NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÁP co SỞ NĂM 2020 - 2021 Tên đề tài: PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH HIỆN TRẠNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA MỘT số CHỦNG VI KHUẦN GÂY BỆNH TRÊN CÁ RÒ ĐÒNG Anasbas testudineus Số hợp đồng: 2021.01.110 Chú nhiệm đề tài: TRẦN KIÊN CƯỜNG Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: tháng TP Hồ Chỉ Minh, ngày tháng 10 năm 2021 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG BIẾU vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, so ĐỊ, HÌNH ẢNHTĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu viii MỞĐẢU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tong quan cá rô đong 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điếm hình thái 1.1.3 Đặc điếm sinh thái 1.1.4 Đặc điếm sinh trưởng 1.1.5 Đặc điếm sinh sản 1.1.6 Tình hình khai thác 1.2 Thực trạng kháng kháng sinh nuôi trồng thủy sản 1.2.1 Tình trạng lạm dụng kháng sinh trongngành nuôitrồng thúy sản giới 1.2.2 Hiện trạng lạm dụng kháng sinh nuôitrồng thủy sản Việt Nam CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 2.1 Thu nhận phân lập chủng vi khuẩn từ mầu cá bệnh/có dấu hiệu lạ 2.2 Các phản ứng sinh hóa 2.3 Tách chiết DNA 11 2.4 Giải trình tự 11 2.5 Phương pháp khảo sát loại kháng sinh, nhạy cảm cùa vi khuẩn 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12 3.1 Ket tình trạng nhiềm khuân nội tạng cá bệnh 13 3.2 Ket đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn chiếm ưu phân lập làm 15 3.3 Kết định danh sinh hóa chủng khuẩn phân lập 20 3.4 Kết độ nhạy cảm/tính kháng vi khuẩn với kháng sinh 22 3.5 Ket tỷ lệ khuấn kháng kháng sinh 24 3.6 Kết định danh chủng vi khuấn đa kháng 26 iii CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO .29 PHỤ LỤC 3: MINH CHỬNG ĐI KÈM 33 PHỤ LỤC 4: (thuyết minh đề cương) 44 IV DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSA Trypsin soy agar TSB Trypsin soy broth NA Nutrient agar TCBS Thiosulfate citrate bile salts sucrose BA Blood agar KIA Kliger’s ion agar MHA Mueller Hinton agar MR Methyl red BHIB Brain heart infusion broth CL Cell lysis buffer PBS Phosphate-buffered saline WB1 Washing buffer WB2 Washing buffer EB Elution buffer CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute V DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cá rơ đồng (Anabas testidineus) Hình 2.1 Sơ đồ thực phản ứng sinh hóa 10 Hình 3.1 Hình ảnh ngoại thể cá rơ đồng có dấu hiệu bệnh 14 Hình 3.2 Hình ảnh giải phẫu nội tạng cá rơ đồng bệnh 14 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc phân lập ban đầu mầu bệnh phấm thu nhận từ nội tạng cá rô bệnh 14 VI DANH MỤC BẢNG BIẾU Bảng 3.1 Số chủng vi khuân phân lập từ cá rô đồng bệnh thu nhận từ trang trại cá giống 20 Bảng 3.2 Các khuấn lạc phân lập làm môi trường NA 15-19 Bảng 3.3 Danh sách chủng vi sinh dự kiến từ sinh hóa 24 Bảng 3.4 Tính kháng kháng sinh chủng vi sinh phân lập từ cá rô với 10 loại kháng sinh 26 vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, so ĐỊ, HÌNH ẢNH TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cúu Công việc thực Ket quà đạt Nôi dung 1: Thu mầu phân lập 110 mầu cá có dấu hiệu lạ từ trại STT mầu bệnh phấm cá có dấu hiệu ni, thu nhận 65 khuân lạc bệnh/biểu lạ trang trại cấy đìa mơi trường ni cấy ni TP.HCM Nội dung 2: Quan sát hình thái, Từ 65 khuân lạc ban đầu, cấy làm nhuộm Gram, thực test thuân chọn lọc 14 khuân lạc sinh lý sinh hóa gồm :KIA, blood đặc trưng thực phản ứng ager, MacConkey, oxidase, sinh hóa, định danh dựa vào hình thái catalase, TCBS, Simmon citrate 11 chủng vi sinh Nội dung 3: Xác định tính nhạy 13 chủng vi sinh (trừ chủng XI) cảm với kháng sinh kiểm tra tính kháng kháng sinh, chủng vi khuẩn phân lập chủng vi sinh kháng lạ nhóm beta-lactam, chủng đa kháng mạnh IV (7/10) VIII (6/10) Nội dung 4: Giải trình tự 16S Đã định danh ba chủng vi khuấn rRNA số chủng vi khuấn IV, VIII, XIV có mức độ tưong đồng phân lập so sánh trình tự gen 16S rRNA lẩn lượt là: Pseudomonas aeruginosa %), (99,77 Aeromonas caviae (99,93%) Edwardsiella ictaỉuri (99,44%) STT Sản phâm đạt Sản phẩm đăng ký viii 1 Bài báo nước báo cáo tổng kết để tài Thời gian thực hiện: tháng từ tháng 4/2021-10/2021 Thời gian nộp báo cáo : 10/2021 IX MỞ ĐÀU Cá rô đồng (Anabas testudineus) xem đối tượng ni có giá trị kinh tế cao, phân bố nhiều quốc gia châu Á giới có Việt Nam Việc lạm dụng kháng sinh, hóa chất kháng khuẩn gây nhiều tác động tiêu cực, hệ thực phàm thủy hải sản nguồn chứa vi khuấn/gen kháng kháng sinh có the lây lan từ động vật thủy sản sang người thông qua chuồi thức ăn đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe môi trường Nghiên cứu phân lập mười bốn chủng vi sinh từ mầu cá có dấu hiệu lạ thu thập từ trại ni địa bàn TP.HCM Trong đề tài đà định danh ba chủng vi khuẩn IV, VIII, XIV có mức độ tương đồng so sánh trình tự gen 16S rRNA lân lượt là: Pseudomonas aeruginosa (99,77 %), Aeromonas caviae (99,93%) Edwardsiella ictaluri (99,44%), có hình thái đặc trưng kiểm tra khuẩn lạc môi trường chọn lọc phản ứng sinh hóa Bốn chủng khuẩn định danh kháng lại nhóm beta-lactam, tetracyclin số nhóm kháng sinh khác sử dụng phồ biến ngành nuôi trồng thủy sản, với việc đánh giá hành vi cá nhiễm bệnh gây bời loại bệnh khác nhằm tạo dừ liệu tham khảo bệnh tích dùng cho việc chan đốn sớm tác nhân gây hại Ket chủng khuẩn cá rô đồng lưu hành trại nuôi số địa điểm bán khu vực TP.HCM trạng kháng kháng sinh chúng, hướng giải pháp tìm nguồn thay kháng sinh hợp chất thiên nhiên để khắc phục tình trạng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh cá rô đồng Mục tiêu: - Thu nhận phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh cá rô đồng (Anabas testudineus') số trại nuôi khu vực TP.HCM - Đánh giá mức độ đa kháng kháng sinh chủng khuẩn phân lập - Khuẩn lạc tròn Be mặt trơn bóng khơng phẳ.n.% , - Màu săc suôt đông đêu - Khuẩn lạc hình trịn Be mặt trơn bóng lồi XIII - Màu sắc suốt, vàng sậm Khuẩn lạc làm môi trường đổi màu vàng nhạt XIV Khuẩn lạc trịn Be mặt nhám, khơng lồi lõm Màu sắc đục đồng 19 3.3 Ket định danh sinh hóa chủng khuẩn phân lập 14 chủng vi khuấn sau phân lập từ cá bệnh tiến hành sàng lọc ba môi trường chọn lọc MacConkey, thạch máu, TCBS Loại bỏ mẫu XI (do khuẩn lạc không mọc/xuất TSA) mầu (X XII) chưa xác định tên chủng khuẩn lạc mọc yếu nên sè bị loại bỏ nghiên cứu Từ đó, số nhận định ban đầu đưa ra: 11 vi khuấn phân lập dự đoán thuộc chi Yersinia spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., E.coli (Bảng 3.3) Các kết định danh so dựa đặc điểm hình thái sinh hóa có trùng khớp với số nghiên cứu trước vi sinh vật loài thủy sản nước cá rô đồng A testudineus Tuy nhiên, từ trước đến nay, công bố Việt Nam chưa tập trung khảo sát đánh giá bệnh nhiễm khuẩn gây bệnh gây chết cá rô đồng A testudineus Như vậy, việc đánh giá tình trạng nhiễm khuấn nội quan phân lập chủng vi khuấn từ cá rô đồng bệnh địa bàn TP.HCM sè cung cấp thơng tin bản, xác ban đầu cho nghiên cứu bệnh học thủy sản cá nước Các chủng vi khuẩn phân lập được phát nghiên cứu trước Các yếu tố nêu sè gây cân hệ vi sinh vật thể vật chủ tạo điều kiện cho hại khuấn bùng phát Hệ vi khuẩn gây bệnh cá/động vật thủy sản đa dạng phức tạp, phồ biến Streptococcus agalactiae, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecalis (Gram dương), Aeromonas hydrophila Yersinia ruckeri (Gram âm) (Waczak cs, 2017) Trong đó, chi Aeromonas biết đến với 31 lồi, chun gây bệnh xuất huyết, lở loét hầu hết loài động vật thủy sản, đặc biệt cá da trơn (Từ Thanh Dung, 2010) Ngồi ra, Begum nhóm nghiên cứu (2013) từ 257 mầu vi khuấn phân lập từ quan cá rô bệnh, nước bùn hồ nuôi xác định: Pseudomonas spp (21,40%), Aeromonas spp (33,46%), Vibrio spp (14,78%), Salmonella spp (21,40%) E coli (8,94%) Việc xác định chủng vi khuân thuộc Pseudomonas spp, Shigella spp, Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp E.coli nghiên cứu cho thấy trạng nhiễm bệnh cá rô số khu vực TP.HCM, đồng thời chủng vi khuấn có nguy lây nhiễm sang người sử dụng cá bị bệnh làm thực phẩm 20 Bảng 3.3 Danh sách chùng vi sinh vật dự kiến tử phàn ứng sinh hóa bàn Mơi trường chọn lọc Phân úng sinh hóa KIA STT TCBS Macconkey TSA (sau 24 giờ) (sau 48giử) Nhuộm Gram Blood agar Catalase Simmon citrate Tên dự kiến Reactions Red:Aik Gas ILS Oxidase Yellow: Acid I - Khuẩn lạc nhò Mọc - - ĩ 4- - Aik-Acid - - - Yersinia spp II - Khuẩn lạc nhò, màu vàng nhạt, tâm màu đen 4- - p + 4- Aik-Acid - - + Vibrio spp III - Khuẩn lạc lớn, khơng trịn viền trắng nhạt đục dần - - ĩ 4- 4- Aik-Acid - 4- - Samonella spp IV - Khuẩn lạc nhỏ vừa viền đục dần - - p + 4- Alk-Alk - - + Pseudomonas spp V - Khuẩn lạc nhò, màu trắng sữa - - p 4- 4- Aik-Acid 4- 4- - Edwardsiella spp VI Khuẩn mọc yếu Khuẩn lạc trịn, trơn, có màu vàng nhạt - 4* a 4- - Aik-Acid - - - Staphylococcus spp - - ỵ 4- 4- Acid-Acid 4-4- - - Klebsiella E.coli - p 4- - Aik-Acid - - 4- Aeromonas spp 4-4- - - Enterobacter spp Khuẩn lạc lớn, tròn đều, viền nhân trang ngà spp/ VII 4- VIII - Khuẩn lạc to vừa tròn đều, trắng đục 4- IX - Khuẩn lạc lớn, tròn viền trong, nhân trắng đục - - ĩ 4- 4- Acid-Acid XIII Khuấn mọc yếu Khuẩn lạc nhò, tròn, lồi màu vàng chanh - 4- a 4- - Aik-Acid - - - Staphylococcus spp XIV - Khuẩn lạc to, tròn đểu, viền trong, nhân trang đục - - p 4- 4- Aik-Acid 4- 4- - Edwardsiella spp vàng 21 3.4 Kết độ nhạy cảm/tính kháng khuẩn với kháng sinh Đường kính vùng ức chế tính mm so sánh với giá trị dựa theo tiêu chuẩn CLSI công bố (2011) để nhận định tính nhạy cảm (S), nhạy trung bình (I) hay kháng (R) (Bảng 3.4) Trong nghiên cứu này, 10 loại kháng sinh chọn đề thực kháng sinh đồ với 13 chủng vi khuân chọn lọc được, gồm Am, Ax, cp, Ci, Of, Te, Dx, Cl, CL, Er (Mekophar, Việt Nam) Sau đó, đìa thạch ủ 24 37°c ghi nhận kháng theo CLSI (2012) Môi trường sử dụng làm thử nghiệm kháng sinh đồ mơi trường thạch đĩa TSA/MHA có độ dày mm (Bauer, 1966) Chủng vi khuẩn thử nghiệm làm giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy sau 18-24 giờ) nên từ môi trường khơng có chất chọn lọc cấy thạch thường, thạch máu So sánh độ đục huyền dịch vi khuân với độ đục ống McFarland 0,5 hiệu chỉnh nồng độ vi khuấn tương đương McFarland 0,5 Sau 24 - 48 giờ, bề mặt đĩa thạch xuất vịng trịn khơng có vi khuẩn phát triển (vịng vơ khuẩn) Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) đo dựa theo tiêu chuẩn CLSI, 2011, để nhận định tính nhạy cảm (susceptible, S), nhạy trung bình (intermediate, I) hay kháng (resistant, R) 22 Bảng 3.4 Tính kháng kháng sinh chủng phân lập từ cá rô với 10 loại kháng sinh: Am - Ampicillin; Ax Amoxicillin; cp - Cefalexin; Ci - Ciprofloxacin; Of - Oxfloxacin; Te - Tetracilin; Dx - Doxycyclin; Cl - Clindamycin; CL Chloramphenicol; Er - Erythromycin \Kháng sinh Chúng Nhóm Quinolone Nhóm Beta- lactam Nhóm Tetracyclin Nhóm Lincosamide Nhóm Phenicol Nhóm Macrolide Am (10 ng) Ax (20 Mg) Cp (30 pg) Ci (5 pg) Of (5 pg) Te (30 pg) Dx (30 pg) Cl (2 pg) CL (30 pg) Er (15 pg) I 40 32 48 22 20 36 48 _** 35 20* II _** _** 9** 23 18 20 17 10** 17* 19* III _** _** 22* 28 24 23 20 9** 32 22 IV _** _** _** 33 20 11* 12** _** 8** 8** V 20** 7** 30 29 20 32 26 14** 34 20* VI _** _** _** 35 25 20 17 _** 7** _** VII 13** 10** 14** 19* 15* _** _** 20 7** VIII _** _** 11** 22 21 10** 12** _** 25 20* IX 10** _♦* 22* 28 20 27 24 11 ** 22 18* XIII _** _** 6* 25 26 10** 20 19* 15* 8** XIV _ ** _** 20* 27 23 24 20 9** 31 18* khơng xt vịng kháng khn ‘**’ kháng kháng sinh; kháng trung gian 23 3.5 Ket tỷ lệ khuẩn kháng kháng sinh Việc lạm dụng kháng sinh, hóa chất kháng khuẩn gây nhiều tác động tiêu cực, ức chế miễn dịch, kìm hãm tăng trưởng tích lũy thuốc thể cá loài động vật thủy sản (FAO, 2003; Harikrishnan cs., 2011) Hệ quả, thực phẩm thủy hải sản nguồn chứa vi khuẩn/gen kháng kháng sinh lây lan từ động vật thủy sản sang người thông qua chuồi thức ăn Các vi khuẩn gây bệnh chuyển trực tiếp gián tiếp gen kháng kháng sinh sang vi khuân gây bệnh người, dần đến thất bại liên tiếp phương pháp trị liệu truyền thống việc giảm hiệu điều trị (Miranda cs., 2001; Radu cs., 2003), đe dọa nghiêm trọng sức khỏe người môi trường (Abutbul cs., 2004; Cabello, 2006) Trong q trình ni thâm canh, thuốc kháng sinh hóa chất phối trộn vào thức ăn cho cá Qua thời gian, lượng lớn chất kháng sinh tích tụ từ hóa chất, thức ăn cơng nghiệp dư thừa, phân cá lắng đọng xuống đáy ao nuôi bị rửa trôi lan khu vực lân cận (Lê Xuân Sinh, 2009; Boxall cs., 2004; Sorum, 2006) Thực tế, cá/động vật thủy sản môi trường nước ao nuôi nguồn chù yếu chứa vi khuẩn gen kháng kháng sinh (Heuer cs., 2009); điều gây ảnh hưởng nghiệm trọng đến hệ thống nuôi trồng, sản xuất, phá vỡ cân hệ sinh thái tự nhiên, tác động xấu đến sức khóe người (Jang cs., 2017) Trong nghiên cứu này, 13 chủng vi khuẩn tiến hành kiểm tra với 10 kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, quinolone, tetracyline, lincosamide, phenicol, macrolide (Bảng 3), ghi nhận chùng vi khuẩn kháng với kháng sinh thuộc hai nhóm beta-lactam lincosamide Nhóm beta-lactam cho kết chủng vi khuẩn kháng Am (12/13, chiếm 92,3%), Ax (12/13, chiếm 92,3%), Cp (6/13 chiếm 46,15%) Nhóm lincosamide, cụ the với kháng sinh clindamycin có tỷ lệ kháng 11/13 chủng vi khuẩn (chiếm 84,62%) Trong 13 chủng vi khuẩn phân lập được, chủng IV VII kháng với 7/10 kháng sinh khảo sát (70%) Đồng thời, chủng VI VIII kháng với 6/10 kháng sinh (60%) So với nghiên cứu trước cùa Nguyễn Thành Luân cs (năm 2020) tính đa kháng kháng sinh kháng sinh kết cho thấy mức độ đa kháng chủng nghiên cứu dao động khoáng 5-8 kháng sinh tương đồng với nghiên cứu chủng IV (7/10), VI (6/10), VII (6/10), VIII (6/10) Tỉ lệ đa kháng kháng sinh 24 chủng vi khuẩn phân lập cao rơi vào kháng sinh từ lâu bị cấm sử dụng nuôi trồng thủy sản Am, Ci, Of, Te, CL Tuy nhiên nghiên cứu chủng phân lập kháng lại 13/14 chủng C1 3/10 ER, Dx loại kháng sinh lưu hành sử dụng, cho thấy xu hướng kháng kháng sinh chủng vi khuấn ngày gia tăng ngày mở rộng phổ kháng, điều lâu dài có the dần đến tình trạng thất bại phòng trị bệnh thủy sản sau Ket khảo sát tình trạng kháng kháng sinh 13 chủng vi khuấn cho thấy, kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam bị chủng vi khuẩn đề kháng Các kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam từ lâu không sử dụng nuôi thủy sản nhóm bị kháng nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn động vật thủy sản, đặc biệt đề kháng với nhóm beta-lactam nghiêm trọng Hiện tượng gia tăng chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh beta-lactam chứng minh xuất phát từ nguyên nhân sử dụng kháng sinh khơng cách Ba nhóm kháng sinh tetracylin, quinolone, macrolide phổ biến phòng trị bệnh nhiễm khuẩn ni trồng thủy sản Nhóm macrolide, cụ thể với kháng sinh erythromycin ức chế khuẩn, nhiên kìm hãm phát triển vi khuẩn khơng có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn hồn tồn (tải liệu tập huấn khuyến nơng sử dụng kháng sinh) Điều tương ứng với kết thu với chủng bị ức chế, chùng kháng chủng nhạy cảm Nhóm quinolone sử dụng kháng sinh diệt khuẩn mạnh với tỉ lệ diệt khuẩn 12 chủng ức chế chủng tổng số 13 chủng khảo sát Kháng sinh thuộc nhóm quinolone có khả diệt khuấn cao tác động lên cấu trúc vòng xoắn DNA vi khuẩn Nhóm tetracyclin với khả kiềm khuẩn làm ảnh hưởng đen trình tổng hợp protein vi khuẩn Gram âm (-) vi khuẩn Gram dương (+) (tải liệu tập huấn khuyến nông sử dụng kháng sinh) Các chủng IV VIII kháng với nhóm kháng sinh beta-lactam, lincosamid, macrolide, tetracyclin (macrolide tetracyclin thông dụng nuôi trồng thủy sản) Điều cho thấy, mầu cá thu nhận trang trại địa bàn TP.HCM bị nhiễm chủng khuấn đa kháng thuốc với phổ kháng lớn Hai chủng vi khuẩn với mức độ đa kháng nhận định Pseudomonas spp Aeromonas spp., hai chủng vi khuấn thường xuyên gây vấn đề bệnh lý động vật người 25 nhiễm khuấn đường hô hấp dưới, viêm màng đặc biệt nhiễm khuấn máu gây tử vong 3.6 Kết định danh chủng vi khuẩn đa kháng Dựa đặc tính hình thái, sinh hóa, tình trạng kháng kháng sinh cao kháng sinh sử dụng phổ biến thủy sản tetracyclin macrolide chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh quan trọng kháng lại nhiểu loại kháng sinh (6/10) nhận định ban đầu dựa hình thái chủng vi sinh thường gây bệnh cá nước Việt Nam từ nghiên cứu trước định danh phân tử, gom chùng IV, VIII, XIV Ket giải trình tự gen phương pháp Sanger sequencing công cụ BLAST ngân hàng dừ liệu NCBI nhận thấy rằng, chủng IV cho kết định danh Pseudomonas aeruginosa với mức độ tương đồng 99,77%, kết cho thấy nhận định ban đầu xác Chủng VIII có mức độ tương đồng 99,93% với Aeromonas cavỉae, điều có khác biệt so với nhận định ban đầu chùng thuộc họ Vibrio spp mọc khuẩn lạc nuôi cấy môi trường TCBS, môi trường chuyên biệt cho Vibrio spp khác biệt vài công bo trước nhắc đến theo nghiên cứu Wejdan, Abeer, Oruba, Noor (2014), Aeromonas mọc khuấn lạc màu vàng bóng thạch TCBS đơi bị nhầm lẫn với V parahaemolytỉcus môi trường phân lập ban đầu (Bottone & Robin, 1978) Chủng XIV có trình tự tương đồng 99,44% với Edwardsiella ictaluri, với nhận định ban đầu Từ Thanh Dung cs (2010) ra, Aeromonas spp với 31 lồi chun gây bệnh xuất huyết, lở loét hầu hết loài động vật thủy sản, đặc biệt cá da trơn Đáng ý A dhakensis tìm thấy mầu cá bệnh, động vật thủy sản môi trường nước sông, nước ao nước bể cá vùng cận nhiệt nhiệt đới Các công bố giới chủng vi khuẩn gây bệnh cá rô đồng như: Mousumi cs (2019) ghi nhận loài vi khuẩn gây bệnh cá rô A testudineus Thái Lan thuộc Salmonella spp., Shigella spp., Klebshiella spp., Staphylococcus spp sau nuôi môi trường chọn lọc kiểm tra phản ứng sinh hóa Shahdat Hossain cs (2017) sau phân lập mầu vi khuân gây bệnh từ mang, chất nhầy, vây cùa cá rô Bangladesh, xác định chủng Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Flavobacterium, Escherichia, Salmonella spp 26 Vibrio spp Tình trạng lây nhiễm vi khuẩn trại cá nghiên cứu quan trọng hệ thống ao nuôi cá giống, người chù trang trại người tiêu dùng Sự diện mầm bệnh đồng nghĩa với việc bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng cá Bangladesh Ket định danh chủng vi khuấn nghiên cứu cho thấy, chủng lây nhiễm bệnh cá rô đồng A testudineus thu thập trang trại địa bàn TP.HCM đa dạng với nhiều chủng vi khuấn không trùng lắp 27 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thu nhận 65 mẫu cá có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh bong vảy, da lở loét, cụt vây, đuôi, nột tạng sưng sầm màu khu chợ trại cá giống địa bàn khu vực Quận 12, Quận 9, Quận 8, Thủ Đức, cần Giờ TP.HCM Phân lập 14 mầu khuấn lạc khác định danh hình thái 11 lồi số để tiếp tục tiến hành thử nghiệm kháng kháng sinh Kết kháng sinh đồ cho thấy tất chủng khuấn kháng lại nhóm beta-lactam chùng số IV kháng 8/10 loại kháng sinh, chủng so VIII kháng 7/10 loại kháng lại macrolide tetracyclin hai loại kháng sinh đựơc dùng nuôi trồng thủy sản Từ kết định danh phân từ xác định chủng khuẩn cấp thiết nghiên cứu Pseudomonas aeruginosa (99,97%), Aeromonas caviae (99,93%) Edwardsiella tadar (99,94%) Thực trạng kháng kháng sinh vi khuẩn cho thấy mối nguy hại tiềm tàng nguồn thực phẩm thiết yếu sử dụng Từ mối nguy hại nhóm nghiên cứu đề xuất tiếp tục đánh giá ghi nhận chủng khuẩn lại chưa định danh để lập thành sở liệu tham khảo cho vi khuân gây bệnh thủy sản nước nói chung cá rơ đồng nói riêng Cũng đề xuất giải pháp an toàn thân thiện với môi trường điều trị bệnh thủy sản thay dùng kháng sinh chuyến đối thành hợp chất thiên nhiên có tác dụng tương tự kháng sinh đe tránh gây tình trạng kháng thuốc lồi vi khuẩn gây bệnh người Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Mai Đình n, Nguyền Văn Trọng, Nguyễn Văn Thiện, Lê Hồng Yen, Hứa Bạch Loan Định loại cá nước Nam Bộ, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 1992, Trưong Thù Khoa Trần Thị Thu Hưong Định loại cá nước vùng đồng băng Sông Cừu Long, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cân Thơ, 1993 Ngô Trọng Lư Thái Bá Hồ Kỳ thuật nuôi thủy đặc sản nước (tập 2), Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, 2003 Nguyễn Thành Trung Một số đặc điếm sinh học sinh sản kỹ thuật sản xuất giông cá rô đông, Luận văn tôt nghiệp, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang, 1998 Flynn W.T, The Judicious Use of Medically Im- portant Antimicrobial Drugs in FoodProducing Animals Center for Veterinary Medicine (HFV-1), Food and Drug Administration US Department of Health and Human Services, 2012 Cabello, F c Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment Environmental microbiology, 8(7), 1137-1144, 2006 Quesada s.p Paschoal, J.A.R Reyes, F.G.R Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones d a review, J food Sci 78, 2013 Awad E., Awaad A, Role of medicinal plants on growth performance and immune status in fish Fish and Shellfish Immunology, vol 67, pp 40-54, 2017 Crumlish M., Dung T.T., Turnbull J.F., Ngoe N.T.N and Ferguson H.w Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases 25(12):733-736, 2002 10 OIE, Organizac/ao intemacional das epizootias Manual of diagnostic tests for aquatic animals 4th ed France, Paris: Office International des 'Epizzoties Publisher, 2003 Available from: http://www.oie.int/doc/ged/D6505.pdf Accessed 2013 June 03 11 Van P.T Current status of aquaculture veterinary drugs usage for aquaculture in Vietnam In Proceedings of the international workshop on antibiotic resistance in Asian aquaculture environments Chiang May, Thailand ISBN 88-901344-3-7, 2005 12 Heuer O.E., Kruse H., Grave K., Collignon p., Karunasagar I., Angulo F.J Human health consequences of use of antimicrobial agents in aquaculture Clin Infect Dis 49 1248- 1253,2009 13 Lê Xuân Sinh Đỗ Minh Chung Khảo sát mơ hình ni cá lóc (Channa micropelte Channa striata) Đông băng sông Cửu Long Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ, 2009 14 Boxall A.B., Fogg L.A., Blackwell P.A., Kay p., Pemberton E.J., and Croxford A Veterinary medicines in the environment Rev Environ Contain Toxicol 180:1-91,2004 29 15 Serum H Antimicrobial drug resistance in fish pathogens In: Aarestrup FM (ed) Antimicrobial resistance in bacteria of animal origin ASM Press, Washington, DC, pp 213-238,2006 16 Truong Quốc Phú, Tran Kim Tính Thành phần hóa học bùn đáy ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh Tạp Khoa học Trường Đại học cần Thơ, 22a 290-299, 2012 17 Huys G., Rhodes G., McGann p., Denys R., Pickup R., Hiney M., et al Characterization of oxytetracyclineresistant heterotrophic bacteria originating from hospital and freshwater fish farm environments in England and Ireland Syst Appl Microbiol 23: 599-606, 2000 18 FAO The state of world fisheries and aquaculture 2002 FAO, Rome, Italy, 2003 19 Harikrishnan, R Balasundaram, c Heo, M.S Impact of plant products on innate and adaptive immune system of cultured finfish and shellfish Aquaculture 317,1-15, 2011 20 Miranda C.D., Zimelman R Antibiotic resistant bacteria in fish from the Concepcion Bay, Chile Mar Pollut Bull 42,1096-1102, 2001 21 Radu s., Ahmad H., Ling F.H., Reezal A Prevalence and resistance to antibiotics for Aeromonas species from retail fish in Malaysia Int J Food Microbiol 81,261-26, 2003 22 Abutbul s., Golan-Goldhirsh A., Brazani o., Zilberg D Use of Rosmarinus officinalis as a treatment against Streptococcus iniae in tilapia (Oreochromis sp.) Aquaculture 238, 97-105, 2004 23 Ferguson H.W., Turnbull J.F., Shinn A., Thompson K., Dung T.T., and Crumlish M Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam J Fish Dis 24:509-513, 2001 24 Dung T.T., Crumlish M., Ngọc N.T.N., Thịnh N.Q., Thy Đ.T.M Xác định vi khuấn gây bệnh mủ gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp Khoa học Đại học Cần 77?ơ:137-142, 2004 25 Dung T.T, Haesebrouck F., Tuan N.A., Sorgeloos p., Baele M., Decostere A Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh vi khuan Edwardsiella ỉctaluri gây bệnh gan, thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Đông Băng Sông Cửu Long Tạp Khoa học Đại học cần Thơ: 15a 162-171, 2010 26 Rico A., Phu T.M., Satapomvanit K., Min J., Shahabuddin A.M., Henriksson P.J.G., Murray F.J., Little D.C., Dalsgaard A., Van den Brink P.J Use of veterinary medicines, feed additives and probiotics in four major internationally traded aquaculture species farmed in Asia Aquaculture 412- 413, 231-243, 2013 27 Dung T.T., Galina z., Oanh D.T.H., Jeney z and Tuan N.A Results of the baseline survey on fish health management in freshwater aquaculture of the Mekong Delta, Vietnam WEST-EASTSOUTH (WES) Newsletter No.6, 1997 30 28 Phuong, N.T., Oanh D.T.H., Dung T.T and Sinh L.x Bacterial resistance to antimicrobials use in shrimps and fish farms in the Mekong Delta, Vietnam In Proceedings of the International Workshop on antibiotic resistance in Asian Aquaculture Environments Chiang May, Thailand ISBN 88-901344-3-7, 2005 29 O’Neill J et al Antimicrobials in Agriculture and the environment: reducing unnecessary use and waste The Review on antimicrobial resistance London, UK: HM Government, pp 44, 2015 30 Hatha, M., Vivekanandhan, A., & Joice, G J Antibiotic resistance pattern of motile aeromonads from farm raised fresh water fish International journal of food microbiology, 98(2), 131-134, 2005 31 Lim, s J., Jang, E., Lee, S.-H., Yoo, B.-H., Kim, S.-K., & Kim, T.-H Antibiotic resistance in bacteria isolated from freshwater aquacultures and prediction of the persistence and toxicity of antimicrobials in the aquatic environment Journal of Environmental Science and Health, Part B, 48(6), 495-504, 2013 32 Hossain, M s., Hashem, s., Halim, M A., Chowdhury, p., Sultana, s., & Khan, M N Bacterial community structure and infection in cultured Koi (Anabas testudineus) fish species, 2017 33 Chhanda, M s., Parvez, L, Rumi, N A., Hosen, M H A., & Islam, M R Identification of pathogenic bacteria from infected Thai koi (Anabas testudineus) Asian Journal ofMedical and Biological Research, 5(1), 56-62, 2019 34 Thomas, J., Thanigaivel, s., Vijayakumar, s., Acharya, K., Shinge, D., Seelan, T s J Chandrasekaran Pathogenecity of Pseudomonas aeruginosa in Oreochromis mossambicus and treatment using lime oil nanoemulsion Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 116, 372-377, 2014 35 Haque, s., Bandyopadhyay, p K., & Mondal, K Studies on Growth, Behavior and Blood Profile in Anabas testudineus Infected with Pseudomonas aeruginosa Proceedings of the Zoological Society, 2020 36 Zdanowicz, M., Mudryk, z J., & Perlinski, p Abundance and antibiotic resistance of Aeromonas isolated from the water of three carp ponds Veterinary Research Communications, 44(\), 9-18, 2020 37 Oạnh, Đ T H., Như, T Q., & Hiền, N Đ Phân lập xác định khả gây bệnh xuât huyêt cá rô đông (anabas testudineus) vi khuân streptococcus agalactiae Tạp Khoa học Trường Đại học cần Thơ, 194-202, 2012 38 Thy, Đ T M., Cúc, T T T., & Lam, N c p Đặc điểm mô bệnh học cá rô (Anabas testudineus) nhiễm vi khuân Aeromonas hydrophila Streptococcus sp điều kiện thực nghiệm Tạp Khoa học Trường Đại học cần Thơ, 183-193, 2012 39 Dung, T T., Nguyễn, H T N T., & Duy, K Streptococcus iniae, tác nhân gây bệnh “đen thân” cá rô đồng (anabas testudineus) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 96-103,2013 31 40 Lương Ngọc Khuê, Đoàn Mai Phương, Nguyền Vũ Trung Hướng dần thực hành kỳ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Nhà xuất Y học Hà Nội, 2017 41 Melab Diagnostics (2010) Melab Blood Agar Base + 5% Sheep Blood, website: https://www.melab.vn/melab-blood-agar-base —5-sheep-blood, truy cập: ngày 21 tháng 05 năm 2021 42 Melab Diagnostics (2010) MELAB MacConkey Agar, website: http://melab.vn/uploads/doc/402-melab-macconkey-agar.pdf , truy cập: Ngày 21 tháng 05 năm 2021 43 Begum Safia Zaman, Mst Minara Khatun, Md Ariful Islam , Shadia Sharmin, Umme Kulsum and M Enamul Hoq Bacterial Flora of Koi (Anabas testudineus) Harvested from Ponds and Their Antibiogram Microbes and Health, 2( ):8-11, 2013 44 Jang H.M., et al Prevalence of antibiotic resistance genes from effluent of coastal aquaculture, South Korea, Environmental Pollution 2017 doi: 10.1016/j.envpol.2017.10.006 45 Jan Hudzicki Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol American Society for Microbiology, 2016 46 Tài liệu tập huấn khuyến nông hướng dần sử dụng thuốc kháng sinh, sản phẩm xử lý cải tạo môi trường nuôi trông thủy sản Tông cục Thủy sản Việt Nam https://www.fistenet.gov.vn 47 R Wejdan, Taj Aldeen, F.Albeer, Al-Rulbaiae PCR Detection of Putative Hemolysin and Aerolysin Genes in An Aeromonas Hydrophila Isolates from Diarrhea in Babylon Province Journal ofNatural Sciences Research Vol.4, No 11, 2014 48 E.J.Bottone, T.Robin Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features Journal of Clinical Microbiology 8(6):760-63, 1978 49 Mousumi Sarker Chhanda, Imran Parvez, Nazmi Ara Rumi, Md Hafiz All Hosen4 and Md Rezaul Islam Identification of pathogenic bacteria from infected Thai koi (Anabas testudineus) Asian J Med Biol Res 2019, (1), 56-62, 2019 32 PHỤ LỤC 3: MINH CHÚNG ĐI KÈM CỘNG HOÀ XẴ HỘI CHỦ NGHĨA MỆT NAM IIỘI THỨ Y VIỆT NAM TẠP CHÍ KHKTTHÚY DỘC lập - Tự - Hạnh phúc Hà Nội ngày 28 tháng 11 năm 2021 PHIẾU NHẬN XÉT Bài háo khoa họe đăng Tạp chí KllKT Thú ỵ Tên báo: HIỆNTRẠNG KHÁNG THUỎC KHÁNG SINH CỦA MỘT số CHÚNG VI KHUÂN GÂY BỆNH PHÂN LẬP TỪ CÁ RƠ DỊNG (Anasbas testudineus) Ớ CÁC TRANG TRẠI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHĨ HƠ CHÍ MINH Người nhận xét: Học hàm, học vị: Tiến sỹ Đơn vị công tác: Hội Thúy Việt Nam Ngày nhận bài: 25/11/2021 Ngày trả bài: 28/11/2021 33 ... trạng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh cá rô đồng Mục tiêu: - Thu nhận phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh cá rô đồng (Anabas testudineus') số trại nuôi khu vực TP.HCM - Đánh giá mức độ đa kháng kháng sinh. .. nhạy 13 chủng vi sinh (trừ chủng XI) cảm với kháng sinh kiểm tra tính kháng kháng sinh, chủng vi khuẩn phân lập chủng vi sinh kháng lạ nhóm beta-lactam, chủng đa kháng mạnh IV (7/10) VIII (6/10)... với kháng sinh clindamycin có tỷ lệ kháng 11/13 chủng vi khuẩn (chiếm 84,62%) Trong 13 chủng vi khuẩn phân lập được, chủng IV VII kháng với 7/10 kháng sinh khảo sát (70%) Đồng thời, chủng VI VIII