NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TƠNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2021 Tên đề tài: Đánh giá mức độ biểu protein Benchwarmer kiểu dại đột biến E164K tế bào HEK293 Số họp đồng: 2021.01.034 Chù nhiệm đề tài: Nguyễn Hồng Danh Đơn vị cơng tác: Viện kĩ thuật công nghệ cao Nguyền Tất Thành Thời gian thục hiện: 01/2021 - 06/2021 TP Hồ Chỉ Minh, ngày 20 thảng 07 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu ve protein vận chuyển màng Lysosome vai trò cũa protein màng lysosome Gene Bench warmer (BNCH) 11 Đột bien E164K gene Benchwarmer 13 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu NỘI DUNG NGHIÊN cửu 15 1.1 Tách chiết so lượng lớn vector pcDNA3.1 mang gene BNCH BNCH* 15 1.2 Biểu gene BNCH BNCH* tế bào HEK293 15 VẬT LIỆU NGHIÊN cứu 15 2.1 Vector tái tổ hợp 15 2.2 Chủng vi sinh vật tế bào động vật 15 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 16 3.1 Thu nhận số lượng lớn plasmid pcDNA3.1/ BNCH pcDNA 3.1/BNCH* 16 3.2 Chuyển nhiềm plasmid DNA vào tế bào động vật HEK293 16 3.3 Kiểm tra mức độ biếu cùa protein BNCH BNCH* 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ 19 1.1 Kết thu nhận plasmid pcDNA3.1/BNCH pcDNA3.1/BNCH* 19 1.2 Biểu tạm thời DNA plasmid tái tổ họp te bào động vật 20 1.2.1 Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK293 20 1.2.2 Kiểm tra biểu protein BNCH tể bào HEK293 21 THẢO LUẬN 22 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KẾT LUẬN 23 KIÊN NGHỊ 23 PHỤ LỤC 1: DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẢT BNCH Benchwarmer Deoxyribonucleic acid DNA E164K Bien đổi Axit glutamic vị trí 164 thành Lysine LSD Lysosomal storage disease MFS Major Facilitator Superfamily Mammalian target of rapamycin mTOR PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid PHỤ LỤC 2: DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Chức mTORCl 12 Hình Vai trị cùa protein màng SLC38A9 điều hòa hoạt động cùa mTORCl 12 Hình Cấu trúc cùa protein thành viên thuộc nhóm MFS điển hình 14 Hình Vị trí đột biến trình tự axit amin cùa protein BNCH từ số lồi đại diện 15 Hình Cấu tạo hóa học cùa lysine (E) axit glutamic (K) 25 Hình Điện di kết tách plasmid tái tổ hợp gel agarose 0,8% 20 Hình Te bào HEK293 ni mơi trường DMEM có bổ sung FBS 21 Hình Biểu protein BNCH dòng tế bào HEK293 23 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm thực đạt Sản phẩn đăng ký thuyết minh Một báo đãng tạp chí Khoa học Công nghệ Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Một báo đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thịi gian đăng ký: từ ngày 01/2021 đến ngày 06/2021 Thời gian nộp báo cáo: ngày 20/07/2021 MỞ ĐẦU Bộ gene người giải mã gần thập kỉ với số lượng khoảng 30.000 gene (theo Human Genome Project), vần khoảng 1/5 so gene chưa hiếu rõ vai trò sinh học chức phân tử Một phần lớn số gene mã hóa cho protein xuyên màng có mặt màng tế bào màng bào quan đóng vai trò thụ thể protein vận chuyển Những hiểu biết giới hạn protein màng nghiên cứu địi hỏi nhiều cơng cụ phức tạp, kháng thể đặc hiệu, khó tinh protein xác định cấu trúc, khó phát trien mơ hình in vivo in vitro phù hợp đe xác định chất thụ the hay chế cùa trình vận chuyến Vì thế, nhùng nghiên cứu đòi hỏi đầu tư lớn thời gian kinh phí Tuy vậy, giá trị mang lại từ kết nghiên cứu protein màng có ý nghía khoa học ứng dụng lớn y dược Gần 50% loại thuốc sử dụng hướng đến tác động lên protein màng Chính thế, mơ tả chức protein màng vừa thách thức lớn vừa mục tiêu quan trọng không nhà khoa học mà cịn tập đồn dược lớn giới Tại Việt Nam, hướng nghiên cứu tương tự hồn tồn thiếu vắng tính chất sâu nội dung nghiên cứu khó khăn mặt kỳ thuật đà ke Tuy dựa kinh nghiệm từ trưởng nhóm nghiên cứu khoa học sống thuộc Viện Kỳ thuật Cơng nghệ cao Nguyễn Tất Thành có thành công mô tả chức cùa protein màng MFSD2b cơng bố tạp chí khoa học có uy tín Nature (2017), JBC (2020), Nature Comm (2021), nhóm nghiên cứu chúng tơi bắt đầu thực nghiên cứu mô tả chức gene mà hóa cho protein vận chuyển màng người có tên Benchwarmer (BNCHỴ Protein màng BNCH có cấu trúc cùa protein thuộc họ MFS (Major Facilitative Superfamily) phân loại vào nhóm protein vận chuyển chat tan SLC (Solute Carrier) Protein phát có mặt màng lysososome Các đột biến gene BCNH ảnh hưởng đến chức lysosome đường tiêu hủy nội bào từ ảnh hưởng đến sức sống sinh vật chết non, thoái hóa thần kinh rối loạn tập tính sinh dục Mặc dù chế tác động chức phân tử protein vần chưa mơ tả Trong đề tài nghiên cứu trước (KHCN_2020.01.002), bắt đầu nghiên cứu chức BNCH với việc tạo dịng gene mã hóa BNCH người phiên BCNH mang đột biến chức gene E164K (viết tắt BNCH*) vào vector biêu pcDNA3.1 tế bào động vật Mục đích tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nghiên cứu sâu vai trò chức phân tử cùa BNCH tế bào đề cương nghiên cứu tiến hành chuyến nhiễm vector pcDNA3.1/ BNCH kiểu dại pcDNA3.1/ BNCH* thu vào dòng tế bào HEK293 kiểm tra mức độ biểu biến the gene BNCH Mục đích cùa đề tài chứng minh đột bien E164K không ảnh hưởng đến mức độ biếu protein BNCH bên tế bào Từ đó, vector mang BNCH* đóng vai trị đối chứng quan trọng cho trình nghiên cứu tìm hiếu chức protein BNCH tương lai Nhừng khám phá chức phân tử gene người thu hút quan tâm lớn giới Vì kết đạt dề dàng công bố tạp chí khoa học đầu ngành nhận công nhận lớn cồng động khoa học Nhóm chúng tơi hi vọng hướng nghiên cứu tương tự sè phát triến mạnh trường Nguyễn Tất