ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP CHẨN ĐỐN VÀ ĐỊNH DANH PARVOVIRUS TRONG MẪU PHÂN TIÊU CHẢY TRÊN CHĨ THU THẬP TẠI MỘT SĨ PHỊNG KHÁM TẠI THÀNH PHỐ HỊ CHÍ MINH : Nguyễn Thanh Thoa Sinh viên thực MSSV : GVHD : TS Thân Văn Thái TP HCM, tháng năm 2019 1511542780 ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP CHẨN ĐỐN VÀ ĐỊNH DANH PARVOVIRUS TRONG MẪU PHÂN TIÊU CHẢY TRÊN CHÓ THU THẬP TẠI MỘT SỐ PHỊNG KHÁM TẠI THÀNH PHỐ HỊ CHÍ MINH Sinh viên thực : Nguyền Thanh Thoa Mã sổ sinh viên : 1511542780 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Thân Văn Thái TP HCM, tháng năm 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH CỘNG HÒA XÀ HÒI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Nguyền Thanh Thoa MSSV: 1511542780 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 15DSH1B Đầu đề luận văn: Chẩn đoán định danh Parvovirus mẫu phân tiêu chảy chó thu thập số phịng khám Tp Hồ Chí Minh Mục tiêu - Xác định tỷ lệ chó mắc phải Parvovirus - Xác định đặc tính di truyền Parvovirus Nội dung: - Thu thập mẫu bệnh phẩm tiêu chảy cùa chó nghi nhiễm CPV - Tinh chế vật liệu di truyền - Chẩn đoán tác nhân CPV test ELISA phản ứng khuếch đại PCR - Khuếch đại gen VP2 CPV - Giải trình tự gen VP2 CPV - Phân tích trình tự gen VP2 cùa CPV Thời gian thực hiện: tháng 02-8/2019 Người hướng dần chính: TS Thân Văn Thái Người hướng dẫn phụ: Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng nănứO Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẲN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Em xin gừi lời cảm ơn đến quý Thầy/Cô Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập vừa qua, tạo điều kiện tốt đe em hồn thành khố luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn BSTY Nguyễn Văn Hùng, Giám đốc phòng khám Thú y, 658 Hương Lộ 2, Bình Trị Đơng A, Bình Tân; BSTY Nguyễn Thị Thi, Giám đốc phịng khám Thú y Dog & Cat, 612 Nguyền Văn Quá, Đông Hưng Thuận, Quận 12, Tp Hồ Chí Minh tận tình hồ trợ cung cấp mầu bệnh phẩm để giúp em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy Thân Văn Thái tận tình hướng dần, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Sau em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè bạn sinh viên lớp 15DSH1B ln động viên, giúp đỡ q trình làm khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thanh Thoa Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC .ii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẾU viii DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT ix ĐẶT VẤN ĐỀ X CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm lịch sử bệnh tiêu chảy chó Canine parvovirus .1 1.2 Phân loại Canine parvovirus 1.3 Câu trúc cùa Canine parvovirus 1.4 Các đường lây nhiễm Canine parvovirus 1.5 Sinh bệnh học 1.5.1 Canine parvovirus ruột 1.5.2 Canine parvovirus tim 1.5.3 Các triệu chứng thường thấy chó nhiễm CPV 1.7 Các nghiên cứu nước 1.7.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.7.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.8 Các phương pháp chẩn đoán 1.8.1 Phương pháp xét nghiệm ELISA ii 1.8.2 Phương pháp PCR 1.8.3 Phương pháp Real-time PCR 1.8.4 Phương pháp Nested PCR 1.9 Giải trình tự gen 1.9.1 Nguyên lý giải trình tự gen bang enzyme 1.9.2 Nguyên lý giải trình tự gen phương pháp hóa học 1.9.3 Giải trình tự tự động 1.10 Phân tích trình tự gen 1.11 Xây dựng phát sinh loài CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 11 2.1 Nơi thực 11 2.2 Nội dung nghiên cứu 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Phương pháp thu nhận mầu 11 2.3.2 Thử nghiệm phản ứng ELISA 12 2.3.3 Tách chiết DNA 12 2.3.4 Phản ứng khuếch đại PCR 13 2.3.5 Phản ứng Nested PCR 14 2.3.5 Giải trình tự gen VP2 15 2.3.6 Phân tích trình tự gene 15 2.3.7 Xây dựng phân tích phả hệ 15 CHƯƠNG KỂT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Thu mẫu 16 3.2 Kết PCR phát nested PCR 17 3.2 Kết khuếch đại gene VP2 19 iii 3.3 Kết giải trình tự 19 3.3 Kết phả hệ 22 3.4 So sánh trình tự nucleotide acid amin 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC 28 IV TÓM TẤT Canine parvovirus (CPV) virus gây bệnh viêm ruột viêm tim chó Đây bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguy hiểm có tỷ lệ gầy tử vong cao không phát điều trị kịp thời, chó chó chưa tiêm vaccine phịng bệnh Canine parvovirus lồi có tốc độ tiến hóa phát triển nhanh chóng, có nhiều biến dị di truyền kháng nguyên nghiên cứu cơng bố tồn giới Ngồi ra, virus cịn có khả phát tán nhanh tồn ngồi mơi trường tự nhiên suốt thời gian dài nên nguy lây nhiễm cao Hiện nay, bệnh có vaccine tiêm phịng chưa có thuốc đặc trị, nên việc theo dõi cập nhật tình hình dịch bệnh tìm hiểu, làm rõ đặc diem di truyền Canine parvovirus việc làm quan trọng có tính cấp thiết Đe tài: “Chẩn đoán định danh Parvovirus mẫu phân tiêu chảy chó thu thập số phịng khám Thành phố Hồ Chí Minh” thực từ tháng 02-8/2009 phòng Vi sinh Sinh học Phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học với mục tiêu xác định tỷ lệ chó mắc phải parvovirus đặc tính di truyền chúng Đe tài có nội dung sau: Thu thập mẫu bệnh phẩm tiêu chảy chó nghi nhiễm CPV; tách chiết DNA; phản ứng khuếch đại PCR; giải trình tự gen VP2; phân tích đặc tính di truyền vùng trinh tự VP2 Những kết đạt sau: Tong số 90 mẫu bệnh phẩm thu thập từ phòng khám Thú y Phương pháp PCR sử dụng moi đặc hiệu cho CPV cho kết dương tính 78/90 mầu (86.7 %) Giải trình tự gen VP2 cùa 10 chùng CPVs Phân tích trình tự gen VP2 xây dựng phát sinh loài V SUMMARY Canine parvovirus is a virus that causes enteritis and myocarditis in dogs This is an acute and dangerous infectious disease and has a very high rate of death if not detected and treated promptly, especially in puppies and dogs that have not been vaccinated against disease Canine parvovirus is a rapidly evolving and rapidly developing species, it has many genetic and antigen variants that have been studied and published worldwide In addition, pathogens can spread quickly and survive outside the natural environment for a long time, so the risk of infection is very high Currently, the disease only has a vaccination vaccine and there is no specific medicine, so it is important to monitor and update the situation of the disease and to understand and clarify the genetic characteristics of canine parvovirus Subject: “Detection and genetic characterization of canine parvovirus in fecal samples with acute diarrhea collected in pet clinics in Ho Chi Minh City” was performed between 02-8/2009 at Microbiology laboratory, Nguyen Tat Thanh University The topic contains following contents: sample collection from dogs with acute diarrhea and CPV symptoms, DNA extraction, PCR, VP2 gen sequencing and analysis Achieved results are as follow: There are 90 diarrhea samples were collected from suspected dogs with acute diarrhea PCR results showed 78/90 samples (86.7 %) were CPVs VP2 genes of the 10 CPV strains were sequenced VP2 genes were analyzed and the phylogenetic tree was conducted vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Bộ gen hồn chỉnh Canine parvovirus Hình 2.1 Thu thập mẫu phân tiêu chảy chó 12 Hình 2.2 Phản ứng ELISA chẩn đoán CPVs 12 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR 17 Hình 3.2 Kết điện di phương pháp Nested PCR 18 Hình 3.3 Kết khuếch đại đoạn gene VP2 CPV phương pháp PCR 19 Hình 3.4 Kiếm tra kết giải trình tự 20 Hình 3.5 Một kết BLAST trình tự NCBI 20 Hình 3.6 Phần trình tự bị thừa so với trình tự tham chiếu 21 Hình 3.7 Trình tự sau cắt bỏ hai đầu dư thừa 21 Hình 3.8 Cây phả hệ phân tích mối tương quan giừa gen VP2 chủng CPVs nghiên cứu với chủng CPVs tham chiếu 23 vii ... luận văn: Chẩn đoán định danh Parvovirus mẫu phân tiêu chảy chó thu thập số phịng khám Tp Hồ Chí Minh Mục tiêu - Xác định tỷ lệ chó mắc phải Parvovirus - Xác định đặc tính di truyền Parvovirus. .. mẫu phân tiêu chảy chó thu thập số phòng khám Thành phố Hồ Chí Minh” thực từ tháng 02-8/2009 phịng Vi sinh Sinh học Phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học với mục tiêu xác định tỷ lệ chó mắc phải parvovirus. .. trên, chọn đề tài: ? ?Chẩn đoán định danh Parvovirus mẫu phân tiêu chảy chó thu thập số phịng khám Tp Hồ Chí Minh” X Mục tiêu ciia đề tài Xác định tỷ lệ chó mắc phải Parvovirus đặc tính di truyền chúng,