạn gen mã hoá tổng hợp kháng nguyên nhóm máu ABO, nghiên cứu xây dựng một quy trình ổn định để xác định dấu vết thu đợc trong điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm. II. Đối tợng và Phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng: - Máu tơi, máu trên giấy thấm Walkman, nớc bọt trên giấy thấm Walkman, nớc bọt thấm vào bông, chân tóc. - Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN; hoá chất dùng cho PCR; hoá chất dùng cho enzym cắt giới hạn KpnI và AluI; hoá chất dùng cho điện di và nhuộm gel của các hãng Sigma và Biorad. 2. Phơng pháp: a. Tách ADN : Đã có rất nhiều phơng pháp đợc nêu ra để tách chiết ADN từ các tài liệu đã đợc công bố trên thế giới và trong nớc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phơng pháp tách chiết ADN của Banaschak S. và cộng sự [1]. b. Kỹ thuật PCR: Quá trình PCR đợc tiến hành trong ống nghiệm eppendorf 0,5 ml. Thành phần phản ứng gồm: 0,2mM dNTPs; 10mM tris HCl, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl 2 ; 2 đơn vị Taq polymeraza; 15 pmol mỗi mồi, nớc cất khử ion; dầu khoáng. Phản ứng đợc thực hiện trên máy PCR tiến hành với 95 0 C: 5 phút; 45 chu kỳ ở các nhiệt độ: 94 o C - 1 phút; 58 o C - 1 phút; 72 o C - 2 phút. c. Sử dụng enzym giới hạn để phân tích đoạn gen mã hoá kháng nguyên ABO: Trên đoạn gen mã hoá tổng hợp kháng nguyên ABO, ngời ta tìm thấy có 2 vị trí có thể sử dụng enzym cắt giới hạn để phân tích điểm đột biến: Vị trí bazơ 258 ở ngời có gen mã hoá kháng nguyên O có thể dùng enzym giới hạn Kpn I để cắt. Sản phẩm cắt sẽ cho ra hai đoạn ADN nhỏ hơn có kích thớc khác nhau. Tơng tự, tại vị trí bazơ 700 của gen mã hoá kháng nguyên B ngời ta sử dụng enzym Alu I cắt. Kết quả cắt cũng cho ra hai đoạn ADN nhỏ hơn có kích thớc khác nhau. Kỹ thuật cắt bằng hai loại enzym giới hạn Kpn I và Alu I đợc chúng tôi tiến hành theo phơng pháp của Carll và cộng sự, 1996 [2]. d. Kỹ thuật điện di: Các sản phẩm PCR đợc kiểm tra, phân tích bằng phơng pháp điện di trên gel agaroza 2,5% trong đệm TBE, nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh trên đèn cực tím. III. Kết quả 1. Sản phẩm PCR khi dùng hai cặp mồi đặc hiệu (DHF1, DHR2 và DHF3, DHR3) 75 TCNCYH 23 (3) 2003 Tổng thể tích phản ứng là 50àl gồm: dNTPs (nồng độ mỗi loại: 0,2mM) : 5àl 10 X PCR buffer (15mM MgCl 2 ) : 5àl Primer (DHF1x DHR2) hoặc (DHF3 x DHR3) mỗi loại 1àl đến 2àl 2 unit Taq ADN polymerase: 2àl ADN khuôn từ 1 đến 6àl H 2 O từ 28 àl- 33àl. Điều kiện để làm phản ứng chuỗi trùng hợp trên máy Mastercycle 5330: 95 o C - 5 phút 58 o C - 1 phút 72 o C - 2 phút 45 chu kỳ 94 o C - 1 phút 58 o C - 1 phút 72 o C - 10 phút Nhiệt độ là 25 o C. Thời gian chạy: 4 giờ 47phút - Primer DHF1 và DHR2 tạo ra một sản phẩm 210 / 209bp. - Primer DHF3 và DHR3 tạo ra một sản phẩm 175bp. Khi phản ứng hoàn thành chúng tôi kiểm tra sản phẩm bằng phơng pháp điện di trên gen agarose 2,5% và soi trên máy UV (ảnh 1). 