Thành nhằm góp phần vào việc nâng cao lực chất lượng nghiên cứu sở CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu protein vận chuyến màng Trong số khoảng 30.000 gene mã hóa hệ gene người 25% - 30% mã hóa cho protein nằm cấu trúc màng cùa tế bào gồm màng tế bào màng bào quan lysosome, mạng lưới nội chất, màng ty thế, màng nhân túi tiết Trong chiếm số lượng lớn chủ yếu thụ thể gắn protein G đảm nhận nhiệm vụ tương tác với tín hiệu nội ngoại bào protein vận chuyển tham gia điều hòa trao đổi chất giừa tế bào bào quan với môi trường xung quanh2 thể nhân thật với tế bào đặc trưng cấu trúc nội bào ngăn chia màng sinh chất cho chức cụ thể Chính mà proten màng vận chuyển đóng vai trị quan trọng hoạt động cùa bào quan tế bào Mất chức proten màng vận chuyển bào quan gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức tế bào toàn thể Một số ví dụ điển hình hội chứng rối loạn chuyến hóa sau sinh (inborn metabolic disorder) dần đến tử vong trẻ nhỏ gây sai hỏng gene mã hóa cho protein vận chuyển lipid màng ty thể Hoặc sai khác protein vận chuyến cholesterol NPC1 protein vận chuyển sialic acid SLC17A5 lysosome đần đến bệnh lý thần kinh nghiệm trọng 5’6 Tầm quan trọng protein màng có the chồ 50% loại thuốc phát triển dựa việc tương tác can thiệp hoạt động cùa protein màng nói trên7 Ngồi nhiều loại thuốc cịn dựa hiêu biết chế hoạt động protein vận chuyển để qua xuyên lớp màng kép lipid, đặc biệt loại thuốc chừa trị rối loạn não cần phải qua lóp màng máu não điều hóa chặt chè Mặc dù phần lớn số 2000 gene người mà hóa cho protein dự đốn protein vận chuyển màng chưa rõ chức phân tử lần vai trò sinh học tế bào the sinh vật Những hiểu biết hạn chế protein màng nói chung protein vận chuyển màng nói riêng đen từ đặc tính liên kết với lóp màng phospholipid kép mà khó đe tinh nghiên cứu cấu trúc cùa protein, kháng cho protein dạng lại đặc hiệu, khó thiết lập thử nghiệm đe nghiên cứu xác định chất protein vận chuyển cách có hiệu Các khám phá chức protein vận chuyển màng đến từ nồ lực nghiên cứu hợp tác nhiều nhóm nghiên cứu cơng ty dược lớn giới Lysosome vai trò protein màng lysosome Lysosome thường biết đến bào quan tiêu hóa tế bào động vật Christian de Duve (Giải Nobel năm 1974) mô tả đặt tên vào năm 1955 Lysosome “túi” có kích thước từ 1-10 um bao bọc màng sinh chất, bên có chứa nhiều enzyme thủy phân phosphatase, lipase, protease, DNase, RNase, glucosidase, collagenase cathepsine giúp tiêu hóa hầu hết đại phân tử carbohydrate, lipid, protein axit nucleic '°, số lượng lysosome lên đến hàng trăm tế bào miền dịch đại thực bào bạch cầu đóng vai trị cơng cụ tiêu hủy mầm bệnh tế bào miễn dịch bắt giữ Sử dụng enzyme thủy phân lysosome giúp tiêu hủy bào quan bị hư hỏng hay chất thải tế bào thơng qua q trình tự thực (autophagy) 10 Các protein màng lysosome (LMP - lysosomal membrane protein) đóng vai trị quan trọng khơng so với enzyme thủy phân bên môi trường nội bào quan Điển hình LMP cấu trúc nên bơm proton (H+) V-type ATPase đảm nhận việc trì pH axit lysosome đảm bảo cho hoạt động enzyme thủy phân Sản phẩm trình thủy phân bên lysosome cấu trúc khung đơn phân đường đơn, axit amin, glycerol axit béo tái sử dụng cho q trình đồng hóa Tuy nhiên hầu hết sản phẩm không tự rời khỏi lysosome mà cần chức vận chuyển LMP Các bất thường hoạt động LMP vận chuyển lysosome gây triệu chứng rối loạn tích trữ lysosome LSD (Lysosomal Storage Disorder) thường ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống cùa the đặc biệt đến hoạt động cùa tế bào thần kinh nơi mà lysosome đóng vai trò tối quan trọng cho hoạt động thụ the dần truyền thần kinh trình tái tạo loại sphingolipid cho màng tế bào thần kinh Một số ví dụ điển hình LSD gây bất thường LMP Niemann-Pick Type c (NPC), bệnh tích trừ axit sialic, bệnh Gaucher Hội chứng Fanconi Lysosome trung tâm đường tín hiệu hiệu điều hóa sinh trưởng Gần đây, lysosome chứng minh trung tâm truyền tín hiệu điều hịa q trình sinh trưởng thơng qua tương tác với hai phức hệ mTORC (mTORCl mTORC2) n Đây phức hệ kinase quan trọng bậc bên tế bào sinh vật nhân chuẩn Chúng trung tâm tiếp nhận đáp ứng lại tín hiệu yếu tố sinh trưởng lượng dường chất Điển tín hiệu sử dụng đường PI3K/Akt dẫn đen hoạt hóa phức hệ từ trực tiếp phosphoryl hóa nhân tố điều hịa quan trọng eukaryotic translation initiation factor epsilon (eIF4E), ribosomal protein S6 kinase (p70S6Kl), TFEB, ULK1/Atgl3, serum and glucocorticoid-induced protein kinase (SGK1) yếu tố thuộc họ protein kinasse c (PKC) (hình 1) Vi thế, mTORCl/2 điều hịa trực tiếp đường đồng hóa sinh tong hợp proten lipid, ức chế trình tự thực chuyển hóa lượng cần thiết cho q trình tăng sinh tế bào thường tế bào ung thư (hình 1) Vai trị lysosome hoạt động mTORCl/2 ý đen sau quan sát thấy tác động nhân tố kích thích sinh trưởng hai phức hệ di chuyển từ trạng thái tự tế bào chất sang bám vào lysosome tương tác định hoạt động mTORCl/2 (hình 1) Tuy vậy, chế tác động lysosome mTORC hiếu rõ nhóm tác giả Superti-Fuga (CEMM, Áo) David Sabatini (MIT, Hoa Kỳ) khám phá LMP SLC38A9 tương tác với mTORCl 12’13 Các nhà khoa học SLC38A9 mang chức vận chuyển arginine leucine từ lysosome tế bào chất, trình vận chuyển axit amin SLC38A9 cần thiết để mTORCl hoạt động (hình 3) Khám phá đưa đến mơ hình điều hịa hoạt động mTORC cần hai yếu tố thông qua lysosome Đe tăng sinh, tế bào phải nhận tín hiệu từ yếu tố kích thích sinh trưởng cộng với điều kiện dưỡng chất phù hợp cho phân bào Yeu tố sinh trưởng thơng qua đường tín hiệu PI3K/Akt làm hoạt hóa mTORCl dần phức hệ đến bề mặt lysosome, đây, mTORCl tương tác với LMP đóng vai trị protein vận chuyển sản phẩm 10 thủy phân từ lysosome tế bào chất 16'17 Chỉ có tín hiệu dường chất phù họp đưa từ lysosome, mTORC tiếp tục hoạt động thực thi bước để hồn tất vai trị đáp ứng với nhân tố kích thích sinh trưởng Chúng ta dự đoán nhiều LMP khác sử dụng nhân tố truyền tín hiệu dường chất khác glucose, axit béo, sphingosine, cholesterol không cho axit amin SLC38A9 mà cho nhiều thành phần khác Tuy nhiên cho đen nay, vần có LMP đóng vai trị nhân tố truyền tín hiệu từ lysosome điều hịa tín hiệu sinh trưởng mô tả inputs] Substrates (Outputs] Ribosomal biogeness Translation initiation CeiluSar Stress Nutr^nts Gwrth Taclors Nucleotide and lipid synthesis Autophagy Lysosomal biogenesis tobc1 Lysosome Hình 1: Chức mTORCI Dưới tác động nhân tố dưỡng chất, yếu tố sinh trưởng stress tế bào (inputs) IĨ1TORC1 di chuyển đến màng lysosome thể hiên chức kinase lên đối tượng địch (substrates), từ điều hòa nhiều hoạt động sống bên tế bào (Ouputs) Hình Vai trị protein màng SLC38A9 điều hòa hoạt động mTORCI Phức hệ mTORCI hoạt hóa nhờ tương tác với SLC38A9 để nhận tín hiệu dưỡng chất axit amin (arginine) từ lysosome vận chuyển bời SLC38A9 Gene Benchwarmer (BNCH) Đối tượng nghiên cứu đề tài gene Benchwarmer (BNCH) lần mô tả vào năm 1996 ruồi giấm {Drosophila melanogaster) *7 Đen nay, BNCH tìm thấy màng endosomal muộn/ lysosome ty thể 18,19 Tuy nhiên, vai trò sinh học chức phân tử BNCH tế bào chưa làm rõ Protein BNCH dài 512 axit amin với kích thước 56 kDa có cấu trúc điển hình họ protein MFS (Major facilitator superfamily) với 12 mien xuyên màng thuộc nhóm protein tham gia vận chuyển chat tan Solute Carrier (SLC)18 Các MFS thường 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ 1.1 Kết thu nhận plasmid pcDNA3.1/ BNCH pcDNA3.1/BNCH* Các dòng khuẩn lạc mang plasmid cần thu nhận đuợc tăng sinh môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin 100 pg/ml 37°c khoảng thời gian từ 12- 14h (qua đêm) tiến hành tách chiết DNA plasmid trình bày Ket tách chiết DNA plasmid kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 0,8% (hình 6) Trên hình ảnh điện di ta thấy dòng plasmid giếng plasmid tương ứng pcDNA3.1/BNCH pcDNA3.1/BNCH* Kích thước lí thuyết cùa vector pcDNA3.1/BNCH pcDNA3.1/BNCH* 6.978 bp phù họp với kết quan sát điện di (1) (2) L 8kb 7kb N 6kb Hình Điện di kết tách plasmid tái tổ hợp gel agarose 0,8% Chú thích: giếng (1) - plasmid PCDNA3.1/ BNCH, giếng (2) - plasmid PCDNA3.1/ BNCH*, L - thang chuẩn 1kb (Bioline) Đe đạt hiệu cao chuyến nhiễm DNA ngoại lai plasmid vào tế bào động vật plasmid phải tinh với nồng độ cao (tính pg) Chúng tơi tiến hành tách chiết plasmid tinh kit GeneJET Plasmid Maxiprep Kit (Thermo Fisher Scientific) Vector tái tổ họp sau kiểm tra chất lượng nồng độ máy đo OD bước sóng 260 280nm Ket trình bày bảng Giá trị tỷ 19 lệ OD260/280 >1,8 cho thấy plasmid tách có độ tinh cao, sẵn sàng sử dụng cho bước chuyển nhiễm vào tế bào động vật Bảng Nồng độ thể tích plasmid thu Plasmid Nồng độ Thể tích Giá trị OD260/280 pcDNA3.1/BNCH 558 ng/ pl ml 2,057 pcDNA3.1/BNCH* 402 ng/ pl ml 1,954 1.2 Biểu tạm thòi DNA plasmid tái tổ họp tế bào động vật 1.2.1 Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK293 Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng cùa đột biến E164K đến biếu protein BNCH, chúng tơi sử dụng dịng tế bào HEK293, sau chuyển nhiễm vector pcDNA3.1/ BNCH pcDNA3.1/ BNCH* Trước tiến hành chuyển nhiễm, tế bào biểu từ trạng thái đông lạnh nuôi phục hồi mơi trường DMEM có bổ sung huyết thanh, điều kiện nuôi tủ ấm 37°c 5% CƠ2 Sau - ngày, tế bào phát triển đạt 70% bề mặt bình ni cấy bắt đầu chia bình ni Các tế bào trì on định cách thay mơi trường ngày/lần Ket tế bào phát triển trở lại sau ngày ni phục hoi (hình 5), điều cho thấy dòng tế bào HEK293 tương đối ổn định khỏe mạnh Dòng tế bào sử dụng cho nghiên cứu chuyển gene biểu protein tái tổ hợp Hình Tế bào HEK293 ni mơi trường DMEM có bồ sung FBS 20 1.2.2 Kiểm tra biểu protein BNCH tế bào HEK293 Khoảng 24 sau chuyển nhiễm, tế bào từ đìa ni thu nhận tiến hành tách chiết protein tổng số Đe kiểm tra kết biếu protein BNCH, tiến hành phương pháp Western blot đế phát kháng thể kháng protein V5 Ket Western blot (hình 8) cho thấy, dịch chiết protein tổng số mầu tế bào mang vector tái tổ hợp pcDNA3.1/ BNCH (kiểu dại) vector pcDNA3.1/ BNCH* (E164K) có xuất băng protein có khối lượng phân tử khoảng 51 kDa mẫu đối chứng âm MOCK (tế bào chuyến nhiễm với vector pcDNA3.1 không mang gene BNCH) không xuất băng protein tương tứng (Hình 8) Theo phần thiết kế vector protein tái tổ hợp bao gồm đoạn protein BNCH (528 aa tương ứng với 50,63 kDa) phần peptide V5 gồm axit amin (YPYDVPDYA) có khối lượng khoảng 1,1 kDa the khơng làm thay đổi nhiều trọng lượng protein BNCH Như vậy, protein tái to họp quan sát kết western blot có trọng lượng phân tử hồn tồn phù họp với tính tốn lý thuyết Kết cho phép chúng tơi khăng định hệ biểu vector pcDNA3.1 có mang trình tự đoạn gene mã hóa cho protein BNCH hoạt động dẫn đen biểu protein bên tế bào HEK293 protein tái tơ họp mà mong muốn Protein tái tổ họp BNCH có gắn protein V5 nên protein tái tổ hợp kháng kháng protein V5 Ket Western blot cho thấy, mức độ biểu protein BNCH mang đột biến không mang đột biến E164K gần tương đương dòng tế bào HEK293 Điều cho thấy, đột biến E164K không ảnh hưởng tới biếu protein BNCH Wild type E164K Mock -55 kDa BNCH - - 35 kDa GAPDH Hình Biểu protein BNCH dịng tế bào HEK293 phân tích phương pháp Western Blot Chú thích: Wild type - tế bào chuyển nhiễm với vector 21 pcDNA3.1/ BNCH; E164K - tế bào chuyển nhiễm với vector pcDNA3.1/ BNCH* (mang đột biến E164K); Mock - tế bào chuyển nhiễm với vector pcDNA3.1 rỗng (empty vector); GAPDH - protein chứng nội THẢO LUẬN Trong nghiên cứu trước, thực việc tạo dòng gene BNCH người mang đột biến E164K không mang đột biến (kiêu dại) vào vector biểu pcDNA3.1 Tiếp theo với nghiên cứu này, thực đánh giá ảnh hưởng đột biến E164K đến biểu protein BNCH tế bào Thí nghiệm cở sở đe xem xét lựa chọn đột biến E164K đối chứng âm cho nghiên cứu chức phân tử cùa protein BNCH kiêu dại Tiêu chí để đánh giá lựa chọn đột biến gene thiết kế thí nghiệm là: thứ nhất, đột biến cần có tác dụng gây chức cùa protein BNCH Thứ hai, protein mang đột biến cần có mức độ biểu vị trí biểu hiện(localization) giống tế bào động vật Điều để đảm bảo kết nghiên cứu so sánh giừa BNCH kiểu dại đột biến E164K thật chức protein BNCH khác biệt protein BNCH E164K biểu hay nhiều kiêu dại, protein E164K có vị trí biểu khơng giống với BNCH kiếu dại nghiên cứu trước, đột biến E164K (E217K ruồi giấm) nghiên cứu đánh giá mơ hình ruồi giấm (Drosophila Melanogaster) cá ngựa van (Danio rerio), ảnh hưởng đột biến đen chức protein BNCH xác nhận 18,21 Tuy nhiên, ảnh hưởng đột biến đến trình biểu định vị protein tế bào chưa xác định, đặc biệt mô hình tế bào người với đột biến E164K chưa nghiên cứu Vì vậy, nghiên cứu này, thực nghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng đột biến E64K đến trình biếu protein BNCH mơ hình tế bào động vật (HEK293) Để kiểm tra ảnh hưởng đột biến, thực biểu protein BNCH dòng tế bào HEK293 hai vector pcDNA3.1/ BNCH pcDNA3.1/BNCH* (mang E164K) Sau đó, mức độ biểu protein kiếm tra phương pháp Western blot Ket cho thấy đột biến E164K không ảnh hưởng đến biếu protein E164K 22 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Chúng biểu thành công protein BNCH kiểu dại thể đột biến E164K dịng tế bào HEK293 nhờ phuơng pháp sử dụng hóa chất tạo liposome Sau đó, chúng tơi tiến hành so sánh biếu protein BNCH mang đột biến E164K so với protein BNCH kiểu dại Kết cho thấy đột biến E164K khơng ảnh huởng đến q trình biểu protein BNCH Các vector pcDNA3.1/ BNCH pcDNA3.1/ BNCH* sè nguồn nguyên liệu để tiếp tục thực nghiên cứu chi tiết chức kênh vận chuyển BNCH, chất phân tử mà protein vận chuyển KIẾN NGHỊ Mặc dù thành công việc biểu hai biến thể kiểu dại đột biến chức protein BNCH tế bào HEK293 Tuy vậy, vần chưa chứng minh đột biến E164K có làm thay đoi vị trí biểu protein BNCH Các phương pháp miễn dịch huỳnh quang với kháng the nhận biết đặc hiệu protein BNCH cần sử dụng đe quan sát vị trí biếu cùa BNCH mức độ tế bào Chỉ đó, biến thể BNCH E164K có the sử dụng đối chứng cho kiểu dại BNCH nghiên cứu tìm hiếu chức phân tử protein BNCH sử dụng mơ hình phương pháp tăng cường biếu gene dòng tế bào nuôi cấy Chũ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Hoàng Danh 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., ưhlén, M & Berglund, L Prediction of the human membrane proteome Proteomics 10, 1141-1149 (2010) Almén, M s., Nordstrom, K J V, Fredriksson, R & Schiõth, H B Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin BMC Biol 7, 50 (2009) Verheijen, F w & Mancini, G M s Lysosomal Transporters and Associated Diseases BT - Lysosomes, in (ed Saftig, p.) 74-81 (Springer US, 2005) doi: 10.1007/0-387-28957-7-7 El-Hattab, A w & Scaglia, F Disorders of carnitine biosynthesis and transport Mol Genet Metab 116, 107-112 (2015) Carstea, E D et al Niemann-Pick Cl Disease Gene: Homology to Mediators of Cholesterol Homeostasis Science (80- ) 277, 228 LP - 231 (1997) Verheijen, F w et al A new gene, encoding an anion transporter, is mutated in sialic acid storage diseases Nat Genet 23, 462-465 (1999) Hauser, A s., Attwood, M M., Rask-Andersen, M., Schiõth, H B & Gloriam, D E Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications Nat Rev Drug Discov 16, 829-842 (2017) Attwood, M M., Jonsson, J., Rask-Andersen, M & Schiõth, H B Soluble ligands as drug targets Nat Rev Drug DỈSCOV 19, 695-710 (2020) Liillmann-Rauch, R History and morphology of the lysosome, in Lysosomes 1-16 (Springer, 2005) 10 Lodish, H et al Molecular cell biology 4th edition Natl Cent Biotechnol Information, Bookshelf (2000) 11 Panic, B et al mTORCl Senses Lysosomal Amino Acids 678-684 (2011) 12 Rebsamen, M et al SLC38A9 is a component of the lysosomal amino acid sensing machinery that controls mTORCl Nature 519, 477-481 (2015) 13 Wyant, G A et al mTORCl Activator SLC38A9 Is Required to Efflux Essential Amino Acids from Lysosomes and Use Protein as a Nutrient Cell 171, 64224 654.el2 (2017) 14 Lawrence, R E & Zoncu, R The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control Nat Cell Biol 21, 133-142 (2019) 15 Lamming, D w & Bar-Peled, L Lysosome: The metabolic signaling hub Traffic 20,27-38 (2019) 16 Masui, K., Cavenee, w K & Mischel, p s MTORC2 in the center of cancer metabolic reprogramming Trends Endocrinol Metab 25, 364-373 (2014) 17 Kania, A Mutations in neuromusculin and benchwarmer affect early nervous system development and neuronal survival Ph.D thesis Baylor College of Medicine, Houston, (1996) 18 Dermaut, B et al Aberrant lysosomal carbohydrate storage accompanies endocytic defects and neurodegeneration in Drosophila benchwarmer J Cell Biol 170, 127— 139 (2005) 19 Yanagisawa, H., Miyashita, T., Nakano, Y & Yamamoto, D HSPIN1, a transmembrane protein interacting with BCL-2/BCL-X L, induces a caspase­ independent autophagic cell death Cell Death Differ 10, 798-807 (2003) 20 Sweeney, s T & Davis, G w Unrestricted synaptic growth in spinster—a late endosomal protein implicated in TGF-p-mediated synaptic growth regulation Neuron 36, 403-416 (2002) 21 Young, R M et al Zebrafish yolk-specific not really started (nrs) gene is a vertebrate homolog of the Drosophila spinster gene and is essential for embryogenesis Dev Dyn an Off Publ Am Assoc Anat 223, 298-305 (2002) 22 Hebbar, s et al Lipid metabolic perturbation is an early-onset phenotype in adult spinster mutants: a Drosophila model for lysosomal storage disorders Mol Biol Cell 28, 3728-3740 (2017) 23 Guri, Y et al mTORC2 Promotes Tumorigenesis via Lipid Synthesis Cancer Cell 32, 807-823.el2 (2017) 24 Perland, E., Bagchi, s., Klaesson, A & Fredriksson, R Characteristics of 29 novel atypical solute carriers of major facilitator superfamily type: evolutionary conservation, predicted structure and neuronal co-expression Open Biol 7, 170142 (2019) 25 25 Yang, J et al The I-TASSER Suite: protein structure and function prediction Nat Methods 12, 7-8 (2015) 26 Sasaki, T et al Autolysosome biogenesis and developmental senescence are regulated by both Spnsl and v-ATPase Autophagy 13, 386^403 (2017) 27 Rong, Y et al Spinster is required for autophagic lysosome reformation and mTOR reactivation following starvation Proc Natl Acad Sci 108, 7826 LP 7831 (2011) 26 PHỤ LỤC 1: MINH CHỨNG ĐI KÈM SẢN PHÀM DẠNG 3: Bài báo gửi đăng tạp chí khoa học cơng nghệ trường Đại học Nguyễn Tất Thành Gmail - Gửi lạp chí Khoa học cơng nghệ - Đại học Nguyẻn Tất Thành 8/1/2021 Gmail Danh Nguyễn Gửi tạp chí Khoa học cơng nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành thư Danh Nguyễn Tới: "Tạp chi, KHCN" 23:03 tháng 8, 2021 Kính gửi Ban biên tập Tạp chi, Tôi tên Nguyễn Hoàng Danh, nhân viên nghiên cứu thuộc Viện kĩ thuặt Công nghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Tôi xin gửi bàn thảo báo "Đánh giá mức độ biểu protein màng Benchwarmer kiểu dại đột biến E164K chuyển nhiễm tế bào nuỏi cấy” Rất mong nhận phàn hồi từ Ban biên tập Trân trọng! Nguyễn Hồng Danh Viện Kĩ Thuật Cơng Nghệ Cao Trường Đại học Nguyẻn Tát Thành Tạp chí, KHCN Tot danhhoang1804@gmail.com Ban Biên tập tap chí Khoa học cóng nghệ õâ nhận đươc thơng tin Trân trọng cám ơn BBT TẠP CHÍ KHOA HỌC rà CÕNG NGHẸ Journal of Science and Technology 300A Nguyễn Tát Thành, P13, Q4, TPHCM - (lầu P.407) Đt: 028.3941.5056 (Ext: 185) - Fax 028.3940.4759 Hình phụ lục Minh chứng gửi tạp chí tạp chí khoa học công nghệ trường Đại học Nguyễn Tất Thành 27 Đánh giá mức độ biểu cùa protein màng Benchwarmer kiểu dại đột biến E164K chuyển nhiễm tế bào ni cấy Nguyễn Hồng Danh1, Đinh Hãi Ngân1, Vũ Minh Thiết1,2* Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT, Đại học Nguyễn Tất Thành Khoa Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nguyền Tất Thành * vmthiet@ntt.edu.vn Tóm tẳt Gene Benchwarmer (BNCH} mã hóa protein chứa 12 miền xuyên màng, thuộc họ protein vận chuyền Major Facilitator Superfamily (MFS) Protein BNCH phát Ờ lysosome vi mang chức vận chuyển màng bào quan Các đột biến gene BNCH gây nhiều kiểu hình bất lợi thối hóa thần kinh, tích tụ chất lysosome, vịng đời sinh vật ngan lão hóa sớm nhiều sinh vật mơ hình khác Mặc dù vậy, chức phân tữ cùa protein BNCH bên tế bào chưa mơ tâ Với mục tiêu tạo mơ hình tế bào tăng cường biểu BNCH sứ dụng cho nghiên cứu chức phân tứ cùa protein, tạo dịng trình tự mã hóa BNCH kiếu dại biến BNCH mang đột biến arginine vị trí 164 thành lysine (E164K) vector pcDNA3.1 biếu chúng tế bào HEK293 Trong BNCH mang đột biến chức E164K cần chứng minh có mức độ biểu tương tự BNCH kiếu dại đế sử dụng làm đoi chứng âm phủ hợp tìm hiếu chức BNCH nghiên cứu này, vector pcDNA3.1 tái tổ hợp chuyến nhiễm vào tế bào HEK293 nhờ phương pháp lipoplexes Mức độ biếu cũa protein BNCH WT BNCH E164K đánh giá thông qua phương pháp lai miền dịch với kháng thể đặc hiệu Từ khóa Benchwarmer, đột bien E164K, protein vận chuyển màng, biếu tạm thời Giới thiệu Protein màng lysosome (lysosomal membrane protein, LMP) đóng vai trị quan trọng nhiều hoạt động chức cũa lysosome từ ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống cùa tể bào Mất chức LMP nguyên nhân dần đen nhiều bệnh lý nghiêm trọng gan khơng có cách chữa người [1] Lysosome bào quan tiêu hóa nội bào nhờ chứa enzyme thủy phân cho hầu hết phân tứ sinh học te bào Tuy nhiên, hoạt động lysosome định bời nhiều LMP bơm proton v-type ATPase đế tri pH axit LMP vận chuyến giúp đưa sán phấm thủy phân khỏi lysosome phục vụ cho trình tái sử dụng [2] Lysosome gần cịn mơ tả trung tâm phát tín hiệu điều hịa đường biến dưỡng tế bào đe đáp ứng với nhân tố kích thích sinh trưởng Chức truyền tín hiệu cùa lysosome thực thơng qua LMP vận chuyển đế tương tác điều khiến hoạt động cũa hai phức hệ điều hòa trung tâm mTORCl mTORC2 [3] Ờ đây, LMP vận chuyến đưa thông tin ve thành phần lượng dường chất sán phấm thủy phân lysosome đế càm ứng cho hoạt động cũa phức hệ mTORCl/2 [4, 5], Mặc dù vậy, phần lớn LMP chưa xác định mô tà chức phân tử Gene Benchwarmer (BNCH) mã hóa cho protein tên BNCH cỏ cấu trúc cùa protein xuyên màng thuộc họ Major Facilitator Superfamily (MFS) Các nghiên cứu phát protein có mặt lysosome nhận định LMP mang chức vận chuyển tiềm [5, 6] Các nghiên cứu cho thấy đột bien gene BNCH ành hưởng đến vai trò lysosome điều hịa hoạt động q trình tự thực (autophagy) [7, 8], Ớ mơ hình động vật, đột biến gene BNCH ânh hường lớn đến phát triển hệ thần kinh, hành vi tính dục, phát triền phôi sức sống cùa sinh vật [9-13] Tuy nhiên cho đen chức phân tữ cùa BNCH vần chưa mô tà cụ 28 bước đầu tim hiểu chức BNCH, tiến hành tạo dịng gene mã hóa BNCH kiểu dại biến BNCH mang đột biến Glul64Lys (E164K) [14] Đột biến thay the axit glutamic tích điện âm thành lysine tích điện dương có thề gây chức cũa protein BNCH quan sát thông qua khác biệt kiểu hình thể ruồi giấm mang BNCH kiểu dại so với thể mang đột biến BNCH E164K [6, 7] Hai plasmid tái tổ họp tãng cường biểu dòng tế bào động vật protein BNCH E164K sữ dụng làm đối chứng âm cho thừ nghiệm nghiên cứu chức protein BNCH kiếu dại Tuy nhiên, protein mang E164K cần phải chứng minh có mức độ vị trí biểu tương tự với protein BNCH kiếu dại đe đâm bão kết quan sát nghiên cứu chức phân tứ BNCH kiếu dại so với BNCH E164K không phái yếu tố khác biệt mức độ vị trí biến the gây Trong nghiên cứu này, tăng cường biếu hai dòng plasmid te bào HEK293 đánh giá ảnh hường cùa đột biến E164K đen mức độ biểu cúa protein BNCH Vật liệu phương pháp 1.3 Vật liệu Vector tái tố họp, chủng vi sinh vật dòng tế bào Vector pcDNA3.1/ BNCH pcDNA3.1/ BNCH E164K tạo dòng từ nghiên cứu trước [14] Chủng nhân dịng plasmid DNA E coli DH5a Dòng tê bào HEK293 mua từ ATCC lưu trữ phịng thí nghiệm tế bào động vật (Viện Kĩ thuật Công nghệ Cao NTT - Đại học Nguyễn Tất Thành) Hóa chất Mơi trường ni cấy vi khuẩn E coli DH5a LB (peptone 10 g/ L, cao nấm men: g/ L, NaCl: g/ L, pH 7.0) có bổ xung 10 pg/ mL ampicillin Môi trường nuôi tê bào HEK293 Dulbecco Modified Eagle’s medium (GE healthcare), bô sung 10% fetal bovine serum (Gibco), 100 pg/ mL penicillin (Gibco) 100 pg/ mL streptomycin (Gibco) BỘ kit GeneJET Plasmid Maxiprep Kit hóa chat chuyển nhiềm te bào động vật Lipofectamin 2000 mua từ Thermo Fisher Scientific (USA) Hóa chất điện di western blot: màng lai nitrocellulose, TBS (Tris-buffered saline), Tween 20), sữa gay mua từ Sigma Kháng the kháng protein V5 tag (14440-1-AP), kháng the kháng GAPDH (10494-1-AP) kháng thể thứ cấp HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit (SA00001-2) mua từ Proteintech (USA) 1.4 Phương pháp nghiên cứu Thu nhận plasmid pcDNA3.1/ BNCH pcDNA 3.1/ BNCH* Chủng E coli DH5a mang plasmid pcDNA3.1/ BNCH pcDNA 3.1/ BNCH E164K nuôi cấy 10 inL LB (100 mg/ml Amp) nhiệt độ 37°c qua đêm Sau đó, 10 mL ỡ bước trước cấy truyền vào 500 mL môi trường LB-Amp tiếp tục nuôi nhiệt độ 37°c 12-14 Sinh khối te bào vi khuấn thu nhận tách chiết DNA plasmid kit GeneJET Plasmid Maxiprep Kít theo hướng dẫn cùa nhà sản xuất Chuyển nhiễm plasmid DNA vào tế bào động vật HEK293 Plasmid pcDNA3.1 tái tổ hợp tăng cường biếu tạm thời dòng te bào HEK293 qua phương pháp chuyển nhiễm tạo lipoplexes nhờ sản pham Lipofectamin 2000 Quy trình cụ thể bước sau Ngày 0, tế bào HEK293 (0,5 X 106) nuôi qua đêm đĩa nuôi giếng (9.5 cm2) mL môi trường DMEM (bố sung 10% FBS, 100 pg/ mL penicillin, 100 pg/ mL streptomycin) Ngày 1, trước 30 phút chuyển nhiễm, tiến hành thay môi trường Opti-MEM Chuẩn bị mầu chuyển nhiễm: Chuẩn bị ong Eppendorf mL (ký hiệu A B) chứa 250 pL môi trường Opti-MEM, bo sung pg DNA plasmid vào ống A 10 pL lipofectamine 2000 vào ống B để phút nhiệt độ phòng Tiếp theo, hồn hợp A với B trộn vào đế yên 20 phút nhiệt độ phòng Nhỏ giọt dung dịch chứa huyền phù tũa DNA-lipofectamin vào đĩa nuôi tế bào đặt đĩa nuôi trờ lại tú nuôi 37°c Sau - chuyễn nhiềm, tiến hành thay môi trường DMEM tiếp tục nuôi Kiểm tra mức độ biểu protein BNCH BNCH E164K Western Blot 29 Sau 16-24 chuyến nhiễm, tế bào thu nhận ly tâm với tốc độ 10.000 rpm phút 4°c làm tan bàng cách bổ sung đệm RIPA lạnh (10 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, % Trition X-100, mM, có bố sung hỗn hợp ức chế protease) với the tích gấp 20 lần the tích sinh khối té bào Te bào làm tan đệm RIPA 30 phút 4°c với tốc độ lắc 400 rpm Sau đó, cặn te bào loại bô bang ly tâm 12.000 rpm 15 phút phần dịch chứa protein tong so chuyến vào ống Eppendorf 1.5 mL Nồng độ protein đo bang Pierce BCA Protein Assay Kít (Thermo Fisher Scientific) 50 pg protein tong so phân tách gel acrylamide 12 % trước chuyến lên màng lai nitrocellulose phương pháp tham tích bán khô thiết bị Novex™ Semi-Dry Blotter (Thermo Fisher Scientific) Màng lai phù dung dịch TBST (3 % sữa gầy) Màng lai lira lần bàng đệm TBST mồi lần 10 phút sau ũ với kháng thể kháng V5 (độ pha loãng 1:5000) kháng kháng protein GAPDH (độ pha loãng 1:20000) nhiệt độ phòng Sau giờ, màng rữa bang TBST lần (mồi lần 10 phút) trước ũ với kháng thứ cấp, độ pha loãng 1:10000 lần Sau giờ, màng lai rửa lại lần với đệm TBST (mồi lần 10 phút) Cuối cùng, protein đặc hiệu với kháng thể màng lai hiển thị nhờ tác nhân phát quang hóa học (ECL - Thermo Fisher Scientific), kết ghi nhận hệ thống chụp phân tích ánh Model Gbox (Syngene) 3.1 Kêt Thu nhận số lượng lớn plasmid pcDNA3.1/ BNCH pcDNA3.1/ BNCH E164K Đe đạt hiệu cao chuyền nhiễm plasmid DNA vào té bào động vật DNA cần phãi tinh nồng độ cao (tính pg/ pL) [15] Do đó, chúng tơi sữ dụng kit GeneJET Plasmid Maxiprep Kit (Invitrogen, ThermoScientific) đe tách chiet so lượng lớn plasmid từ dòng E coli mang plasmid tái tổ hợp Sàn phấm tách chiết kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Hỉnh ảnh kết quà điện di cho thấy dòng plasmid giếng sản phấm tách chiết tương úng từ chủng E coli mang plasmid pcDNA3.1/BNCH WT pcDNA3.1/BNCH E164K Cả hai plasmid có kích thước 6.978 bp phù hợp với kích thước ảnh điện di Chất lượng nồng độ cũa DNA plasmid kiểm tra máy đo OD bước sóng 260 280 nm Ket quà trình bày bàng Tỳ lệ OD 260/280 > 1,8 cho thấy plasmid thu nhận có độ tinh nồng độ cao, sằn sàng sử dụng cho bước chuyến nhiễm vào tế bào động vật (1) L (2) , Skb - 7kb ' 6kb Hình Điện di kết tách chiết vector tái tổ hợp gel agarose 0,8% Chú thích: giếng (1) - plasmid pcDNA3.1/ BNCH, giếng (2) - plasmid pcDNA3.1/ BNCH E164K, L - thang chuẩn Ikb (Bioline, UK) Bảng Nồng độ tích plasmid thu Plasmid pcDNA3.1/BNCH WT PCDNA3.1/ BNCH E164K Nồng độ 558 ng/ pL 402 ng/ pL Thế tích mL mL Tỷ lệ OD 260/280 2,057 1,954 3.2 Mức độ biểu protein BNCH WT đột bién E164K té bào HEK293 Hai plasmid tái to họp mang trình tự mã hóa cho protein BNCH WT BNCH E164K chuyến nhiễm vào tế bào HEK293K mức độ biểu tạm thời hai protein kiểm tra phương pháp Western blot với kháng 30 thể kháng peptide V5 Trên plasmid tái tổ hợp, trinh tự mã hóa peptide V5 gồm 14 axit amin (GKPIPNPLLGLDST) tương ứng với 1,4 kDa thêm vào đầu c cũa protein BNCH có chiều dài 528 axit amin tương ứng với 50,63 kDa Ket quà Western blot với kháng thể kháng V5 cho thấy mầu tế bào chuyển nhiễm vector pcDNA3.1/ BNCH vector pcDNA3.1/ BNCH E164K xuất băng protein có khối lượng phân tứ khoảng 51 kDa mầu đoi chứng âm MOCK (tế bào chuyển nhiễm với vector pcDNA3.1 không mang gene BNCH) không xuất băng protein tương ứng (hình 2) Như vậy, protein tái tố hợp quan sát kết western blot có trọng lượng phân tử hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết protein BNCH Ket khăng định hệ biếu cùa vector pcDNA3.1 mang trình tự mã hóa protein BNCH hoạt động biếu thành công protein BNCH bên tế bào HEK293 Ket Western blot cho thấy mức độ biếu protein BNCH WT BNCH mang đột bien E164K gần tương đương tăng cường biểu dòng tế bào HEK293 Điều cho thấy, đột bien E164K không ảnh hưởng tới mức độ biếu protein BNCH WT E164K GAPDH Mock KDa ~~— Hình Kết phân tích mức độ biếu protein BNCH kiều dại BNCH E164K dòng tế bào HEK293 bang Western blot WT: tế bào HEK293 chuyến nhiễm với vector pcDNA3.1/ BNCH; E164K - tế bào chuyền nhiễm với vector pcDNA3.1/ BNCH E164K; Mock - tế bào chuyền nhiễm với vector pcDNA3.1; GAPDH - protein chứng nội Các protein màng glycosyl có kích thước lớn tạo thành nhiều băng phía protein BNCH BCNH protein liên kết màng thường glycosyl hóa nhóm nito oxy nhiều axit amin khác từ ảnh hưởng đen khã định vị cùa protein màng kép lipid Mức độ glycosyl hóa dần đen thay đối trọng lượng phân từ protein điện di phân tách Ket Western Blot cho thấy xuất cũa nhiều băng protein khối lượng phân từ lớn thực tế 51 kDa (hình 2, glycosyl hóa) Điều cho thấy cà hai biến the protein BNCH biểu có khà lưu trú cấu trúc màng sinh học bên tế bào HEK293 Thào luận Axit glutamic 164 protein BNCH người vị trí bảo ton cao nhiều sinh vật mô hỉnh khác đột biến axit amin thành lysine (E164K) chứng minh gây kiếu hình bất thường mức độ tế bào thể sinh vật so với BNCH WT Chính vi the, E164K dự đoán đột biến gây chức protein BNCH Từ đó, chúng tơi lựa chọn đột biến để tạo mơ hình tế bào BNCH WT BNCH E164K tăng cường biểu đế tim hiểu chức phân từ cùa protein BNCH Trong nghiên cứu này, plasmid tái tố họp pcDNA3.1 mang trình tự mã hóa protein BNCH WT BNCH E164K biểu thành công tế bào HEK293 phương pháp chuyến nhiễm sử dụng hóa chất tạo lipoplexes Ket cho thấy hai protein có mức độ biếu hồn tồn tương đương Mặc dù chúng tơi chưa chứng minh liệu E164K có làm thay đối vị trí biếu cũa protein BNCH tế bào HEK293 Khi tăng cường biểu protein màng mơ hình te bào, vị trí màng protein đích thường bị sai hóng tác động trinh glycosyl hóa protein xáy mạng lưới nội chất [16] Mức glycosyl hóa tác động đến cấu trúc vị trí cùa protein màng kép lipid Hình ành kết quà Western Blot phân đoạn glycosyl hóa cho thấy lượng BNCH E164K glycosyl hóa có the so với BNCH kiểu dại glycosyl hóa, lượng 31 protein khơng glycosyl hóa lại khơng có nhiều thay đối (hình 2, glycosyl hóa) Điều có dần đến việc BNCH E164K có the có tác động định đến mức độ glycosyl hóa protein BNCH hệ quà cùa thay đoi vị trí biếu cùa BNCH E164K Đe kiểm chứng định lượng suy luận trên, chúng tơi cần nghiên cứu vị trí biểu cùa hai biến protein bàng phương pháp lai miền dịch huỳnh quang nghiên cửu Kêt luận Chúng tơi tạo dịng biểu protein BNCH WT protein BNCH mang đột biến chức E164K tế bào HEK293 Cả hai bien the BNCH có mức biểu glycosyl hóa tương đương Vì the mơ hình tế bào HEK293 tăng cường biểu hai biến thể công cụ thừ nghiệm quan trọng để xác định chức phân tữ BNCH Ngồi ra, cịn mơ hình thêm chức (Gain of Function) thích họp để tim hiểu vai trò sinh học BNCH lysosome te bào Lời cám ơn Nghiên cứu tài trợ Quĩ Phát triển Khoa học Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành, mã số đề tài: 2021.01.034/HĐ-KHCN Nguyền Hoàng Danh tài trợ bới Tập đoàn Vingroup hỗ trợ chương trình học bống đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ nước cúa Quỹ Đối sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VinBigdata), mã số VINIF.2020.ThS.30 Tài liệu tham khâo: [1] M Schwake, B Schroder, and p Saftig, “Lysosomal Membrane Proteins and Their Central Role in Physiology,” Traffic, vol 14, no 7, pp 739-748, 2013, doi: 10.1111 /tra 12056 [2] R Puertollano, “mTOR and lysosome regulation,” FlOOOPrime Rep., vol 6, 2014 [3] B Panic et al., “mTORCl Senses Lysosomal Amino Acids,” no November, pp 678-684, 2011 [4] M Rebsamen et al., “SLC38A9 is a component of the lysosomal amino acid sensing machinery that controls mTORCl,” Nature, vol 519, no 7544, pp 477-481, 2015 [5] G A Wyant et al., “mTORCl Activator SLC38A9 Is Required to Efflux Essential Amino Acids from Lysosomes and Use Protein as a Nutrient,” Cell, vol 171, no 3, pp 642-654.el2, 2017, doi: 10.1016/j.cell.2017.09.046 [6] B Dermaut et al., “Aberrant lysosomal carbohydrate storage accompanies endocytic defects and neurodegeneration in Drosophila benchwarmer,” J Cell Biol., vol 170, no l,pp 127-139, 2005 [7] Y Rong et al., “Spinster is required for autophagic lysosome reformation and mTOR reactivation following starvation,” Proc Natl Acad Set, vol 108, no 19, pp 7826 LP - 7831, May 2011, doi: 10.1073/pnas 1013800108 [8] T Sasaki et al., “Aberrant autolysosomal regulation is linked to the induction of embryonic senescence: differential roles of Beclin and p53 in vertebrate Spnsl deficiency,” PLoS Genet., vol 10, no 6, p el004409, 2014 [9] K Suzuki, N Juni, and D Yamamoto, “Enhanced mate refusal in female Drosophila induced by a mutation in the spinster locus,” Appl Entomol Zool., vol 32, no 1, pp 235-243, 1997 [10] Y Nakano et al., “Mutations in the Novel Membrane Protein Spinster Interfere with Programmed Cell Death and Cause Neural Degeneration inDrosophila melanogaster,” Mol Cell Biol., 2001, doi: 10.1128/mcb.21.11.3775-3788.2001 [11] M Han et al., “C13C4 5/Spinster, an evolutionarily conserved protein that regulates fertility in c elegans through a lysosome-mediated lipid metabolism process,” Protein Cell, vol 4, no 5, pp 364-372, 2013 [12] R M Young et al., “Zebrafish yolk-specific not really started (nrs) gene is a vertebrate homolog of the Drosophila spinster gene and is essential for embryogenesis,” Dev Dyn an off Publ Am Assoc Anat., vol 223, no 2, pp 298-305, 2002 32 [13] s Kishi et al., “The identification of zebrafish mutants showing alterations in senescence-associated biomarkers,’’ PLoS Genet., vol 4, no 8, p el000152, 2008 [14] H N Danh and M V Thiet, “Cloning human Benchwarmer gene (BNCH) harboring E164K in vector pcDNA3.1 by site-directed mutagenesis method,” J Sci Technol - Nguyen Tat Thanh Univ., vol 12, pp 611,2020, [Online] Available: https://vjol.info.vn/index.php/dh-NTT/article/view/58001 [15] J Andréll and c G Tate, “Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies,” Mol Membr Biol., vol 30, no 1, pp 52-63, Feb 2013, doi: 10.3109/09687688.2012.703703 [16] R Grisshammer, “Understanding recombinant expression of membrane proteins,” Curr Opin Biotechnol., vol 17, no 4, pp 337-340, 2006, doi: https://doi.Org/10.1016/j.copbio.2006.06.001 Transient overexpression levels of the wild type and the E164K haboring Benchwarmer protein in HEK293 cell Nguyen Hoang Danh1, Dinh Hai Ngan1, Vu Minh Thiet'A* 'NTT Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University Faculty of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh Univesity * vmthiet@ntt.edu.vn Abstract Human Benchwarmer {BNCIl) encodes a transmembrane helices protein belonging to the Major Facilitator Superfamily Protein BNCH has been recently found in the lysosomal fraction, therefore, the protein has been proposed to function as a transporter in the lysosomal membrane Analysis BNCH gene mutation suggested that the protein is required for the lysosomal function in the regulation of autophagy and autophagic lysosome reformation Several genetic abrogations of BNCH caused neurodegeneration, accumulation of substances in lysosomes, shorter lifespan, and early onset of senescence in fruit flies, zebrafish, and roundworms However, the molecular function of BNCH protein remains to be worked out With the aim to develop a cell assay to characterize the function of the protein, we have cloned the coding sequences of the wild-type BNCH and the BNCH carrying E164K mutation in the mammalian expression vector pcDNA 3.1 and expressed both vectors in the HEK293 cell line The mutant El64 must be proved not to cause any apparent changes in the expression levels of the mutated BNCH thereby it can be used as a proper negative control in the cell assay to assess the molecular ligand of BNCH transport In this study, we used lipoplexes to transfect and transiently express the WT BNCH and E164K BNCH in the HEK293 The protein expression levels of the two isoforms were evaluated by Western blot Keywords Benchwarmer, mutation E164K, lysosomal membrane protein, transient expression 33 ... mang đột biến E164K không mang đột biến (kiêu dại) vào vector biểu pcDNA3.1 Tiếp theo với nghiên cứu này, thực đánh giá ảnh hưởng đột biến E164K đến biểu protein BNCH tế bào Thí nghiệm cở sở đe... thấy, mức độ biểu protein BNCH mang đột biến không mang đột biến E164K gần tương đương dòng tế bào HEK293 Điều cho thấy, đột biến E164K không ảnh hưởng tới biếu protein BNCH Wild type E164K Mock... kiểu dại pcDNA3.1/ BNCH* thu vào dòng tế bào HEK293 kiểm tra mức độ biểu biến the gene BNCH Mục đích cùa đề tài chứng minh đột bien E164K không ảnh hưởng đến mức độ biếu protein BNCH bên tế bào