Thông tin khoa học Số 26 2 ðại học An Giang 4/2006 NHỮNG CÔNG NGHỆ MỚI TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Nguyễn Thị Th Diễm * n ước ta, cơng nghệ sinh học thực vật đặc biệt là lĩnh vực ni cấy mơ tế bào thực vật đã ở mức sẵn sàng hồ nhập và đủ sức tham gia cạnh tranh với thế giới và khu vực. Ngồi số lượng ngày càng tăng các cơng ty thuộc lĩnh vực cơng nghệ sinh học ở nước ngồi đến đầu tư với nước ta, các cơng ty giống tư nhân trong nước cũng đã khởi sắc. ðây là dấu hiệu đáng mừng. Vì hầu hết việc thương mại hố cơng nghệ sinh học trên thế giới nằm ở khu vực kinh tế tư nhân với các doanh nghiệp vừa và nhỏ, bài viết này nhằm cung cấp cho người đọc các thơng tin cơ bản và một cơng nghệ mới trong nhân giống cây trồng. 1. GIỚI THIỆU Haberlandt là người đầu tiên nghiên cứu và đưa ra khái niệm về ni cấy mơ tế bào năm 1902. Từ đó cho đến nay kỹ thuật này phát triển nhanh chóng và đã góp phần vào sự thành cơng của cơng nghệ sinh học thực vật. Ngày nay, ni cấy mơ tế bào thực vật có ý nghĩa rất quan trọng trong phát triển cơng nghệ sinh học và các ứng dụng thương mại của cơng nghệ sinh học. Thật vậy, khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen để tạo ra các giống mới hoặc khi tìm cách nhân nhanh các giống mới đó chúng ta đều cần đến kỹ thuật này. Bên cạnh những đóng góp cho nơng nghiệp ni cấy mơ còn đóng góp cho các lĩnh vực khác như chọn tạo nhân giống cây lâm nghiệp hay nghiên cứu để tạo các chất biến dưỡng thứ cấp phục vụ cho ngành dược, ngun liệu cho mỹ phẩm,… Nhìn chung, cuộc cách mạng cơng nghệ sinh học đã ảnh hưởng rất sâu sắc vào sự phát triển nơng nghiệp. Các thành tựu về cơng nghệ gen, qui trình vi nhân giống truyền thống vốn đòi hỏi tỷ mỷ và nhiều nhân lực được chuyển thành một ngành cơng nghiệp xanh, trong đó giống cây trồng chất lượng cao được sản xuất hàng loạt trong các điều kiện có khống chế (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giờ chiếu sáng, chất dinh dưỡng, CO 2 ) và phần nào được tự động hố. 2. NHỮNG CƠNG NGHỆ MỚI TRONG NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG 2.1. Nhân giống từ phơi vơ tính (Somatic embryo) Steward và Reinert (1958) là hai tác giả đầu tiên mơ tả sự hình thành phơi vơ tính từ các tế bào đơn của cà rốt. Mãi đến năm 1997, Murashige mới đưa ra ý kiến phơi vơ tính có thể được tạo ra nhiều thơng qua biện pháp vi nhân giống. ðến nay, cơng nghệ phơi vơ tính được xem là cơng nghệ rất có triển vọng cho nền nơng nghiệp hiện nay. Vậy phơi vơ tính là gì? – Là các thể nhân giống (propagules) có cực tính, được hình thành từ các tế bào dinh dưỡng, còn gọi là tế bào soma (somatic cells). Chúng rất giống phơi hữu tính (zygotic embryo) ở hình thái, q trình phát triển và sinh lý nhưng do khơng phải là sản phẩm của q trình dung hợp giữa 2 tế bào sinh dục đực và cái nên phơi vơ tính khơng có q trình tái tổ hợp di truyền (genetic recombination), các phơi này có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma. Khả năng tạo phơi vơ tính trong ni cấy mơ thực vật phụ thuộc vào các điều kiện vật lý, hố học. Ngồi ra sự tạo phơi còn phụ thuộc rất lớn vào lồi, giống, vào chủng trong cùng lồi. Khả năng này được chứng minh là do một hoặc vài gen phụ trách. Do đó, bằng phương pháp lai tạo có thể chuyển khả năng tạo phơi vơ tính từ cây này sang cây khác. 2.2. Ứng dụng của phơi vơ tính trong sự tạo hạt nhân tạo (Synthetic seed) Kỹ thuật hạt nhân tạo đã được nghiên cứu và ứng dụng thành cơng ở nhiều nước. ðây là phương pháp tạo một dạng hạt mơ phỏng hạt tự nhiên, có một phơi sinh dưỡng hoặc chồi ngủ được bọc lại bằng một chất gel (chất có tác dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngồi cho mầm hạt). Trong cấu trúc lưới của các hạt đó, nước và chất dinh dưỡng, chất sinh trưởng được cung cấp thay cho nơi nhũ giúp cho phơi vơ tính có thể nảy mầm thành cây hồn chỉnh. Ưu điểm của phương pháp này là nhân được số lượng lớn cây giống, duy trì đặc tính chất lượng hạt giống giống nhau về mặt di truyền (do phơi khơng có sự phân ly tính trạng hoặc tái tổ hợp như phơi hữu tính), tốc độ nhân giống nhanh cũng như khơng cần các u cầu về điều kiện vật lý giữa ni cấy mơ và chuyển cây ra ngồi vườn, giữ phơi được lâu và đảm bảo cung cấp giống kịp thời theo u cầu. Hạt nhân tạo gồm có 3 phần: - Phơi vơ tính. Ở * Giảng viên BM Cơng nghệ Sinh học, Khoa Nơng nghiệp- TNTN. Email: nttdiem@agu.edu.vn Thoâng tin khoa hoïc Số 26 3 ðại học An Giang 4/2006 - Vỏ bọc polime (alginat, agar, agarose,…) - Màng ngoài (alginat canxi) Có nhiều loại polyme tự nhiên ñã ñược thử nghiệm dùng cho công nghệ phôi vô tính, trong ñó alginat ñược coi là tốt nhất. Alginat là một polime sinh học ñược chiết từ rong biển, chủ yếu từ rong mơ (Sargassum sp.). Alginat do các phân tử axit manuronic gắn với nhau, giống như các phân tử glucose tạo nên cellulose. ðặc ñiểm quan trọng nhất của alginat là chúng ở dạng hòa tan trong nước khi kết hợp với các ion 1 hóa trị (Na + , K + , NH 4 + ) và lập tức chuyển sang không tan trong nước khi kết hợp với các ion 2 hóa trị hoặc ña hóa trị (Ca 2+ , Mg 2+ , Al 3+ ). Nếu nhỏ 1 giọt dung dịch alginat Na vào một dung dịch CaCl 2 thì alginat Na ở phần diện tích ngoài của giọt sẽ chuyển hóa ngay thành alginat Canxi và tạo nên một màng không thấm nước. Các viên alginat ñược hình thành. 2.3. Nuôi cấy mô thực vật theo phương pháp thuỷ canh (hydroponics) Thủy canh là một trong những phương pháp canh tác tiên tiến nhất trong nền sản xuất hiện ñại, cây ñược trồng trong nước và dung dịch dinh dưỡng. Với phương pháp này, cây trồng có thể tăng trưởng và phát triển mạnh do ñược cung cấp khoáng chất trực tiếp thông qua hệ thống rễ luôn tiếp xúc với môi trường. Công nghệ thủy canh hiện ñược dùng rộng rãi ở nhiều nước ñể trồng rau, hoa không cần ñất. Một phần rễ ñược ñể ngập trong dung dịch dinh dưỡng khoáng có thành phần thích hợp. Phần rễ bên trên có thể ñảm nhận vai trò hô hấp và trao ñổi khí. Các bộ phận phía trên không khí (thân lá) ñược bảo vệ cách ly với môi trường bên ngoài với các tấm mỏng bằng chất dẻo hoặc lưới. (a) (b) Hình 1 (a). Hệ thống thủy canh ñiển hình (b). Sơ ñồ hệ thống NFT với thiết bị bơm, lọc và ñiều chỉnh pH Trong công nghệ thủy canh, vấn ñề khó khăn nhất là tạo một dung dịch dinh dưỡng ổn ñịnh về nồng ñộ các chất dinh dưỡng và pH. Muốn vậy phải thực hiện theo hai cách: hoặc thay ñổi môi trường liên tục hoặc thêm các thành phần có khả năng ñệm cao ñể ổn ñịnh pH. Hướng thứ nhất ñược thực