ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐẶC ĐIÉM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ ĐẶC TÍNH XÂM NHIỄM, LAN TRUYỀN CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH THỐI MÈM NHA ĐAM TẠI NINH THUẬN Sinh viên thực : Nguyền Thị Mai Phương MSSV : 1511542529 GVHD : TS Thân Văn Thái ThS Nguyễn Thị Nhã TP HCM, 2019 ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐẶC ĐIỀM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ ĐẶC TÍNH XÂM NHIỄM, LAN TRUYỀN CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH THỐI MÈM NHA ĐAM TẠI NINH THUẬN Sinh viên thực : Nguyền Thị Mai Phương Mà sổ sinh viên : 1511542529 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dần : TS Thân Văn Thái ThS Nguyễn Thị Nhã TP HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH CỘNG HỊA XÀ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Nguyễn Thị Mai Phương MSSV: 1511542529 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 15DSH1B Đầu đề luận văn: Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, lan truyền vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha đam Ninh Thuận Mục tiêu - Xác định đặc điểm hình thái phân tử vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha đam thu thập tỉnh Ninh Thuận - Xác định đặc tính xâm nhiễm, lây truyền vi khuấn gây bệnh thối mềm nha đam thu thập tỉnh Ninh Thuận Nội dung: - Xác định đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh thối mềm nha đam - Phân tích đặc điểm phân tử vùng nhận dạng vi khuẩn 16S rRNA - Xác định đặc tính lây nhiễm vi khuẩn thông qua gây nhiễm nhân tạo Thời gian thực hiện: Tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Người hướng dẫn chính: TS Thân Văn Thái Người hướng dẫn phụ: ThS Nguyền Thị Nhã Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng nãm20 Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẢN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Đe hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành gửi lời cảm on đến: Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa, Quý thầy cô cùa khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nguyền Tất Thành tạo điều kiện, nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức chuyên mơn cho tơi suốt q trình học tập trường Thầy Thân Văn Thái cô Nguyễn Thị Nhã khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nguyền Tất Thành tạo điều kiện tốt hồ trợ tơi suốt q trình thực tập nghiên cứu, hoàn thành tốt đề tài Các bạn sinh viên phịng thí nghiệm Sinh học Phân Tử khoa Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành đà phối hợp hồ trợ, động viên tơi hồn thành tốt đề tài Anh Sơn thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận tạo điều kiện cho tơi hồn thành nghiên cứu Xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khuyến khích, hỗ trợ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Nguyễn Thị Mai Phương Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iỉ SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viỉ DANH MỤC BẢNG BIẾU viii DANH MỤC CHƯ VIẾT TẮT ix CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tông quan vê nha đam 1.1.1 Giới thiệu chung nha đam 1.1.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ nha đam 1.1.3 Tình hình bệnh hại nha đam tác hại 1.2 Một số đặc điểm canh tác nha đam Ninh Thuận 1.3 Phương pháp chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh 1.3.1 Chẩn đoán theo triệu chứng 1.3.2 Chấn đoán phương pháp vi sinh 1.3.3 Chấn đoán phương pháp sinh hóa 1.3.4 Chấn đoán phương pháp huyết 1.3.5 Chấn đoán phương pháp sinh học phân tử 1.4 Phương pháp định danh vi khuân dựa vùng trình tự 16S rRNA 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh thối mềm nha dam nước 11 1.5.1 Tình hình nghiên cứu bệnh thối mềm nha dam giới 11 1.5.2 Tình hình nghiên cứu bệnh thối mềm nha dam Việt Nam 11 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 12 2.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 12 ii 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.3 Đối tượng nghiên cứu 12 2.4 Vật liệu nghiên cứu 12 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 12 2.4.2 Hóa chất thuốc thử 14 2.5 Các môi trường sử dụng 14 2.5.1 Môi trường Nutrient Agar 14 2.5.2 Môi trường BHI lỏng 15 2.5.3 Phân lập vi khuấn gây bệnh thối mềm nha dam 15 2.5.4 Tăng sinh môi trường BHI lỏng 16 2.5.5 Tách chiết DNA 16 2.5.6 Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) 16 2.5.7 Điện di 18 2.5.8 Phân tích trình tự gen 18 2.5.9 Phương pháp nhuộm Gram tế bào vi khuấn 18 2.5.10 Phương pháp gây bệnh nhân tạo 19 2.5.11 Thí nghiệm chậu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Đặc điếm hình thái tác nhân gây bệnh thối mềm nha dam 21 3.1.1 Triệu chứng bệnh 21 3.1.2 Ket phân lập mẫu 22 3.1.3 Ket nuôi tăng sinh 23 3.1.4 Ket nhuộm Gram 24 3.2 Khắng định tác nhân gây bệnh thông qua lây nhiễm nhân tạo 24 3.3 Đặc điếm phân tử vùng nhận dạng vi khuẩn 16S rRNA 26 3.3.1 Kết điện di sản phẩm PCR 26 iii 3.3.2 Giải trình tự sản phẩm PCR 28 3.3.3 Kết BLAST trình tự 28 3.3.4 Ket xây dựng phát sinh loài 29 3.4 Đặc tính xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha đam 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 38 IV TÓM TẤT Nha đam loại trồng có giá trị sử dụng cao, đáp ứng nhu cầu thiết yếu người nhiều lĩnh vực Tuy nhiên tình trạng bệnh hại nha đam bùng phát, gây hậu nghiêm trọng vấn đề cần quan tâm Đe tài “Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, lan truyền vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha đam Ninh Thuận” thực từ tháng 02/2019 đến tháng 8/2019, phòng Sinh học Phân tử Thực vật khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyền Tất Thành với mục tiêu xác định đặc điểm hình thái phân tử tác nhân gây bệnh; đặc tính xâm nhiễm, lây truyền tác nhân Đe tài có bốn nội dung: Xác định đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh thối mềm nha dam; Xác định tác nhân gây bệnh thông qua lây nhiễm nhân tạo; Đặc điểm phân tử vùng nhận dạng vi khuẩn 16S rRNA; Nghiên cứu đặc tính xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha dam Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Phân lập làm vi khuẩn môi trường Nutrient Agar với đặc điểm hình thái khuẩn lạc đồng nhất, vi khuẩn bắt màu hồng đặc trưng vi khuẩn Gram âm, hình que, khơng di động Xác định đặc diem phân tử vùng nhận dạng vi khuan 16S rRNA Enterobacter cloacae nhóm với chủng vi khuẩn Enterobacter sp phân lập từ nhiều nước giới chia sẻ mức độ tương đồng trình tự nucleotide cao với chủng vi khuẩn phân lập Án Độ (accesion numbers: KY492312), từ dự đốn có chung nguồn gốc Xác định khả xâm nhiễm vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với vết thương nha dam V SUMMARY Aloe vera is a high value crop and can be used in many fields of human life However, there are many diseases that affect to the quantity and quanlity of the Aloe vera need to take the advance in control The topic "Identification of the morphology, molecular and infection of bacteria causes soft rot on aloe vera in Ninh Thuan province" was established from 02 - 08/2019 The experiments were performed at the Plant Molecular Biology of the Department Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University with the goals are as follow: Identification of the morphology, molecular biology, and the infectivity of the bacteria causes soft rot on aloe vera The topic contains contents as follow: Identification of the morphology, molecular analysis of the 16S rRNA sequence, and infectivity of the aloe vera soft rot bacteria Results achieved after months of research: The aloe vera soft rot bacteria was isolated by using Nutrient Agar The bacteria with uniform colony, pink - catching, gram - negative, rod - shaped, and non - mobile 16S rRNA indicated that the bacteria closely related to Enterobacter cloacae of the Enterobacter sp group and clusterd into the group with strains isolated from many countries in the world and shared the highest similarity nucleotide sequence with the strain isolated in India (accesion number: KY492312), suggesting common acestor of these strains The bacteria directly infect onto the hurt aloe leaf in in - vivo vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH • Hình 3.1 Triệu chứng bệnh thối mềm nha đam 22 Hình 3.2 Phân lập vi khuẩn từ mầu bệnh thu Ninh Thuận 23 Hình 3.3 Ni tăng sinh vi khuẩn mơi truờng BHI lỏng 23 Hình 3.4 Hình thái vi khuẩn kính hiển vi (100X) 24 Hình 3.5 Lá nha đam nhiễm bệnh sau tiêm dịch vi khuấn 25 Hình 3.6 Phân lập lại mầu lây nhiễm nhân tạo 26 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 27F/1492R 26 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi Hsp60 EXPCC 28 Hình 3.9 Ket BLAST trình tự vi khuan Enterobacter cloacae 29 Hình 3.10 Cây phát sinh loài chủng vi khuẩn Enterobacter cloacae 31 Hình 3.11 Cây lây nhiễm theo nghiệm thức 34 vii ... văn: Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, lan truyền vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha đam Ninh Thuận Mục tiêu - Xác định đặc điểm hình thái phân tử vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha đam. .. tình trạng bệnh hại nha đam bùng phát, gây hậu nghiêm trọng vấn đề cần quan tâm Đe tài ? ?Đặc điểm hình thái, phân tử đặc tính xâm nhiễm, lan truyền vi khuẩn gây bệnh thối mềm nha đam Ninh Thuận”... Ninh Thuận - Xác định đặc tính xâm nhiễm, lây truyền vi khuấn gây bệnh thối mềm nha đam thu thập tỉnh Ninh Thuận Nội dung: - Xác định đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh thối mềm nha đam - Phân