Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP TẠO VÀ TINH CHÉ KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG KHÁNG THÊ CHÓ Sinh viên thực : Phạm Thị cẩm Tiên Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 : Công nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TÓT NGHIỆP TẠO VÀ TINH CHÉ KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG KHÁNG THẺ CHÓ Sinh viên thực : Phạm Thị Câm Tiên Mã sô sinh viên : 1411527136 Lớp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dẫn : ThS Thái Thị Tuyết Trinh TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Đe tài khóa luận tốt nghiệp thực phịng Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng, Bộ môn Công nghệ sinh học Y dược, Khoa Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyền Tất Thành Đe tài tạo tinh chế kháng thể thỏ kháng kháng the chó Lời đầu tiên, tất tơn kính chân thành em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hữu Hùng, người truyền lửa cho em động lực đề tiếp tục bước tiếp đường nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Thái Thị Tuyết Trinh, người chị người tận tâm nghề hết lịng học trị, người bên cạnh hướng dần chia sẻ kinh nghiệm suốt q trình em làm khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn tồn thể thầy anh chị làm việc phịng Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng hồ trợ suốt trình em làm đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè lớp 14DSH02 bên cạnh, động viên, giúp đờ đe em hồn thành khóa luận Phạm Thị cẩm Tiên Khoa Cơng nghệ sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyền Tất Thành ii MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Mục lục iii Tóm tắt V Summary vi Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục hình ix Danh mục bảng X ĐẶT VÁN ĐÈ .1 CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát kháng thể IgG 1.2 ứng dụng kháng 1.3 Sắc ký lực qua cột protein G 1.3.1 Sắc ký lực 1.3.2 Protein G .8 1.4 Nghiên cứu nước ngồi nước kháng thể đa dịng .8 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 2.1 cứu 11 Vật liệu 11 2.1.1 Vật liệu đối tượng nghiên cứu 11 2.1.2 Hóa chất 11 2.1.3 Trang thiết bị 13 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Tạo kháng thể thỏ kháng kháng thể chó 14 2.2.1.1 Phương pháp gây đáp ứng miền dịch thỏ 14 2.2.1.2 Phương pháp thu nhận máu tách huyết thỏ 16 2.2.1.3 Phương pháp khuếch tán kép thạch (Ouchterlony) 16 2.2.2 Tinh chế IgG thỏ kháng IgG chó 17 2.2.2.1 Phương pháp tủa huyết nồng độ ammonium sulphate [(NH4)2SƠ4] 45% 17 2.2.2.2 Phương pháp thẩm tích 18 iii 2.2.2.3 Phương pháp sắc ký lực qua cột protein G 19 2.2.3 Kiếm tra đánh giá chất lượng IgG thỏ kháng IgG chó sau tinh chế 20 2.2.3.1 Phương pháp điện di biến tính (SDS - PAGE) 20 2.2.3.2 Phương pháp Western Blot 21 2.2.3.3 Phương pháp đo mật độ quang OD280 23 2.2.3.4 Phương pháp Dot Blot 24 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Gây đáp ứng miền dịch thỏ với IgG chó 25 3.1.1 Kiểm tra đáp ứng thỏ với kháng nguyên IgG chó trước gây mần cảm 25 3.1.2 Quan sát đáp ứng thỏ sau gây đáp ứng miễn dịch .26 3.1.3 Đánh giá chất lượng kháng the thỏ 27 3.1.3.1 Kiếm tra đáp ứng miễn dịch 27 3.1.3.2 Kiểm tra hiệu giá kháng thể 28 3.2 Tinh chế IgG thỏ kháng IgG chó 29 3.2.1 Tủa huyết thỏ nồng độ Ammonium Sulphate 45% 29 3.2.2 Sắc ký lực qua cột protein G 30 3.2.3 Kiếm tra hoạt tính cùa IgG sau tinh chế 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 38 iv TÓM TẮT Đe tài: “Tạo tinh chế kháng thể thỏ kháng kháng thể chó” thực từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2018 phịng thí nghiệm Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng phòng Ung thư - Te bào gốc, Bộ môn Công nghệ sinh học Y dược, Khoa Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành với mục tiêu: Mục tiêu chung: Trong đề tài này, chúng tơi nhằm mục đích tạo tinh chế kháng thể IgG thỏ kháng đặc hiệu với IgG chó thơng qua q trình tiêm thỏ với IgG chó kết hợp với tá dược Freund, nhằm chủ động tạo nguồn nguyên liệu có độ tinh cao phục vụ cho nghiên cứu tạo tiền đề phát triển sản phẩm chẩn đoán bệnh động vật Mục tiêu cụ thê: • Gây đáp ứng miền dịch thành công thỏ, tạo kháng the thỏ kháng kháng thể chó • Thu nhận tinh chế kháng thể thỏ kháng kháng thể chó • Đánh giá độ tinh kháng thể thỏ sau tinh chế • Kiểm tra hoạt tính IgG sau tinh chế Đe tài có ba nội dung chính: • Nội dung 1: Tạo kháng thể thỏ kháng kháng chó • Nội dung 2: Tinh che IgG thỏ kháng IgG chó • Nội dung 3: Đánh giá chất lượng IgG thỏ kháng IgG chó sau tinh che Ket đạt đề tài nghiên cứu: Gây đáp ứng miễn dịch thành công thỏ, thu huyết thỏ chứa kháng the kháng IgG chó Thu 10 mg kháng thể thỏ kháng kháng thể chó với độ tinh >95% dựa vào điện di SDS - PAGE V SUMMARY Subject: “Production and purification rabbit anti dog IgG antibody.” were performed from February to August 2018 at the Biochemistry - Biopharmacy Parasitology laboratory and Cancer cell - Stem cell laboratory, the Department of Medical Biotechnology, the Faculty of Biotechnology and Environment, Nguyen Tat Thanh University, with the objective: General objectives: In this study, we aimed to produce and purify Rabbit anti-Dog IgG via immunizing rabbit with dog IgG use Freund adjuvant To created antibodies have a high-quality purification that to be used to the development research, the premises for diagnostics products in animals Details: • Causes successful immune response in Rabbit Production of Rabbit anti Dog IgG • Collected and purify Rabbit IgG anti Dog IgG • Evaluation of the purified and Rabbit anti-Dog IgG • Test the activity of IgG after purify The study has three main contents: • Content 1: Production of Rabbit anti-Dog IgG • Content 2: Purification of Rabbit anti-Dog IgG • Content 3: Evaluation of the quality of Rabbit anti-Dog IgG after purified Results of the research: Successful immunization of Rabbit with Dog IgG 10 mg Rabbit anti-Dog IgG purify >95% base on SDS - PAGE vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TÁT APC Te bào trình diện kháng nguyên (Antigen presenting cell) AS Ammonium sulphate CAP Chloramphenicol CFA Tá dược hoàn chỉnh (Complete Freund’s-Adjuvant) Ch Vùng co định chuồi nặng (Constant domain of heavy chain) Cl Vùng co định chuồi nhẹ (Constant domain of light chain) dHọO Nước cat DTT Dithiothreitol DUMD Đáp ứng miễn dịch ELISA Kỳ thuật chất hấp thụ miền dịch gắn enzyme (Enzym - Link Immunosorbent Assay) F(ab)’2 Phân đoạn cùa kháng the cat bang pepsin Fab Phân mảnh gắn kháng nguyên (Fragment antigen binding) Fc Phân mảnh kết tinh (Fragment crystallisable) HRP Horseradish peroxidase HT Huyết ICC/IF Hóa tế bào miền dịch/Miễn dịch huỳnh quang (Immunocytochemistry/Immunofluoranscene) IFA Tá dược khơng hồn chỉnh (Incomplete Freund’s-Adjuvant) IgG Immunoglobulin G IHC Hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) KN Kháng nguyên KT Kháng thể LC/MS/MS Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ Mer [3 - Mercaptoethanol MWCO Molecular weight cut - off NCV Nghiên cứu viên NK Te bào tiêu diệt tự nhiên (Natural killer cells) OD Mật độ quang học (Optical density) vii PA Kháng đa dòng (Polyclonal antibody) PBS Phosphate buffer saline PVDF Polyvinylidene difluoride SDS- PAGE Sodium Dodecyl Sulphate (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SDS Sodium Dodecyl Sulphate TBST Tris - buffer saline (TBS) + Tween 20 TC Tăng cường TEMED N, N, N’, N’ - Tetramethylendiamine TF Dòng tế bào erythroleukemic TMB 3, 3’, 5, 5' - Tetramethylbenzidine Vh Vùng biến thiên chuồi nặng (Variable domain of heavy chain) Vl Vùng biến thiên chuồi nhẹ (Variable domain of light chain) viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc kháng thể IgG Hình 1.2 Phương pháp tiêm da áp dụng động vật Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình tinh chế kháng thể thỏ kháng kháng thể chó Hình 3.1 Ket kiêm tra đáp ứng thỏ với kháng nguyên IgG chó trước gây mần cảm Hình 3.2 Ket quan sát trực quan đáp ứng thỏ vị trí mũi tiêm sau mẫn cảm Hình 3.3 Ket quan sát trực quan đáp ứng thỏ vị trí mũi tiêm sau tăng cường Hình 3.4 Ket quan sát trực quan đáp ứng thỏ vị trí mũi tiêm sau tăng cường Hình 3.5 Đáp ứng kháng nguyên (IgG chó) với huyết sau mẫn cảm Hình 3.6 Ket hiệu giá kháng the qua lần tiêm tăng cường Hình 3.7 Phân tích IgG sau tủa với AS 45% bão hòa SDS - PAGE 12,5% Hình 3.8 Sắc ký đo qua cột protein G Hình 3.9 Ket điện di SDS - PAGE mẫu trước sau sắc ký lực qua cột protein G ix ... miễn dịch thỏ thành công, tạo kháng the thỏ kháng IgG chó • Thu nhận tinh chế kháng thể thỏ kháng kháng the chó có độ tinh cao • Đánh giá độ tinh độ đặc hiệu kháng the thỏ sau tinh chế CHƯƠNG... kháng kháng thể chó • Đánh giá độ tinh kháng thể thỏ sau tinh chế • Kiểm tra hoạt tính IgG sau tinh chế Đe tài có ba nội dung chính: • Nội dung 1: Tạo kháng thể thỏ kháng kháng chó • Nội dung 2: Tinh. .. phẩm mà tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu phát triển Do đó, thực đe tài ? ?Tạo tinh chế kháng thể thỏ kháng khảng thể cho” nhằm chủ động tạo nguồn nguyên liệu kháng thể IgG thỏ kháng kháng