BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC KHÓA: 28 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana ACCOSIATED WITH INSECT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY PROFESSOR STUDEN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28 HCMC 9/2006 iii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. TĨM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên cơn trùng gây hại ” đƣợc thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005 tại trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Nhƣ Ngọc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu Oanh Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của cơn trùng dẫn đến cơn trùng bị chết khơ Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt cơn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp . Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian trên một số cơn trùng gây hại . 2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana 3. Sau khi thực hiện phản ứng PCR ta sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng IST1-5.8S-IST2 của nấm Beauveria bassiana và vùng Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae 4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên mơi PGA: Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA(Potato-Glucose- Agar),kết quả chúng tôi đã thu đƣợc một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy : RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6 ,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 . 2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trƣờng lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa lại với nƣớc cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi đƣợc nấm ở dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -80 0 C cho đến khi sử dụng . 3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích đƣợc DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ đƣợc DNA của 12 mẫu nấm. 4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria 5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6 dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chƣa nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tƣơng đồng giữa các dòng nấm khá cao .Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc các band trên gel so với Ladder là hoàn toàn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria . MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mụclục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách các bảng x Danh sách các hình xi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1.Đặt vấn đề 1 1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài 1 1.2.1.Mục đích 1 1.2.2.Mục tiêu 2 1.3.Yêu cầu nghiên cứu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học 3 2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh 4 2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae 5 2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille 6 2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm 8 2.4.Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm 9 2.5.Hoạt tính sinh học 11 2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 11 2.6.1.Nghiên cứu trong nƣớc 11 2.6.2.Nghiên cứu ngoài nƣớc 12 2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 14 2.8.Phản ứng PCR 14 2.8.1.Giới thiệu chung về PCR 14 2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả PCR 15 2.8.3.Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR 16 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR 16 2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động 17 2.10.Phân tích RFLP 17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1.Thời gian và địa điểm 19 3.1.1.Thời gian 19 3.1.2.Địa điểm 19 3.2. Vật liệu và hóa chất 19 3.2.1.Vật liệu 19 3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm 19 3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm 19 3.2.2.Hóa chất và môi trƣờng 19 3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm 19 3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 20 3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 20 3.2.2.4.Môi trƣờng 20 3.2.3.Các thiết bị chính 21 3.3.Nôi dung nghiên cứu 21 3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.4.1.Phục hồi các chủng nấm 21 3.4.2.Chủân bị môi trƣờng lỏng 22 3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA 22 3.4.4.Phƣơng pháp tinh sạch DNA 23 3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR 24 3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae 24 3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille 25 3.4.6.Điện di và đọc kết quả 26 3.4.6.1.Điện di trên gel agarose 26 3.4.6.2.Đọc kết quả điện di 26 3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27 3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR 27 3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27 3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự 28 3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả 29 3.4.10. Phân tích RFLP 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm 30 4.2. Kết quả ly trích DNA 30 4.3. Kết quả tinh sạch DNA 32 4.4. Kết quả PCR 33 4.5. Kết quả phân tích RFLP 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1.Kết luận 36 5.2.Đề nghị 36 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium 9 Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong 13 Hình 4.1 Nấm Beauveria và Metarrhizium 30 Hình 4.2 Kết quả ly trích 31 Hình 4.3 Kết quả tinh sạch 32 Hình 4.4:Kết quả PCR 34 Hình 4.5:Kết quả phân tích RFLP 35 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4 SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1 RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7 DONG3.1 : Dòng 3.1 BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6 RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3 PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2 SR : Sâu róm BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6 BHBD6 : Bọ hà Bình Dƣơng 6 PM : pico mol Ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base CZA : Czapek – Dox SDS : Sodium dodecyl sulphate PGA : Potato glucose agar SDA : Soduim dedocyl sulphate RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature PCR : Polymerase Chains Reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid ITS : Intenal Transcribed Spacer Taq : Thermus aquaticus TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat TE : Tris ethylene diamine tetra acetate ix [...]... quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng nhƣ Cơng Nghệ Sinh Hoc) trong Nơng Nghiệp và đời sống, nên chúng tơi đã thực hiện đề tài Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên cơn trùng gây hại Từ việc xác định chính xác trình tự của nucleotide trên gen phát sinh độc tố của nấm ký sinh trên cơn trùng gây hại cho hoa... hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phƣơng pháp PCR Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng gen độc Pr1 của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và ITS1 – 5.8S – ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana Xác định trình tự nucleotide của vùng gen gây độc Pr1 và ITS1... NẤM METARRHIZIUM ANISOPLIAE DI T CƠN TRÙNG GÂY HẠI PROBIOBASS CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM BEAUVERIA BASSIANA VUILLE DI T CƠN TRÙNG GÂY HẠI Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium (Nguồn : www.probioma.org.bo) 2.4 Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên cơn trùng - Hầu hết những lồi nấm gây bệnh cho cơn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua lớp vỏ cơ thể Bào tử nấm. .. Beauveria bassiana trên một số sâu hại cây trồng 2 Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen liên quan tới tính độc của 2 chủng nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1) và Beauveria bassiana, vùng ITS1 -5.8S – ITS2 3 Xác định tính đa dạng di truyền của gen Pr1 và gen ITS1 - 5.8S - ITS2 trên nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille bằng phƣơng pháp RFLP và phƣơng pháp giải trình tự (Sequencing)... là gen gây độc protease (Pr1) hiện di n ở nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 hiện di n trên nấm Beauveria bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại cây trồng Các mẫu phân lập nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc thu thập trên một số cơn trùng gây hại ở một số tỉnh thành trong nƣớc 3.2.1.2 Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự Các primer đƣợc dùng để... con ngƣời và tránh ơ nhiễm mơi trƣờng (Trần Văn Mão, 2004) 2.2 Giới thiệu về nấm ký sinh trên cơn trùng Cũng nhƣ vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với cơn trùng nhƣ sinh vật cộng sinh hoặc hoại sinh, nhƣng có nhiều lồi nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tƣợng bệnh lý và dẫn đến sự chết của cơn trùng Theo Steinhaus (1949) (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng, 4 1981) nấm ký sinh cơn trùng trong tự nhiên có thể gây chết... trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm ngun thủy sống dƣới nƣớc đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn Nấm gây bệnh cho cơn trùng có mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất tồn Deurteromycetes - Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các lồi ký sinh trên cơn trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và. .. đặc điểm của những giống Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana lây nhiễm trên cơn trùng Đó là phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) đƣợc tiết ra bởi nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S – ITS2 đƣợc tiết ra bởi nấm Beauveria bassiana và men cắt giới hạn các... 1.2.2 Mục tiêu Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đó tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae, và trình tự nucleotide của vùng gen ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dòng nấm Beauveria bassiana 1.2.3 u cầu nghiên cứu Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ nhiều... những họ nấm gồm tất cả các lồi đều là ký sinh trên cơn trùng nhƣ Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae - Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi có bộ Laboubiniades là những nấm ngoại ký sinh cơn trùng có chun tính cao, còn các lồi nấm túi khác đều là nội ký sinh của cơn trùng Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho cơn trùng là: Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales) - Lớp nấm đảm Basidiomycetes: . cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại. định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên côn trùng gây hại . Từ việc xác định chính xác trình