NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CÀ PHÊ VỐI (Coffea canephora) CHỌN LỌC THÔNG QUA MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH PHÔI SOMA Nguyễn Thị Mai 1 , Vương Phấn 1 , Trương Văn Tân 1 , Trần Thị Hoàng Anh 1 SUMMARY Study on in vitro propagation of some selected Coffea canephora clones via callus and somatic embryogenesis The research was carried out to establish a protocol of micropropagation via callus and somatic embryogenesis from cultured leaf of some selected Coffea canephora clones in WASI. The results showed that 1g embryogenic callus could produce about 80g torpedo embryos within 4-5 months. After about 5 months of germination phase, from 1g torpedo embryos we could select 160 plantlets, size ~10 mm, with one pair of true leaves and root for acclimatization in commercial coconut fibres under a greenhouse. After 2-3 months of acclimatization, there were about 140 plantlets developed at least two pairs of true leaves available for transplanting into PE bags and taken the same care as the seedlings. Keywords: Coffea canephor, in vitro propagation, callus, somatic embryogenesis 1. ĐặT VấN Đề Phng phỏp truyn thng nhõn ging cõy c phờ vi l dựng ht. Bờn cnh ú phng phỏp ghộp ni ngn cng c ng dng rng rói ti cỏc vựng thõm canh c phờ. Mc dự Vin Khoa hc K thut Nụng Lõm nghip (KHKT NLN) Tõy Nguyờn ó thit lp mt s vn nhõn chi cõy ging cao sn nhng khụng ỏp ng lng cõy ging tt. Vic nuụi cy mụ cỏc loi c phờ trờn th gii ó t c nhng tin b ỏng k. Quỏ trỡnh phỏt sinh phụi vụ tớnh cõy c phờ vi Coffea canephora c Staritsky bỏo cỏo ln u tiờn vo nm 1970; Sondahl v Sharp, 1977 cng to c cõy c phờ chố Coffea arabica t phụi vụ tớnh. Tip theo ú nhm mc ớch nhõn ging c phờ, nhiu tỏc gi ó nghiờn cu s phỏt sinh phụi vụ tớnh cõy c phờ nh Staristky v Van Hasselt (1980); Pierson v cng tỏc viờn (1983); Zamarripa v cng tỏc viờn (1991); Hatanaka v cng tỏc viờn (1991); Van Boxtel v Berthouly (1996), Ducos v cng tỏc viờn (1999, 2003) Cỏc cụng trỡnh nghiờn cu ny cho thy cú 3 tin trỡnh chớnh trong nhõn nhanh cõy c phờ bng phng phỏp phỏt sinh phụi vụ tớnh, ú l: Nhõn t bo cú tim nng phỏt sinh phụi v sn xut phụi (giai on thy lụi) trong mụi trng lng; giỳp phụi ny mm bng cỏch lm ngp tm thi phụi (giai on cú lỏ mm) trong mụi trng lng; to iu kin cho phụi ny mm phỏt trin thnh cõy con. Vỡ vy, vic ng dng cỏc tin b trờn v k thut nhõn in vitro bng phng phỏp nuụi cy phụi soma cho cỏc dũng vụ tớnh c phờ vi u tỳ ó c tuyn chn l iu vụ cựng cn thit ỏp ng nhu cu cp bỏch v ging tt hin nay ca sn xut. II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Vt liu nghiờn cu 4 dũng vụ tớnh c phờ vi (TR10, TR11, TR12, TR13) cú nng sut cao, c ht ln v kh nng khỏng bnh g st cao. 2. Phng phỏp nghiờn cu - Vo mu, to callus t lỏ c phờ: Trc khi ly mu lỏ, phun thuc nm trờn lỏ, ngy mt ln, trong 3 - 4 ngy. Hỏi lỏ bỏnh t, ra sch, x lý thuc nm v nhỳng vo dung dch Ethanol 70% trong 30 giõy. Kh trựng bng Hypochlorite Calci 10% trong 15 phỳt, ra li bng nc ct kh trựng. Sau ú b gõn lỏ, rỡa lỏ, 2 phn u, uụi lỏ v ct lỏ thnh mnh nh (mi mnh l mt mu cú kớch thc khong 1cm 2 ). Cy mu lờn mụi trng thch phỏt sinh callus, trong ti. - hõn callus trong mụi trng lng: Chuyn callus ó chn lc sang mụi trng lng nhõn callus, lc trũn (110 - 120 vũng/phỳt). Sau 2 tun, thay mi mụi trng v tng th tớch mụi trng t 10 ml lờn 50 ml, 100 ml/bỡnh tam giỏc. Quỏ trỡnh lp li cho n tun th 8, cỏc callus tng v s lng c s dng lm ngun vt liu cho quỏ trỡnh sn xut phụi. 1 Vin Khoa hc K thut Nụng Lõm nghip Tõy Nguyờn. - Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng: Callus được chuyển sang môi trường lỏng sản xuất phôi, lắc tròn. Thay mới môi trường, cho đến khi phôi phát triển chủ yếu dưới dạng thủy lôi. - Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh: Trên môi trường thạch tái sinh cây, phôi vô tính cà phê ở dạng thủy lôi phát triển thành cây con có một cặp lá thật được đưa ra huấn luyện trên bột xơ dừa cho đến khi phát triển thành cây con có ít nhất hai cặp lá thật. Ra ngôi trong bầu đất PE, chế độ chăm sóc giống như đối với cây con trồng bằng hạt. III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 1. Khả năng phát sinh callus trên mẫu lá cà phê. Bảng 1. Tỷ lệ phát sinh callus của 4 dòng vô tính cà phê vối sau 4-8 tháng vào mẫu (%)- (ăm thực hiện: 2009) DVT Môi trường TR10 TR11 TR12 TR13 1. Yasuda, 1985. 0 0 16,0 10,7 2. Yasuda cải tiến bổ sung BA 0 0 0 0 3. Pierson, 1983 0 0 100 0 4. Pierson cải tiến bổ sung BA 0 26,7 0 0 5. Murashige & Skoog, 1962 0 0 0 0 Kết quả cho thấy khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác nhau ở các môi trường thử nghiệm: Dòng TR10 không tạo callus có khả năng phát sinh phôi ở cả 5 môi trường. Tỷ lệ phát sinh callus có khả năng phát triển thành phôi của dòng TR11 trên môi trường Pierson cải tiến sau 4 tháng vào mẫu là 26,7%. Đối với dòng TR12 tỷ lệ này là 100% trên môi trường Pierson sau 5 tháng vào mẫu và 16% trên môi trường Yasuda sau 8 tháng vào mẫu. Đối với dòng TR13 tỷ lệ này là 10,7% trên môi trường Yasuda sau 6 tháng vào mẫu. 2. Nhân callus trong môi trường lỏng Callus có khả năng phát sinh phôi (màu vàng, dạng hạt) được chuyển qua nhân trong môi trường lỏng. Khi sử dụng một lượng callus như nhau đưa vào nuôi cấy, sau 8 tuần trọng lượng callus tăng lên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, bình quân tăng 9,3 -10,6 lần so với trước khi nuôi cấy. Bảng 2. Trọng lượng callus tăng sau nuôi cấy trên máy lắc 2 tháng (g) (ăm thực hiện 2009 - 2010) Dòng vô tính Σ lượng callus trước nuôi cấy (g) Σ lượng callus sau nuôi cấy (g) Tỷ lệ tăng (%) TR11 0,5 4,69 938 TR12 0,5 4,65 930 TR13 0,5 5,28 1056 TB 0,5 ns 3. Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng Trên môi trường thử nghiệm, có 2 dòng TR11 và TR13 phản ứng tốt. Bảng 3. Khối lượng (g) và tỷ lệ (%) phôi dạng thủy lôi sau nuôi cấy (ăm thực hiện 2009 - 2010) Dòng vô tính Σ lượng callus nuôi cấy (g) Σ lượng phôi sau 2-3 tháng (g) Σ lượng phôi dạng thủy lôi (g) Tỷ lệ phôi dạng thủy lôi (%) TR11 2 21,60 17,45 80,8 TR13 2 22,50 19,20 85,3 Đối với dòng vô tính TR11, tổng lượng phôi thu được sau 2 tháng nuôi cấy tăng hơn 10,8 lần, có 80,8% phôi phát triển thành dạng thủy lôi màu trắng. Đối với dòng vô tính TR13, tổng lượng phôi thu được sau 3 tháng nuôi cấy tăng 11,3 lần, tỷ lệ callus phát triển thành phôi dạng thủy lôi chiếm 85,3%. Phôi dạng thủy lôi (kích thước từ 1-2 mm) là nguồn vật liệu cần thiết, thông qua giai đoạn phôi tiền nảy mầm và nảy mầm để tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 4. Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh Các phôi dạng thủy lôi được trải đều trên môi trường thạch tái sinh (1g phôi/đĩa pétri). Sau 3-5 tháng, từ 1g phôi ban đầu phát triển thành 155-160 cây con (kích thước ~ 10 mm, có một cặp lá thật, có rễ) và 500-550 phôi ở các giai đoạn khác nhau (kích thước < 2mm, từ 2-5 mm hoặc từ 5-10mm; chưa có lá mầm hoặc có lá mầm phát triển tốt, có rễ hoặc không có rễ). Chọn cây con có một cặp lá thật, có rễ đưa ra huấn luyện trên giá thể bột xơ dừa. Bảng 4. Tỷ lệ sống (%) và khả năng phát triển của cây con có một cặp lá thật trên giá thể bột xơ dừa - (ăm thực hiện: 2010) Chỉ tiêu Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng Sau 4 tháng Tỷ lệ sống (%) 90 88,3 88,3 88,3 Tỷ lệ cây có ít nhất 2 cặp lá thật (%) - 58,8 100 100 Tỷ lệ sống sau hai tháng của cây con có 1 cặp lá thật trên giá thể bột xơ dừa là 88,3%. Sau 2 tháng đã có 58,8% cây có ít nhất hai cặp lá thật, tỷ lệ này tăng dần và đạt 100% sau 3 tháng. Cây con có ít nhất hai cặp lá thật được cấy trong bầu đất đặt trong vườn ươm và chăm sóc như đối với cây trồng bằng hạt. Như vậy từ 1 g phôi dạng thủy lôi, sau giai đoạn tái sinh và thích nghi trong giá thể bột xơ dừa có khoảng 140 cây con sống sót có ít nhất hai cặp lá thật có thể cấy vào bầu đất. IV. KÕT LUËN Vµ §Ò NGHÞ 1. Kết luận - Khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác nhau trên các môi trường, vì vậy cần phải tìm được môi trường phát sinh callus thích hợp. - Trọng lượng callus sau 2 tháng nhân ở môi trường lỏng tăng từ 9,3 - 10,6 lần. - Tỷ lệ callus chuyển sang phôi dạng thủy lôi từ 80 - 85,3%. - Sau 5 tháng nuôi cấy trên môi trường thạch tái sinh, từ 1 g phôi dạng thủy lôi, tái sinh 155-160 cây con (kích thước ~ 10 mm, có một cặp lá thật, có rễ). Sau giai đoạn thích nghi trong giá thể bột xơ dừa từ 2-3 tháng có khoảng 140 cây con có ít nhất 2 cặp lá thật, cấy vào bầu đất và chăm sóc như với cây trồng bằng hạt. 2. Đề nghị. - Ứng dụng quy trình nhân giống cây cà phê bằng phương pháp tạo phôi soma trong nghiên cứu hoặc sản xuất cây giống ở quy mô nhỏ (vài chục nghìn cây/năm). - Tiếp tục nghiên cứu giai đoạn tái sinh cây từ phôi trong môi trường lỏng (thông qua hệ thống Bioreactor) để giảm công cấy chuyền phôi trong môi trường thạch, góp phần đưa quy trình ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ducos J.P., Gianforcaro M., Florin B., Petiard V., Deshayes A., 1999- A technically and economically attractive way to propagate elite Coffee canephora clones: in vitro somatic embryogenesis. ASIC, 18 e Colloque, Helsinke, 295-300. 2. Hatanaka T., Arakawa O., Yasuda T., Uchida N., Yamaguchi T., 1991- Effect of plant growth reglators on somatic embryogenesis in leaf cultures of Coffea canephora. Plant Cell Reports. 17: 179-182. 3. Pierson E.S., Van Lammeren A.A.M., Schel J.H.N., Staritsky G., 1983- In vitro development of embryoids from punched leaf dishes of Coffea canephora. Protoplasma. 115: 208-216. 4. Sondhal M.R., Sharp W.R., 1977- High frequency induction of somatic embryos in cultured leaf explants of C. arabica L. Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie, 81: 395- 408. 5. Starisky G., 1970- Embryoid formation in callus cultures of coffee. Acta Bot Neerl. 19(4): 509-514. Người phản biện: PGS. TS. Nguyễn Văn Viết . NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CÀ PHÊ VỐI (Coffea canephora) CHỌN LỌC THÔNG QUA MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH PHÔI SOMA Nguyễn Thị. khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác nhau ở các môi trường thử nghiệm: Dòng TR10 không tạo callus có khả năng phát sinh phôi ở