1 2 3 4 5 6 7 8 ảnh 1. Kết quả PCR đoạn gen ABO với 2 đôi mồi đặc hiệu DHF1, DHR2 và DHF3, DHR3 1,4,6: Sản phẩm PCR dùng cặp mồi DHF3, DHR3 2,5,7: Sản phẩm PCR dùng cặp mồi DHF1, DHR2 3,8 : Marker Khi có sản phẩm PCR, dùng enzym Kpn I và Alu I cắt. Cơ chế hoạt động của Kpn I và Alu I : 76 TCNCYH 23 (3) 2003 5 GCT GAC ACC GTG GAA GGA TGT CCT CGT GGT(G)ACC Primer DHF1 AGG CAG TGG CGA GTC GTG ACT GTG GAC ATT GAG GT Primer DHR2 (A) 5 GTG CGT GGA CGT GGA CAT GGA GTT CCC (G)GC TTC Primer DHF3 C AAG GAC GAG GGC GAT TTC TAC TAC CTG Primer DHR 3 Primer DHF 1 + DHR 2 Primer DHF 3 + DHR 3 209/210 bp 175 bp KpnI Alu I 177 bp 210 bp 94bp 175bp 32 bp 81 bp O B No. 258 b p (K p n I) No. 700b p (Alu I) Allen O: Là kết quả của sự biến mất của Guanin (G) tại vị trí 258. Điều đó làm mất hoạt tính - trasferase và tạo ra điểm nhận biết của KpnI. Allen B: G thay bằng A tại vị trí 700 tạo ra vị trí nhận biết của enzym AluI. - Sản phẩm 210/209 nếu chứa dạng đa hình đặc hiệu của allen O (nếu allen O có mặt) Kpn I sẽ cắt thành các đoạn 177 bp và 32 bp. - Sản phẩm 175 bp nếu chứa dạng đa hình đặc hiệu của allen B (nếu allen B có mặt), Alu I sẽ cắt sản phẩm thành đoạn 94 bp và 81bp. * Tiến hành phản ứng cắt bằng enzym giới hạn: AluI và KpnI (Tổng thể tích 25àl) Enzym Alu I - ADN : 20àl - Buffer A: 2,5àl - Alu I : 1,5àl - H 2 O: 1àl Enzym Kpn I - ADN: 20àl - Tris 10X : 2àl - BSA 10X : 0,3àl - Kpn I : 1 àl - H 2 O: 1,7 àl 77 TCNCYH 23 (3) 2003 Phản ứng enzym đợc thực hiện ở nhiệt độ 37 o C trong thời gian 1 giờ. Sản phẩm đợc điện di trên gel agarose 2.5% với điện thế 100V. Thời gian chạy điện di là 2 giờ 30 phút. Các kết quả đợc kiểm tra bằng máy UV. Các loại genotype của gen ABO sau điện di có thể đợc thể hiện trên điện di đồ theo mô hình sau: Mẫu 1 BO Mẫu 2 BB Mẫu 3 AO Mẫu 4 AA Mẫu 5 AB Mẫu 6 OO bp Enzym cắt Marker KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI KpnI AluI 210 175 94 81 32 Căn cứ vào mô hình trên, chúng tôi tiến hành đọc kết quả trên bản điện di agarose và phân tích kiểu gen của các mẫu nghiên cứu (ảnh 2). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ghi chú: 1: Marker 2,3: AO 4,5: AO 6,7: OO 8,9: BO 10,11: AB ảnh 2: Kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzym KpnI và AluI 78 TCNCYH 23 (3) 2003 2. Kết quả khảo sát gen ABO cuả một số cá thể ngời Việt Nam Kết quả khảo sát một nhóm ngời Việt Nam: - Số ngời có nhóm AA là 2 ngời - Số ngời có nhóm AB là 4 ngời - Số ngời có nhóm OB là 9 ngời - Số ngời có nhóm OA là 7 ngời - Số ngời có nhóm BB là 1 ngời - Số ngời có nhóm OO là 7 ngời. Ngoài ra chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu, nớc bọt, chân tóc của một ngời để nghiên cứu. Kết quả cho thấy ở cùng một cá thể các mẫu phân tích đều giống nhau (ảnh 3). 1, 2, 7, 8, 14, 15, 20, 21 : Máu 3, 4, 9, 10, 16, 17, 22, 23 : Tóc 5, 6, 11, 12, 18, 19, 24, 25 : Nớc bọt ảnh 3: Kết quả khảo sát gen ABO cuả một số cá thể ngời Việt Nam 1-6: Ngời thứ 1 nhóm OO 7-12 : Ngời thứ 2 nhóm OO 14-19: Ngời thứ 3 nhóm OA 20-25 : Ngời thứ 4: nhóm AB 13 : Marker IV. Bàn luận Điện di trên gel agarose 2,5% đối với sản phẩm của chúng tôi cho thấy việc xác định nhóm ABO từ các vết máu, tế bào củ tóc (của 1 sợi tóc) hay vết nớc bọt thí nghiệm đạt kết quả tốt. Các băng mảnh, sắc, không có các vạch phụ, đã xác định đợc genotype của cá thể. Nh vậy, phơng pháp chúng tôi đã sử dụng là ổn định và có độ nhạy cao. Do đó có thể phân biệt đợc các kiểu gen nhóm ABO với lợng mẫu rất ít mà các phơng pháp trớc đây không thể thực hiện đợc [2, 3]. Nếu nh chỉ sử dụng kỹ thuật huyết học, chỉ phân biệt đợc 4 nhóm máu là A, B, O, AB thì bằng kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử ngời ta có thể phân biệt các cá thể ra thành 6 nhóm gen: AA, BB, OO, AO, BO, AB. Sử dụng phơng pháp này còn biết đợc ngay gen của con cái khi biết gen của bố mẹ [5]. Sử dụng các kỹ thuật và trang thiết bị hiện có tại các cơ sở nghiên cứu ở Việt Nam, chúng tôi đang từng bớc hoàn thiện các phơng pháp nghiên cứu các đoạn gen đa hình phục vụ cho công tác của ngành Công an. Kết quả xác định thành công đoạn gen ABO đã giúp chúng tôi khẳng định chắc chắn rằng các phơng pháp sinh học phân tử có thể triển khai và mang lại kết quả thiết thực. 79 TCNCYH 23 (3) 2003 V. kết luận Chúng tôi đã lựa chọn đợc phơng pháp thích hợp để tách chiết ADN từ các mẫu sinh học (máu, lông, nớc bọt ) cho phản ứng PCR. Sử dụng kĩ thuật PCR và enzym giới hạn đã xác định đợc số ngời mang kiểu gen đồng hợp tử (AA, OO hoặc BB) chiếm khoảng 1/3 số lợng ngời khảo sát, còn lại 2/3 là dị hợp tử [4]. Phơng pháp này cho khả năng xác định đợc các dấu vết nhỏ nh vết máu, nớc bọt, 1 sợi tóc nên có ý nghĩa lớn trong công tác giám định pháp y. Tài liệu tham khảo 1. Banaschak S, Rolf B, Brinkmann B: Influence of different staining techniques on the DNA analysis of histological sections. Int. J. Legal. Med. 2000, 113: 114-116. 2. Carll Ladd et. al: A PCR-based strategy for ABO genotype determination, Journal of forensic science. January 1996,Vol. 41, No. 1 :134-137. 3. Cecelia Cronse and Vladimit Vincek: Identification of ABO alleles on forensic type specimen using rapid - ABO genotyping. Biotechniques. 1995,Vol. 18, No. 3. 4. Gobinda Sarkar et. al: Characterisation of PCR amplication of specific alleles, Analytical biochemistry. 1990, 186: 64-68. 5. Fumi - Ichiro Yamato, Herrik Clansen Thayer White, John Marken: Molecular genetic basic of the histo blood group ABO system. Nature. 17 May, 1990,Vol. 345. 6. Yamamoto F., Clausen H, White T., Marken J.: Molecular genetic basic of the histo-blood group ABO system, Nature, 1990, Vol. 345: 229-233. Summary ABO genotype determination using biological molecular methods To overcome the problems, that serology technique allow to determine only ABO phenotype by four groups as A, B, O and AB, we have employed a new method to determine ABO genotyping using modern molecular biological techniques. The method was performed by Carll Ladd et al (1996) and called " PCR-RE" typing . This method is highly sensitive and specific in comparison with the immunological method. Using this method six groups of ABO genotype would be determined as AA, BB, OO, AO, BO, AB. So ABO typing at the DNA level yields genotypic rather than phenotypic information, thereby increasing the systems discrimination potential. The method we used was successful in determination the ABO genotypes on a group of 30 Vietnamese individuals. We also get success in ABO genotype determination on different DNA samples extracted from blood stains, saliva stains and hair root cells. It showed that theres no different of ABO genotypes between these DNA samples from an individual. 80 . TCNCYH 23 (3) 2003 Nghiên cứu sử dụng các phơng pháp sinh học phân tử xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể Nghiêm Xuân Dũng 1 , Trần. chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xác định các kiểu gen hệ nhóm ABO cá thể bằng các kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi