TCNCYH 29 (3) - 2004 9 Nghiên cứu sự nhân lên tối u của dòng virut Rota VNHR 203-030 trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta Lê Thị Luân Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin VNHR 203-30 là chủng virut rota ngời G4P6,8; đợc phân lập từ bệnh phẩm phân có nguồn gốc từ bệnh nhi nam 9 tháng tuổi vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm 2000. Chủng này là ứng cử viên để sản xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em Việt Nam. Liều gây nhiễm trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta là 0,1 FFU/1 tế bào. i. Đặt vấn đề Việt Nam là nớc đang phát triển có dân số gần 80 triệu ngời, với tỷ lệ sinh hàng năm lớn (1,52 triệu trẻ em sơ sinh trong 1 năm) và tỷ lệ tử vong ở trẻ dới 5 tuổi cao (42,5 trẻ/ 1000 trẻ /năm hay 9880 trẻ bị chết /năm) trong số đó có 15,4% là do bị tiêu chảy [5]. Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy trong 5 năm 1998 đến 2003 tại các bệnh viện lớn của nớc ta thì tiêu chảy do căn nguyên virut rota chiếm 45% đến 60% trẻ vào viện do tiêu chảy. Nếu tỷ lệ chết do virut rota cũng theo tỷ lệ đó hoặc một nửa tỷ lệ đó thì tỷ lệ tử vong do nguyên nhân này là 4% đến 8% trong tổng số trẻ em dới 5 tuổi/năm. Nh vậy trong suốt 5 năm đầu tiên cứ 280-560 trẻ có 1 trẻ chết do virut rota/năm [5]. Đối với trẻ vào viện, tối thiểu trẻ phải mất một tuần nằm viện, cha mẹ của trẻ phải nghỉ việc ít nhất một tuần để chăm sóc chúng do vậy chi phí cho đi lại, thuốc men là rất tốn kém. Theo thống kê của Mỹ, hàng năm chi phí cho thuốc men điều trị tiêu chảy do virut rota lên tới 246 triệu đô la. Dân số Mỹ gấp 3 lần dân số nớc ta và coi dịch vụ y tế cao hơn gấp 10 lần thì số chi phí cho trẻ em Việt Nam bị tiêu chảy cũng phải mất 9 triệu đô la Mỹ tơng đơng với 135 tỷ đồng/năm. Do vậy việc nghiên cứu sản xuất văcxin không những dự phòng đợc căn bệnh phổ biến đối với trẻ hiện nay mà còn góp phần quan trọng trong công tác chăm sóc sức khoẻ; đồng thời tiết kiệm chi phí cho các gia đình có trẻ mắc bệnh và cho toàn xã hội. Hiện nay, trên thế giới các nhà khoa học đã nghiên cứu rất nhiều về virut rota, đặc biệt là nghiên cứu sản xuất văcxin phòng bệnh này. ứng cử viên sáng giá nhất trong sản xuất văcxin là chủng virut rota dựa trên các týp gây bệnh cho trẻ em hoặc động vật. Các týp này đợc phân lập từ bệnh phẩm phân của trẻ hay động vật, sau đó đợc dùng để tạo chủng văcxin trên các dòng tế bào theo những qui trình khác nhau. Cho đến đầu năm 2004 một số ứng cử viên văcxin sống giảm độc lực phòng bệnh tiêu chảy do virut rota đang tiến hành nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn cuối trớc khi đợc cấp giấy phép sử dụng nh văcxin từ chủng G1P8 (Rotarix) của hãng Glaxo Smith Lines; G10P12 của Lan Châu Trung Quốc; G3P6 của Australia;.G1,G2,G3,G4P8 (RotateqT) của Merk, Cùng với các nớc trên thế giới, nớc ta thực hiện giám sát bệnh tiêu chảy do virut rota từ năm 1998 và đã xác định đợc 4 chủng chính gây bệnh đó là: G1; G2; G4; và G9 [5]. Chủng G1 và G2 đã đ ợc cấy chuyển và nhân lên trên tế bào [1,3] nhng chỉ có chủng virus rota G4P6,8 là thích nghi trên tế bào thận khỉ tiên phát. Chủng G4P6,8 (VNHR203) phân lập từ trẻ nam 9 tháng tuổi vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm 2000. Chủng này đợc cấy chuyển thích nghi 30 lần trên các dòng tế bào thích hợp, đặc biệt là tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta để tạo chủng cho nghiên cứu sản TCNCYH 29 (3) - 2004 10 xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em nớc ta. Để virut này nhân lên trên tế bào thận khỉ có hiệu giá tối u trong nghiên cứu sản xuất văcxin, điều nhất thiết phải tìm liều gây nhiễm thích hợp. Do vậy mục tiêu duy nhất của nghiên cứu này là xác định liều gây nhiễm để tạo hiệu giá cao nhất khi nhân chúng trên tế bào thận khỉ tiên phát. ii. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu Sử dụng chủng virus rota phân lập và cấy truyền trên tế bào thận khỉ tiên phát từ một mẫu phân của 1 trẻ bị tiêu chảy cấp do virus rota đợc gọi là VNHR-203-030. Chủng virus này đợc chuẩn độ hiệu giá bằng phơng pháp miễn dịch huỳnh quang trên tế bào thận khỉ bào thai rhesus (MA104) [2,3] và hiệu giá tính bằng đơn vị huỳnh quang trong 1ml (FFU/ml). Nuôi tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta bằng môi trờng LHE (Trung tâm Khoa học Sản xuất văcxin Sabin sản xuất) 10% huyết thanh bê (Gibco- Mỹ). Tách tế bào thận khỉ tiên phát một lớp theo tỷ lệ 1:5 và nuôi chúng bằng môi trờng 199 (Trung tâm Khoa học Sản xuất văcxin Sabin sản xuất) 10% huyết thanh bê (Gibco-Mỹ). Khi tế bào kín một lớp, đếm số lợng tế bào và sau đó gây nhiễm tế bào bằng các liều gây nhiễm khác nhau: (A)3,5 tế bào/ 1FFU; (B)4,5 tế bào/ 1FFU; (C) 6,3 tế bào/1FFU; (D) 10 tế bào /1FFU; (E) 30 tế bào/1FFU; (G) 32 tế bào/1FFU; (H) 50 tế bào/1FFU; (I) 70 tế bào/1FFU; (K) 90 tế bào/1FFU và (M) 100 tế bào/1FFU. Hỗn dịch virus thu đợc từ các liều gây nhiễm trên đợc bảo quản ở nhiệt độ -20 0 C hoặc -80 0 C. Chúng đợc đông tan 3 lần, sau đó ly tâm 3000 vòng/1phút/10phút. Lấy nớc nổi và chuẩn độ hiệu giá virus rota từ các mẫu thu đợc bằng phơng pháp miễn dịch huỳnh quang nh sau: Bớc 1: Nuôi tế bào MA104 một lớp trên phiến nhựa 96 giếng, đáy phẳng (sản xuất tại Đan Mạch-loạt số 047016). Rửa tế bào bằng 2 lần môi trờng muối cơ bản Hank và 1 lần bằng môi trờng 199 có chất ổn định pH (heppes), giữ phiến tế bào với môi trờng 199 tại 37 0 C đến khi gây nhiễm virut. Bớc 2: Hoạt hóa virut VNHR-203-030 bằng dung dịch trysin IX (Gibco-Mỹ) tại 37 o C từ 30 đến 60 phút. Pha loãng virus bậc 10 bằng môi trờng 199 hoặc DMEM có heppes và không có huyết thanh bê. Bớc 3: Hút hết môi trờng 199 tại các giếng tế bào, cho 100àl hỗn dịch virus nồng độ từ 10 -1 đến 10 -8 vào phiến, mỗi nồng độ 3 giếng, ủ phiến tại 37 0 C trong 18 giờ. Bớc 4: Cố định tế bào bằng dung dịch formaldehyt 15àl/ giếng ở 4 0 C trong 30 phút, sau đó bỏ hết môi trờng và để khô tự nhiên. Cho 100àl huyết thanh kháng thỏ đa giá (RRV) với tỷ lệ 1/5000 (pha với PBS 1% skimmilk) nh kháng thể thứ nhất, để nhiệt độ phòng thí nghiệm 1 giờ, rửa 3 lần bằng PBS- Tween và cho 100àl kháng thể tinh khiết dê gắn huỳnh quang kháng IgG thỏ (ICN-Mỹ) có xanh Evanblu nh một kháng thể thứ 2, để phòng thí nghiệm 2 giờ, sau đó rửa và để khô tự nhiên. Bớc 5: Đọc kết quả trên kính hiển vi huỳnh quang vật kính 10. Tế bào bình thờng là tế bào MA104 bắt màu da cam đậm. Tế bào nhiễm virus là tế bào bắt màu xanh phát quang. Hiệu giá virus là nồng độ pha loãng nhất mà tại đó đếm đợc các điểm huỳnh quang màu xanh của tế bào nhiễm virut trên một giếng. Hiệu giá virut (FFU/ml)= n x1/ log 10 -x x 10. Trong đó: n là số lợng điểm huỳnh quang. 