Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP TẠO VÀ TINH CHÉ KHÁNG THẺ IgG CHUỘT KHÁNG DICH BÀI XUẤT/TIÉT CÚA SÁN LÁ GAN LƠN Fasciola gigantica Sinh viên thực : Nguyễn Thị Trúc Phương Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2018 Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO VÀ TINH CHÉ KHÁNG THÉ IgG CHUỘT KHÁNG DỊCH BÀI XUẤT/TIÉT CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Fasciola gigantica Sinh viên thực : Nguyễn Thị Trúc Phương Mă số sinh viên : 1411527528 Lớp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Thái Thị Tuyết Trinh Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2018 LỜI CẢM ƠN Đe thực hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp này, tơi đà nhận hồ trợ, giúp đỡ quan tâm nhiều người Với lòng biet on sâu sắc tình cảm chân thành, trước hết, tơi xin cảm ơn quý Thầy, Cô Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đà truyền đạt kiến thức quý báu thời gian học tập Đặc biệt, tơi xin tở lịng biết ơn sâu sac đến thầy Nguyễn Hữu Hùng, cô Nguyễn Thị Phương, cô Đặng Ngọc Kim Thùy, cô Thái Thị Tuyết Trinh anh, chị phịng Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng phòng Ưng thư - Te bào gốc, môn Công nghệ Sinh học Y dược, khoa Công nghệ Sinh học Môi trường tận tình giúp đỡ, động viên khó khăn trình thực đề tài Đồng thời, cám ơn bạn Thu, bạn Luyn Na bạn sinh viên lóp 14DSH02 ln giúp đỡ tơi thời gian qua Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến ba, mẹ, chị ln u thương, chăm sóc động viên đế thực hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Trúc Phương Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nguyễn Tất Thành 11 MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Mục lục iii Tóm tắt vi Summary vii Danh mục chữ viết tắt viii Danh mục hình X Danh mục bảng xi ĐẶT VÁN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sán lớn gan 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Lịch sử phát bệnh sán gan lớn .2 1.1.3 Hình thái 1.1.4 Chu trình phát triển 1.1.5 Đặc điếm dịch tễ 1.1.6 Chẩn đoán 1.1.6.1 Tìm trứng phân 1.1.6.2 Xét nghiệm huyết học 1.1.6.3 Siêu âm tong quát vùng gan mật 1.1.6.4 Chụp X quang lồng ngực 1.1.6.5 Xét nghiệm mô học 1.1.6.6 Một số phương pháp chẩn đoán khác 1.2 Khái quát kháng the IgG 1.2.1 Cấu trúc phân tử IgG 1.2.2 Chức kháng thể IgG 1.2.3 Kháng the đa dòng kháng the đơn dòng 1.3 Sản xuất kháng thể tinh chế kháng thể IgG 1.3.1 Tá chất 1.3.2 Các phương pháp tinh chế kháng the IgG 10 1.3.2.1 Phương pháp tủa IgG muối ammonium sulphate 10 iii 1.3.2.2 Sắc ký lực qua cột protein A protein G 11 1.3.2.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 12 1.3.2.4 Phương pháp sắc ký trao đổi ion 13 1.4 ứng dụng 13 1.5 Phần mềm định lượng Quantity-One (BioRad) 14 1.6 Các nghiên cứu nước 14 1.6.1 Nghiên cứu giới 14 1.6.2 Nghiên cứu nước 15 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 16 2.1 Địa điếm nghiên cứu 16 2.2 Vật liệu - hóa chất 16 2.2.1 Vật liệu 16 2.2.2 Hóa chất 16 2.3 Nội dung phương pháp 19 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.2.1 Gây đáp ứng miễn dịch chuột 19 2.3.2.2 Kiềm tra đáp ứng mần cảm chuột thí nghiệm dịch tiết F gigantica 20 2.3.2.3 Tinh chế IgG chuột kháng dịch xuất/tiết F gigantica 21 2.3.2.4 Đánh giá chất lượng IgG chuột sau tinh chế 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Đáp ứng miễn dịch chuột với dịch xuất/tiết (dịch E/S) sán gan lớn F gigan tica 'll 3.1.1 Định tính kháng kháng đặc hiệu E/S sán gan lớn F gigantica trước sau gây đáp ứng miền dịch 27 3.1.2 Hiệu giá kháng thể 28 3.2 Tinh chế IgG chuột 29 3.2.1 Tủa IgG chuột bang ammonium sulphate 45% .29 3.2.1.1 Định lượng kháng the IgG chuột phương pháp quang phổ 29 3.2.1.2 Định tính IgG chuột sau tủa phương pháp SDS-PAGE 30 IV 3.2.2 Sắc ký qua cột protein G 31 3.3 Kiểm tra hoạt tính kháng thể IgG sau tinh chế 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHAO 36 PHỤ LỤC 38 V TÓM TẮT Đe tài: “Tạo tinh chế kháng thể IgG chuột kháng dịch xuất/tiết sán gan lớn Fasciola gigantica” thực từ tháng 8/2017 đến tháng 8/2018 Phịng thí nghiệm Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng thuộc khoa Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, với mục tiêu tạo tinh chế kháng thể IgG chuột