hiện nhiều ở Singapore và Hà Lan, bằng cách ñể bộ rễ tiếp xúc với một lớp mỏng dịch dinh dưỡng. Lớp mỏng này luôn luôn ñuợc tạo thành dòng chảy bằng hệ thống bơm, lọc và ñiều chỉnh pH tự ñộng (hình (b)). Vì vậy còn có tên gọi là công nghệ màng dinh dưỡng (Nutrient Film Technology – NFT). Các nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy công nghệ thủy canh có thể phát huy khả năng quang tự dưỡng của cây con, mặt khác giảm giá thành cây con. 2.4. Nuôi cấy mô thực vật theo phương pháp khí canh Phương pháp khí canh (aeroponics) ñược xây dựng chủ yếu ở Singapore và trong tương lai sẽ thay thế hoàn toàn phương pháp thủy canh. “Khí canh” (Aeroponics) – ñây chính là hệ thống thủy canh cải tiến, vì rễ cây không trực tiếp nhúng vào dung dịch dinh dưỡng mà phải qua hệ thống bơm phun ñịnh kỳ. Hình 2: Sơ ñồ phương pháp khí canh ñược áp dụng trên thế giới. Trong phương pháp khí canh, bộ rễ cây hoàn toàn nằm trong không khí, chất dinh dưỡng và nước ñược phun mịn theo chu kỳ lên toàn bộ hệ rễ. Dung dịch thừa ñược thu lại, lọc, bổ sung ñể tiếp tục sử dụng. Do không cần thường xuyên tiếp xúc một lớp nước dày nên trọng lượng của toàn bộ hệ khí canh tương ñối nhẹ, dễ bố trí trên nóc các sân thượng ở các thành phố. Singapore dự kiến ñến năm 2000 sẽ phủ xanh các nhà cao tầng bằng hệ thống khí canh. Với hệ thống này có thể tiết kiệm ñược dung dịch, bộ rễ thực hiện hô hấp tối ña, do ñó có thể áp dụng cho sản xuất lớn và trồng trái vụ. Ở nhiều nước, công nghệ thủy canh ñược dùng rộng rãi ñể trồng rau màu và một số loài hoa mà không cần ñất. ðây là một bước tiến bộ quan trọng trong nông nghiệp, mở ra một hướng mới trong Lưới hoặc màng mỏng bằng plastic Giá ñỡ cây bằng miếng xốp, dày 2-3 cm, cóñục lỗ Hộp bằng mốp xốp, dày 3-5 cm Dung dịch dinh dưỡng Dung dich dinh dưỡng Hệ thống hoàn lưu Vòi phun sương Máy bơm dung dịch dinh dưỡng Thoâng tin khoa hoïc Số 26 4 ðại học An Giang 4/2006 công tác trồng trọt, ñáp ứng một phần tình hình cấp bách hiện nay về vấn ñề rau sạch và an toàn vệ sinh rau quả. Hệ thống khí canh có thể ứng dụng ñể giảm giá thành cây giống trong công nghệ sinh học thực vật, với một số cải tiến thích hợp ñể ñiều chỉnh nồng ñộ CO 2 và ñiều hòa nhiệt ñộ vùng rễ, lá. 2.5. Công nghệ quang tự dưỡng Công nghệ quang tự dưỡng (photo autotrophic technology) trong nuôi cấy mô thực vật, ñặc biệt trong vi nhân giống, gần ñây ñược nghiên cứu nhiều ñể hạ giá thành và tự ñộng hóa quá trình nuôi cấy. Trên cơ sở nghiên cứu tỷ mỷ các yếu tố cấu thành hệ vi sinh thái của cây trong ống nghiệm, các tác giả Nhật (Kozai và cộng tác viên) cho rằng nếu tạo ñiều kiện cho cây trong ống nghiệm quang hợp bình thường thì không nhất thiết phải cho ñường vào môi trường nuôi cấy. Các tác giả Nhật ñã sử dụng các biện pháp sau ñể duy trì nồng ñộ CO 2 trong ống nghiệm luôn luôn cao bằng hoặc hơn nồng ñộ CO 2 trong không khí bên ngoài, ñảm bảo ñủ CO 2 cho quá trình quang hợp : 1. Thay ñổi lại hình dáng bình nuôi cây, cấu tạo lại nắp bình sao cho sự trao ñổi không khí trong bình và ngoài bình tăng lên. Trên mặt nắp bình có lỗ rộng ñể không khí ra vào dễ hơn thay vì nút cao su hay bông nén. Lỗ này ñược ngăn bụi và vi khuẩn bằng cách dán vào ñó một loại màng xốp thích hợp. 2. ðặt bình nuôi cây trong một không gian kín có nồng ñộ CO 2 cao hơn không khí trong phòng. 3. Thay ñổi ñộ dài thời gian chiếu sáng liên tục, nhưng vẫn ñảm bảo tổng số giờ chiếu sáng bằng cách xen kẽ các thời gian tối, trong ñó CO 2 ñược tích lũy. 4. Tăng khả năng sử dụng CO 2 bằng cách tăng cường ñộ ánh sáng. Với các biện pháp này các tác giả Nhật ñã hoàn toàn thành công trong việc sử dụng công nghệ quang tự dưỡng ñể nhân giống nhiều loại cây (khoai tây, dâu tây, cẩm chướng, bạch ñàn ) trên môi trường không ñường. Cây sản xuất theo công nghệ quang tự dưỡng lớn nhanh hơn cây nuôi cấy trên môi trường có ñường và có tỷ lệ sống cao hơn khi chuyển sang giai ñoạn bầu ñất. Ý nghĩa thực tiễn của công nghệ quang tự dưỡng không chỉ nằm ở chỗ giảm chi phí ñường pha môi trường mà chủ yếu ở chỗ tỷ lệ hư hỏng cây do nhiễm nấm và vi khuẩn giảm xuống một cách rõ rệt. 2.6. Công nghệ vi nhân giống theo phướng hướng tự ñộng hoá Cấy truyền và chuyên chở cây con từ in vitro vào nơi thuần dưỡng chủ yếu là lao ñộng chân tay. Ở các nước công nghiệp do giá nhân công ñắt, một khó khăn khi triển khai vi nhân giống trên quy mô công nghiệp là công lao ñộng chiếm tỷ lệ rất cao trong giá thành (trên 50%). Vì vậy ở nhiều nước, ñặc biệt ở Israel và Nhật, ñã tiến hành nghiên cứu và ứng dụng thành công tự ñộng hóa trong vi nhân giống ở qui mô công nghiệp. Việc nghiên cứu tự ñộng hóa ñược tiến hành với từng công ñoạn của công nghệ vi nhân giống và mức ñộ thành công phụ thuộc vào tính phức tạp của từng công ñoạn: - Giai ñoạn chuẩn bị môi trường nuôi cấy - Giai ñoạn cắt, tách mô và cấy truyền trên môi trường mới - Giai ñoạn nuôi cấy trong ñiều kiện nhiệt ñộ, ánh sáng, CO 2 ñược ñiều khiển tự ñộng - Giai ñoạn chuẩn bị ñưa ra vườn ươm (còn gọi là công ñoạn hardening). - Giai ñoạn vườn ươm - Công ñoạn bao bì và giao cây cho người mua 2.7. Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor) Trước ñây các nồi phản ứng hay nồi lên men (fermentor) chủ yếu ñược dùng cho công nghệ vi sinh. Mục ñích của việc sử dụng các nồi phản ứng sinh học là gia tăng sự trao ñổi khí trong môi trường nuôi cấy ñể gia tăng sinh khối. Trên cơ sở các thiết bị ñó, với một số cải tiến, nhiều tác giả ñã nhân giống thành công nhiều loại phôi vô tính và các thể chồi, cụm chồi hoặc củ nhỏ. Phôi vô tính cà phê ñược sản xuất thành công ở Brazil trên các nồi phản ứng dung tích 2 - 4 lít. Nồi vận hành theo các nguyên tắc của một nồi lên men, chú ý không dùng cánh khuấy mà chỉ dùng bọt khí ñể thực hiện việc truyền khối và truyền nhiệt. Mỗi mẻ có thể thu ñược 4 - 5 triệu phôi vô tính cà phê. Ở Indonesia, cụm chồi dứa ñược ñưa vào sản xuất thành công với nồi lên men 10 lít. ðiểm ñáng chú ý trong công nghệ này là thay vì thổi khí vào nồi phản ứng, dịch lỏng nuôi cây ñược bơm vào nồi và hút ra theo chu kỳ ngắn, nhờ vậy mô và tế bào thực vật có ñủ oxy và chất dinh dưỡng ñể phát triển mạnh.  . NHỮNG CÔNG NGHỆ MỚI TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Nguyễn Thị Th Diễm * n ước ta, cơng nghệ sinh học thực vật đặc biệt là lĩnh vực ni cấy. thành cơng của cơng nghệ sinh học thực vật. Ngày nay, ni cấy mơ tế bào thực vật có ý nghĩa rất quan trọng trong phát triển cơng nghệ sinh học và các