10 -x là nồng độ pha loãng nhất có thể đếm đợc điểm huỳnh quang. 10 là hệ số tính hiệu giá trong 1ml. TCNCYH 29 (3) - 2004 11 iii. Kết quả Kết quả nghiên cứu đợc trình bầy trong các bảng sau: Bảng 1. Hiệu giá chủng VNHR-203-030 Hiệu giá Chủng Log10 n FFU/ml VNHR-203-030 7,0 Bảng 1 cho kết quả hiệu giá chủng VNHR203-030 là 10 7,0 FFU/ml Bảng 2. Hiệu giá của virus rota trên các liều gây nhiễm khác nhau Hiệu giá Liều gây nhiễm Số lợng tế bào gây nhiễm/1FFU Log10 n FFU/ml FFU/ml A 3,5 tế bào 6.84 6918309 B 4,5 tế bào 6.65 4466835 C 6,3 tế bào 6.95 8912509 D 10 tế bào 7.08 12022644 E 30 tế bào 6.76 5754399 G 32 tế bào 6.70 5011872 H 50 tế bào 6.72 5248074 I 70 tế bào 6.05 1122018 K 90 tế bào 6.48 3019951 M 100 tế bào 5.50 316227 Bảng 2 cho thấy hiệu giá cao tại 2 liều gây nhiễm 6,3 tế bào/1FFU và 10 tế bào/1FFU tuy nhiên hiệu giá cao hơn ở liều gây nhiễm là 10 tế bào/FFU (cao hơn 1,35 lần so với liều gây nhiễm 6,3 tế bào/1FFU). Hiệu giá thấp dần khi số lợng tế bào tăng và hiệu giá thấp nhất là 100 tế bào/FFU. iv. Bàn luận Tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta là tế bào đợc tách từ tổ chức thận khỉ Macaca Mulatta (khỉ nuôi tại đảo Rều Quảng Ninh) và có thể cấy chuyển 3 lần liên tiếp. Mỗi đôi thận khỉ có thể tách đợc khoảng 100-120 chai roux tế bào. Tế bào này đợc nuôi và phát triển kín 1 lớp bằng môi trờng LHE 10% huyết thanh bê trong 7 ngày. Khỉ lấy thận đợc kiểm tra nghiêm ngặt về các tác nhân ngoại lai theo phơng pháp và tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới. Khỉ và tế bào thận khỉ đợc chấp nhận để nghiên cứu và sản xuất văcxin khi đã qua tất cả thử nghiệm theo yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới. Tế bào (MA104) có nguồn gốc từ tế bào thận bào thai khỉ rherus, đợc chọn lọc tạo thành dòng tế bào thờng trực, dòng tế bào có thể cấy chuyển nhiều lần mà không ảnh hởng đến đặc tính của tế bào, đợc bảo quản ở -196 0 C và đợc cung cấp bởi Trung tâm Phòng chống và Kiểm soát bệnh tật CDC-Atlantta-Mỹ, là nguồn tế bào nhạy cảm cho sự nhân lên của virus rota và dùng để sử dụng cho phân lập và kiểm tra hiệu giá virut rota. Virut rota nhóm A là virut chính gây bệnh cho trẻ em dới 5 tuổi [4,5]. Virut này rất khó nhân lên và thích nghi trên tế bào một lớp cho đến khi sử dụng enzym trypsin hoạt hóa virut [6]. Liều gây nhiễm virut cực kỳ quan trọng trong sự nhân lên của virut, không phải nồng độ gây nhiễm cao là tạo ra sản phẩm có hiệu giá cao, cụ thể nh nồng độ gây nhiễm từ 3,5 tế bào/ FFU đến 4,5 tế bào/FFU cho sản phẩm có hiệu giá thấp hơn tại nồng độ 6,3 tế bào/FFU và 10 tế bào/FFU. Do vậy việc chọn ra liều gây nhiễm thích hợp là vô cùng quan trọng. Liều gây nhiễm thích hợp lợng virus rota tính theo đơn vị FFU sử dụng cho 01 tế bào mà tại đó tạo ra sản phẩm có hiệu giá cao nhất. Nh vậy liều gây nhiễm thích hợp cho chủng VNHR203-030 là 0,1FFU virus rota/ 1 tế bào. Liều gây nhiễm này cao hơn so với liều gây nhiễm của chủng virut bại liệt trong sản xuất văcxin bại liệt sống uống (0,0033PFU virus bại liệt/1 tế bào thận khỉ tiên phát) và cũng cao hơn liều gây nhiễm chủng virut viêm gan A trong sản xuất văcxin viêm gan A (0,05PFU virus viêm gan A/1 tế bào thận khỉ tiên phát). TCNCYH 29 (3) - 2004 12 V. Kết luận Chủng virut rota VNHR203-030 nhân lên tốt nhất trên tế bào thận khỉ tiên phát khi liều gây nhiễm là 0,1 đơn vị miễn dịch huỳnh quang trên một tế bào (0,1FFU/ 1 tế bào). Lời cảm ơn Nghiên cứu này là công trình nghiên cứu lần đầu tiên tại nớc ta về virut rota, nghiên cứu đợc thực hiện tại phòng thí nghiệm chuẩn tại Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin, số 135 phố Lò Đúc-Hà Nội. Nghiên cứu này là một trong những nội dung giám sát bệnh tiêu chảy do virut rota tại Việt Nam năm 2003 đề tài hợp tác với Trung tâm Phòng chống và Kiểm soát Bệnh tật (CDC) Atlantta-Mỹ và dới sự tài trợ của Tổ chức Y tế thế giới và của Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Gs. Nguyễn Văn Mẫn chủ nhiệm đề tài hợp tác, đã tạo mọi điều kiện cho tôi chủ động thực hiện nghiên cứu. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới: Ts. Nguyễn Thị Quỳ; Ts. Nguyễn Đăng Hiền; Cn. Lê Trung Dũng; Cn Trần Bích Hạnh và Cn. Nguyễn ánh Tuyết Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin đã giúp tôi thực hiện nghiên cứu này. Tài liệu tham khảo 1. Lê Thị Luân. Quá trình chọn lọc chủng virut rota týp G2 trên nuôi cấy tế bào. Tạp chí Y học thực hành; Số 9 (460); Trang 13-15; 2003 2. Lê Thị Luân. Nuôi cấy virut rota gây bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em dới 5 tuổi trên tế bào thận khỉ Rherus châu Phi; Tạp chí Y học thực hành, Số 10 (463), trang 52-53; 2003 3. Lê Thị Luân. Chọn lọc chủng virut rota G1 trên tế bào thận khỉ Macaca Mulatta. Tạp chí Y học Thực hành số 9 (460); trang 54- 56;2003 4. Nigel A.C., Jailosi S.G., Robin L.B., et al. Rotavirus G and P types in children with acute diarrhea in Blantyre, Malawi, from 1997 to 1998: Predominance of Novel P6G8 strains. Journal of Medical Virology 57: 308- 312; 1999. 5. Nguyen Van Man and et al. The Epidermiology and Disease Burden of rotavirus in Vietnam: Sentinel Surveillance at 6 hospitals. The journal of infectious Disease in America; volume 183: 1707-1712; 2001 6. Esparza J., Gorziglia M., Gil F., and Romer H Multiplication of Human Rotavirus in cultured cells: an Electron Microscopic Study. J.Gen.Virol.,47, 461-472; 1980. Sumary The study of priority multiplication rotavirus VNHR 203-030 on Macaca Multta primary monkey kidney cells VNHR 203-030 is human rotavirus strain G4P6,8. It was isolated from stool sample of male patient- 9 month of age. He addmited Saint Pont hospital cause by acute diarrhea. This strain was passaged 30 times in the cell culture. It is candidate for producing rotavaccine. It's M.O.I is 0.1 FFU virus rota/ 1 Primary monkey kidney cells. . TCNCYH 29 (3) - 2004 9 Nghiên cứu sự nhân lên tối u của dòng virut Rota VNHR 20 3- 030 trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta Lê Thị. virus viêm gan A/1 tế bào thận khỉ tiên phát) . TCNCYH 29 (3) - 2004 12 V. Kết luận Chủng virut rota VNHR2 0 3-0 30 nhân lên tốt nhất trên tế bào thận