kháng dịch xuất/tiết sán gan lớn Fasciola gigantica, làm tiền đề cho quy trình sản xuất kháng the đặc hiệu sán gan lớn dùng sản pham chan đoán bệnh sán gan người động vật Đe tài có nội dung: (1) Tạo kháng thể chuột kháng dịch xuất/tiết (E/S) Fasciola gigantica (F gigantica); (2) Tinh chế IgG chuột kháng dịch xuất/tiết F gigantica; (3) Kiểm tra độ tinh hoạt tính kháng thể IgG sau tinh chế Kết đạt sau: Thành công việc gây đáp ứng miễn dịch chuột thu nhận kháng the IgG chuột kháng dịch xuất/tiết sán gan lớn F gigantica Hàm lượng IgG kháng E/S sán gan lớn F gigantỉca thu sau tinh chế khoảng 33 mg Tinh thành công kháng the IgG chuột kháng dịch E/S sán gan lớn F gigantica với độ tinh khoảng 95% vi SUMMARY The topic of this dissertation: “Creation and purification of mouse IgG against crude excretory/secretory of Fasciola gigantica” was conducted from August 2017 to August 2018 in Biochemistry - Biopharmacy - Parasitology Laboratory under Faculty of Biotechnology and Environment, Nguyen Tat Thanh University With the aim of creating and purifying mouse IgG against crude excretory/secretory of F.gigantica, this was the initial step for creation of specific-antibody against Fasciola gigantica applied for producing some diagnosis products for human and animals The dissertation has three sections: (1) Creating and obtaining mouse IgG against crude excretory/secretory of Fasciola gigantica; (2) Purification of mouse IgG against crude excretory/secretory of Fasciola gigantica', (3) The purity and bio-activity definition of purified antibody The subsequent results: Succeeded in making immune responses in mouse and obtaining mouse IgG against crude excretory/secretory of Fasciola gigantica Purified IgG against crude excretory/secretory of Fasciola gigantica was 33 mg Succeeded in purifying IgG against crude excretory/secretory of Fasciola gigantica with the purity of 95% DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT APS: Ammonium persulphate AS: Ammonium sulphate ADCC: Gây độc tế bào phụ thuộc kháng the (Antibody dependent cell mediated cytotoxicity) ASAT: Aspartate amino transferase ALAT: Alanin amino transferase AKP: Alkalin phophatase BSA: Albumin huyết bò (Bovine serum albumin) B pertussis: Bordetella pertussis CDC: Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh (Center of Disease Control and Prevention) dH2O: Nước cat ELISA: Kỳ thuật chat hap thụ miễn dịch gan enzyme (Enzyme-Link Immunosorbent Assay) EIA: Enzyme Immunosorbent E/S: Dịch xuat/tiet sán gan lớn Fasciola gigantica FCA: Tá chất tồn phần (Freund’s Complete Adjuvant) FIA: Tá chất khơng toàn phần (Freund’s Incomplete Adjuvant) Fab: Phân mảnh gắn kháng nguyên (Fragment antigen binding) Fc: Phân mảnh kết tinh (Fragment crystallisable) GLDH: Glutamate lactat dehydrogenase GGT: Gamma glutamyl transferase HRP: Horseradish peroxidase Hb: Thơng so hemoglobin IHC: Hóa mơ miễn dịch (Immonohistochemistry) ICC/IF: Hóa mơ miễn dịch/Miền dịch huỳnh quang (Immonohistochemistry/Immonofluoranscene) ISCOM: Phức hợp kích thích miễn dịch (Immune stimulating complexes) IgG: Immunoglobulin G kDa: Kilo Dalton Vlll NK: Te bào giết tự nhiên (Natural killer cells) PBS: Phosphate-buffered saline PBS-T: Phosphate-buffered saline with tween 20 SDS: Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulphate - Polyacrylamide gel Electrophoresis SGOP: Serum glutamic oxaloacetic transaminase SGPT: Serum glutamic pyruvic transaminase TMB: 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine TEMED: N, N, N’, N’-Tetramethylendiamine WHO: To chức Y te The giới (World Health Organization) IX ... (1) Tạo kháng thể chuột kháng dịch xuất/ tiết (E/S) Fasciola gigantica (F gigantica); (2) Tinh chế IgG chuột kháng dịch xuất/ tiết F gigantica; (3) Kiểm tra độ tinh hoạt tính kháng thể IgG sau tinh. .. tiêu tạo tinh chế kháng thể IgG chuột kháng dịch xuất/ tiết sán gan lớn Fasciola gigantica, làm tiền đề cho quy trình sản xuất kháng the đặc hiệu sán gan lớn dùng sản pham chan đoán bệnh sán gan. .. trị kinh tế cao Vì vậy, đề tài ? ?Tạo tinh chế kháng thể IgG chuột kháng dịch xuất/ tiết sán gan lớn Fasciola gỉgantica” thực nhằm tạo nguồn kháng IgG tinh đặc hiệu, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát