Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CONG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP TẠO KHÁNG THÊ IgG CHÓ CÕNG HỢP SULFO - NHS - BIOTIN Sinh viên thực : Nguyền Thị Phong Thư Chuyên ngành : Công nghệ sinh học TP.HCM, tháng năm 2018 Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP TẠO KHÁNG THỂ IgG CHÓ CỘNG HỢP SULFO - NHS - BIOTIN Sinh viên thực : Nguyền Thị Phong Thư Mãsốsinhviên : 1411514149 Lớp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Phưong Thảo TP.HCM, tháng 08 năm 2018 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn: TS Nguyễn Hừu Hùng người thầy tạo điều kiện đe em có hội thực khóa luận tot nghiệp ThS Lê Thị Phương Thảo tận tình chi dạy, hướng dần, đóng góp nhiều ý kiến quý báu chia sẻ khó khăn suốt thời gian qua đe em thực tốt đề tài Ban giám hiệu trường đại học Nguyễn Tất Thành, Khoa Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành hồ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình học tập để em hồn thành khóa luận Các anh chị bạn phịng thí nghiệm cùa Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Y dược, Khoa Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyền Tất Thành Sau xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ gia đình ln bên cạnh ủng hộ tạo cho kiến thức ngày hôm Nguyền Thị Phong Thư Khoa Công Nghệ Sinh Học Môi Trường Trường Đại học Nguyền Tất Thành ii MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Tóm tắt V Danh mục chừ viết tắt vii Danh mục hình viii Danh mục bảng ix ĐẶT VÁN ĐỀ .1 CHƯƠNG TÒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc kháng the 1.2 Sắc ký lực 1.3 Sulfo - NHS - biotin 1.4 Các nghiên cứu nước 1.4.1 Nghiên cứu nước 1.4.2 Nghiên cứu nước CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu đối tượngnghiên cứu 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Trang thiết bị 11 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 12 2.2.1 Nội dung 12 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 12 2.2.2.1 Thu nhận huyết chó 12 2.2.2.2 Tủa muối ammonium sulfate 12 2.2.2.3 Thẩm tích trao đổi dung dịch đệm 14 iii 2.2.2.4 Sắc ký lực qua cột protein A 14 2.2.2.5 Định lượng protein quang phố kế 15 2.2.2.6 Điện di biến tính protein (SDS - PAGE) 16 2.2.2.7 Cộng hợp với sulfo - NHS - biotin 18 2.2.2.8 Phương pháp Western Blot 19 2.2.2.9 Phương pháp đánh giá protein sau tinh chế 20 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Kết tinh chế IgG chó 21 3.1.1 Ket tủa kháng the bang ammonium sulfate 21 3.1.2 Ket sắc ký lực qua cột protein A 22 3.2 Ket sau cộng hợp sulfo - NHS - biotin 25 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC 30 iv TÓM TẮT Đe tài “Tạo kháng IgG chó cộng họp sulfo- NHS-biotin” thực từ tháng 02/2018 đến tháng 08/2018 phịng Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng, Bộ môn Công nghệ sinh học Y dược, Khoa Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành với hai mục tiêu chính: tinh chế IgG từ huyết chó có độ tinh cao tạo IgG chó cộng họp sulfo - NHS - biotin Đe tài có hai nội dung chính: - Thiết lập quy trình tinh chế IgG từ huyết chó gồm hai bước: tủa miền dịch sắc ký lực qua cột protein A - Cộng họp thành công sulfo - NHS - biotin lên IgG vừa tinh chế Ket đạt được: - Thiết lập quy trình tinh chế IgG chó phương pháp tủa với muối ammonium sulfate sắc ký lực qua cột protein A - Thu IgG chó có độ tinh cao, khoảng 87,5% với hiệu tinh chế khoảng 51,4% - Cộng hợp thành công sulfo - NHS - biotin lên IgG chó tinh V SUMMARY Subject: “Production dog IgG conjugated sulfo - NHS - biotin” was performed from February to August 2018 at Biochemistry - Biopharmacy Parasitology Laboratory, Department of Medical Biotechnology, Biotechnology and Environment, Nguyen Tat Thanh University with two main goals: purification of IgG from dog serumand production dog IgG conjugated sulfo - NHS - biotin The subject has two main contents: - Establishment of IgG purification from dog serum consists of two steps: immuno constriction and affinity chromatography via protein A - Successful in conjugating sulfo - NHS -biotin with purifylgG Results of the research: - Establishment of dog IgG purification by immunoprecipitation with ammonium sufate and affinity chromatography via protein A column - Collection dog high purity dog IgG, about 87,5% with recovery efficiency 51,4% - Successful in conjugating sulfo - NHS - biotin into purify dog IgG vi DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT AS Ammonium sulfate AMP Protein hạnh nhân - Almond major protein Ch Domain co định chuồi nặng - Constant domain of heavy chain Cl Domain co định chuồi nhẹ - Constant domain of light chain DDT Dithiotheitol DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide ELISA Kỳ thuật chat hap thụ miền dịch gan enzyme - Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay Fab Phân mảnh gắn kháng nguyên - Fragment antigen binding Fc Phân mảnh kết tinh - Fragment crystallisable FITC Fluoresceinisothiocyante HRP Horseradish Peroxidase IgG Immunoglobulin G Mer p - Mercaptoethanol NCV Nghiên cứu viên NHS N - Hydroxysuccinimide OD Mật độ quang học - Optical Density PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PBS Phosphate - buffered saline SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS Sodium Dodecyl Sulphate TBST Tris - buffer saline (TBS) + Tween 20 TEMED N,N,N',N - Tetramethylethylenediamine Vh Domain biến thiên chuồi nặng - Variable domain of heavy chain Vl Domain biến thiên chuồi nhẹ -Variable domain of light chain vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc kháng IgG Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Biotin Hình 3.1 Phân tích IgG sau tủa với AS SDS - PAGE Hình 3.2 Ket sắc ký lực qua cột protein A Hình 3.3 Lai Western Blot kiếm tra độ tinh IgG chó sau sắc ký Hình 3.4 Ket sau cộng hợp với sulfo - NHS - biotin Hình S3.1 Ket phân tích độ tinh cùa IgG sau tinh chế phần mềm Quantity - One DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần số protein có huyết chó Bảng 2.2 Danh sách thiết bị sử dụng đề tài Bảng 2.3 Ái lực protein A protein G với IgG loài Bảng 2.4 Thành phần gel điện di Bảng 3.1 Ket định lượng protein mầu huyết chó trước sau tủa muối AS nồng độ Bảng 3.2 Ket định lượng mầu protein trước sau sắc ký ... IgG chó có độ tinh cao, khoảng 87,5% với hiệu tinh chế khoảng 51,4% - Cộng hợp thành công sulfo - NHS - biotin lên IgG chó tinh V SUMMARY Subject: “Production dog IgG conjugated sulfo - NHS -. .. Nam Với lí trên, chúng tơi thực đề tài ? ?Tạo kháng thể IgG chó cộng hợp sulfo - NHS - biotin” nhằm tạo nguồn nguyên liệu kháng the IgG chó tinh sạch, từ tạo tiền đề để tiếp tục phát triển sản phẩm... tiêu chính: tinh chế IgG từ huyết chó có độ tinh cao tạo IgG chó cộng họp sulfo - NHS - biotin Đe tài có hai nội dung chính: - Thiết lập quy trình tinh chế IgG từ huyết chó gồm hai bước: tủa