NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỐNG KÉT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP co SỞ NĂM 2021- 2022 Tên đề tài: Nghiên cứu sơ tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam Mã đề tài: 2021.01.105 Chủ nhiệm đề tài: Vũ Thị Nam Anh Đơn vị công tác: Viện kỳ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyền Tất Thành Thời gian thực hiện: tháng TP Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng năm 2022 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU iv TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu V MỞ ĐẦU CHƯƠNG TÔNG QUAN TÃI LIỆU .2 1.1 Sơ lược tình hình kháng kháng sinh 1.2 Giới thiệu thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam 1.3 Tinh hình nghiên cứu tính kháng kháng sinh thực phâm lên men truyền thống Việt Nam CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập vi sinh vật kháng thuốc 2.2.2 Định danh phương pháp sinh học phân tử 2.2.3 Thử nghiệm sinh hóa 2.2.4 Đánh giá tính kháng kháng sinh vi sinh vật phân lập 10 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12 3.1 Sự phổ biến kiểu hình kháng thuốc 12 3.2 Đánh giá tính kháng kháng sinh vi sinh vật phân lập 14 CHƯƠNG KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 PHỤ LỤC 3: MINH CHỨNG ĐI KÈM 23 PHỤ LỤC 4: (thuyết minh đề cương) 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẤT Tên viết tắt Tên đầy đủ AR Kháng kháng sinh MDR Đa kháng thuốc ARGs Gen kháng kháng sinh LAB Vi khuân axit lactic TSA Tryptic soy agar MH Mueller Hinton Agar TE Tetracycline SMX Sulfamethoxazole GE Gentamicin IPM Imipenem Met Methicillin KAN Kanamycin Sin Streptomycin Am Ampicillin Rf Rifampicin TMP Trimethoprim Cm Chloramphenicol CFU Colony Forming Unit DANH MỤC CÁC BÂNG BIẺU Bảng Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh thực phâm lên men khác 12 Bảng Ket thử nghiệm khuếch tán đĩa kháng sinh chủng kháng thuốc chọn từ mầu thực phẩm lên men khác 14 Bảng Bảng kết định danh chủng kháng kháng sinh theo phương pháp Sanger dựa gene 16S 15 Bảng Bảng đặc tính chủng thu từ thực phâm lên men truyền thống Việt Nam 15 TĨM TẮT KÉT Q NGHIÊN cứu STT Cơng việc thực Kết đạt Phân lập vi sinh vật kháng thuốc Phân lập 16 chủng từ thực phâm từ thực phẩm lên men truyền thống lên men truyền thống Định danh vi khuẩn phương Bảng định danh vi khuân kháng thuốc pháp sinh học phân tử thử kiêu hình kháng thuốc nghiệm sinh hóa Đánh giá tính kháng kháng sinh Thu chủng vi khuân kháng từ vi sinh vật phân lập loại kháng kháng sinh trở lên từ loại thực phâm chọn STT Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký 01 thảo báo tiếng Anh 01 báo đăng Tạp chí khoa học cơng nghệ đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 03/2021 - 12/2021 Thời gian nộp báo cáo: 20/02/2022 MỞ ĐÀU Kháng sinh Penicillin phát minh có tính lịch sử Sir Alexander Fleming kỉ XX sử dụng tác nhân trị liệu hóa học tiềm nhằm chống lại vi khuẩn gây bệnh Từ đen nay, nhiều loại kháng sinh phát đưa vào sử dụng ngày rộng rãi y học tác nhân quan trọng việc cứu chữa bệnh Tuy nhiên, tác nhân diệt khuân mạnh mè, việc sử dụng kháng sinh không dừng lại lĩnh vực y học mà sử dụng có rộng rãi chăn ni, ni trồng thủy sản nông nghiệp Việc lạm dụng kháng sinh sống làm gia tăng mầm bệnh nguy kháng thuốc dẫn đen nguy ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Dưới áp lực chọn lọc kháng sinh gây dần đến xuất lây lan vi khuẩn kháng thuốc gen kháng thuốc chúng Hậu ngày có nhiều trường hợp mắc bệnh, điều trị thất bại, nhiều ca tử vong chi phí điều trị cao cho xã hội Do xuất kháng kháng sinh nên việc tìm kiếm cách thức nhằm giảm thiểu hình thành kháng kháng sinh trở thành chủ đề trọng tâm nhiều cơng trình nghiên cứu từ nhiều nơi giới có ủy ban Khoa học Châu Âu Dinh dường Động vật (SCAN), Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO), Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) Việt Nam đất nước có lịch sử lâu đời với sản phẩm lên men truyền thống Ở Việt Nam, thực phẩm lên men truyền thống phô biến dưa muối, nem chua, sữa chua tiêu thụ rộng rãi khắp nơi nước Tuy nhiên, hầu hết tự chế, không kiêm soát tốt mặt vi sinh, tiềm ân nhiều nguy cho sức khỏe cộng đồng Đã có trường hợp ghi nhận nguy truyefn ngang gen kháng kháng sinh thông qua vi khuân không gây bệnh tới vi khuân gây bệnh Vì vậy, việc nghiên cứu xuất kiểu hình đa kháng thuốc (MDR) gen kháng kháng sinh (ARGs) số thực phàm lên men truyền thống Việt Nam cần thiết CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 So' lược tình hình kháng kháng sinh Kháng kháng sinh (AR) khả vi khuân vi sinh vật khác chống lại tác động thuốc kháng sinh Thuốc kháng sinh coi khám phá thần kỳ kỷ 20, thành cơng việc cứu sống hàng triệu người giảm bớt nhiều gánh nặng cho người Tuy nhiên, gia tăng tình trạng kháng kháng sinh bệnh viện, cộng đồng môi trường diễn đồng thời với việc sử dụng chúng Khả di truyền bất thường vi khuẩn hưởng lợi từ việc người sử dụng mức thuốc kháng sinh để khai thác nguồn gen kháng thuốc Kháng kháng sinh mầm bệnh vi khuân gây mối đe dọa đen sức khởe toàn cầu Thế giới lo lắng ve dai dẳng lây lan chúng xuất toàn trái đất WHO báo cáo ước tính có khoảng 480.000 trường hợp mắc bệnh lao đa kháng thuốc, phần lớn khơng điều trị Các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh cướp sinh mạng gần 50.000 người mồi năm riêng Hoa Kỳ Châu Âu, chưa kể hàng trăm nghìn người báo cáo chết khu vực khác Việt Nam phải đấu tranh với mối hiểm họa nghiêm trọng tượng kháng thuốc kháng sinh trạng thái sử dụng mức không hợp lý nhiều hệ thống chăm sóc y tế, cơng cộng, chăn nuôi sản xuất thực phâm nông nghiệp Theo WHO, số chuyên gia ước tính rang đến năm 2050, tình trạng kháng thuốc kháng sinh gây nên tử vong cho 10 triệu người toàn cầu vào mồi năm, tương đương với tỷ lệ giây có trường hợp từ vong- lớn so với người bệnh tử vong mắc ung thư _ Thực phẩm nói chung thực phâm lên men nói chung nguồn chứa vi sinh vật có khả kháng kháng sinh Có nhiều nguyên nhân ân chứa mầm bệnh kể đến nội sinh (động vật, thực vật), ngoại sinh (nhân sự, nước, môi trường) lây nhiễm chéo, yếu tố nội sinh ngoại sinh, nguyên nhân yếu tổ trình sinh trưởng phát triên động vật ngồi môi trường, kháng sinh sừ dụng đê trị bệnh kích thích tăng trưởng, kháng thuốc kháng sinh động vật lây truyền sang người thông qua chuồi thức ăn Cũng thực vật, vi khuân kháng kháng sinh tồn mơi trường chưa vệ sinh nên cịn tồn đọng q trình lên men Thêm vào đó, có nghiên cứu báo thành phần nem chua thịt lợn sống có thê chứa Lactobacillus', Lactobacillus fermentum, Pediococcus acidilactici Những vi khuân này, gen kháng thuốc kháng sinh (aplĩA3, erm, erm (B), tet (M) Erm (C), cat, Tn554) chuyên ngang gen sang người thông qua trực tiếp tiếp xúc gián tiếp với nguồn lây nhiễm Hơn nữa, có tiếp hợp vi khuân plasmid pRE25 Enterococcus faecalis mang số gen kháng với vi khuân axit Lactic (LAB) nem chua báo cáo nghiên cứu Sukmarini cộng Do đó, mặt tự nhiên, nem chua hoạt động phương tiện để gen kháng kháng sinh lây lan sang vi khuân khác hệ thống thực phâm đường tiêu hóa 1.2 Giói thiệu thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam Thực phẩm lên men phô biến nước châu Á nói chung Việt Nam nói riêng Thực phẩm lên men bắt nguồn từ trình tự nhiên chủ yếu liên quan đến vi khuẩn axit lactic (LAB) nấm men có nguyên liệu, đặc trưng khác biệt vùng địa lý quy trình chế biến Q trình lên men khơng giảm thiểu độc tính ngun liệu thực phẩm mà cịn làm tăng chất lượng sản phâm Thực phâm lên men thường có hương vị hương vị đặc biệt, giúp kéo dài thời gian bảo quản; tăng mùi thơm thành phần dinh dưỡng; ức chế phát triển vi khuẩn không mong muốn; loại bỏ chất kháng dinh dường Trong trình lên men, việc sản xuất axit hữu khác nhau, carbon dioxide, peptit kháng khuẩn vi khuân ngăn chặn phát triển vi sinh vật hư hỏng trình hoạt động chất bảo quản tự nhiên Một phần thiết yếu ăn truyền thống Việt Nam thức ăn lên men Ngày nay, thực phâm lên men ngày trở nên hấp dẫn đoi với người tiêu dùng chế biến không thêm hóa chất, phụ gia Tuy nhiên, khách hàng Việt Nam lo ngại chất lượng thực phẩm lên men cộng đồng vi sinh vật nguyên liệu thơ tiềm ân nguy gây hại cho sức khỏe họ Nem chua Nem chua thực phẩm lên men truyền thống rủi ro sử dụng thịt sống mà khơng qua xử lý nhiệt q trình lên men lactic ngắn Thành phần nem chua bao gồm nạc lợn xay mịn, thịt lợn luộc thái mỏng, bột gạo rang, muối gia vị (tiêu tỏi) Nem chua chuẩn bị sau: nguyên liệu trộn theo công thức hồn hợp sau tạo thành hình khối hình trụ nhỏ, sử dụng thêm số loại rau có tính khử khuân ổi đinh lãng miếng tỏi ớt (tùy địa phương) Sau gói chuối cách gấp chặt hai đầu phủ miếng chuối to Dưa chua Dưa chua nguồn tiềm ẩn chứa mầm bệnh cho người Phương pháp truyền thống để ngâm chua đơn giản bao gồm bước sau: rau làm sạch, phơi khô ngâm nước muối để lên men từ 1-3 ngày thùng kín đê đạt độ chua tối ưu Tương bần Tương bần loại thực phẩm lên men truyền thống điển hình Ngun liệu đê làm tương bần đậu tương, gạo nếp, muối nước Thông thường, gạo hấp ủ với môi trường ban đầu chủ yếu chứa Aspergillus oryzae khoảng 30° c 4-5 ngày 1.3 Tình hình nghiên cún tính kháng kháng sinh thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam Trong năm gần đây, kháng kháng sinh coi vấn đề lớn sức khỏe cộng đồng, nên việc hiểu biết xuất phát triển kháng thuốc môi trường không thuộc lâm sàng nhà nghiên cứu khắp giới quan tâm Bên cạnh đất nước, thức ăn lên men thức ăn đường phố trở thành nguồn cung cấp vi khuẩn kháng kháng sinh quan trọng tầm quan trọng chúng chế độ ăn uống người, đặc biệt nước phát triển 9’10 Nhiều nghiên cứu kiêu hình kháng với Kanamycin, Streptomycin, Tetracylin, Erythromycin, Chloramphenicol phân lập ARGs chủ yếu gen tet erm Lactobacilli Enterococci tìm thấy sản phẩm lên men truyền thống khác sản phâm sữa, thịt lên men rau lên men IM4 Bên cạnh LAB, mầm bệnh khác liên quan đến thực phâm lên men truyền thống Staphylococcus aureus, Escherichia coll, Salmonela sp Cũng báo cáo có khả kháng loại kháng sinh khác (ví dụ: 0-lactams, cephalosporin, aminoglycosides trimethoprim­ sulfamethoxazole ) 15 Hiện giới loại thực phẩm lên men truyền thống, chủ yếu sản phâm từ sữa, thịt rau lên men chứa LAB nguồn bệnh từ thực phẩm khác báo cáo có chất kháng nhiều loại kháng sinh có khả kháng thuốc bổ sung Từ góc độ an tồn thực phẩm, số báo cáo Cơ quan An toàn Thực phâm Châu Âu công bố năm gần (liên quan đen việc thực phâm có nguồn gốc động vật nguồn gây kháng kháng sinh quan trọng số nguyên nhân, chẳng hạn việc sử dụng kháng sinh khứ để thúc đẩy tăng trưởng động vật thực phẩm điều trị dự phòng điều trị 16 Mặc dù nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh phát triền the giới nhiều thập kỷ qua có kết nghiên cứu định Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu kháng kháng sinh nhiều lĩnh vực y học mơi trường Đã có vài nghiên cứu kháng kháng sinh quán ăn lề đường nhóm nghiên cứu Malaysia cơng bổ 17 Tuy nhiên Việt Nam, lình vực chưa đề cập nhiều Đây hướng nghiên cứu liên quan tới liên hệ sản phâm nông nghiệp y tế, chủ đề chưa quan tâm mức, cần tiếp tục nghiên cứu đào sâu để đưa giải pháp đồng hiệu Thực phâm nguồn cung cấp vi sinh vật cho thể nên vệ sinh an toàn thực phẩm liên quan mật thiết với yếu tổ vi sinh ảnh hưởng tới sức khỏe người Các trình tự gene nhận sau giải trình tự so sánh ngân hàng dừ liệu NCBI sử dụng công cụ BLAST Các loài vi khuẩn định danh dựa điểm cao thông số độ tương đồng (identity), độ bao phủ dừ liệu (query cover), giá trị mong đợi (E- value) 2.2.3 Thử nghiệm sinh hóa a Nhuộm Gram Nhuộm gram kỳ thuật để phân biệt nhóm vi khuẩn Gram dương (+) Gram âm (-) dựa cấu tạo vách tế bào vi khuẩn Quy trình nhuộm gram: • Dàn bệnh phâm vi khn lên lam kính sạch; • Cố định mầu bệnh phâm bang cách hơ lừa đèn cồn đê nguội; • Các bước nhuộm: Đầu tiên phủ dung dịch tím (Crystal Violet) để khoảng 60 giây sau rửa vịi nước chảy nhẹ Tiếp theo phủ dung dịch Lugol đê cố định màu, đê khoảng 60 giây rửa vòi nước Tẩy màu cồn 950 để khoảng 30 giây rửa nước Cuối phủ dung dịch đỏ Fuchsin 1/10 Gram để khoảng 30 giây rửa vịi nước Đê khơ tự nhiên Soi vật kính dầu b Thử nghiệm Citrate Xác định khả sử dụng citrate nguồn carbon trình biến dường vi sinh vật dựa vào mơi trường có chứa muối ammonium vơ Vi sinh vật có khả sử dụng citrate làm nguồn Carbon có khả sử dụng muối Amonium làm nguồn Nitơ sinh NH3 làm mơi trường trở nên kiềm • Cấy khuẩn vào mơi trường Simmon đọc kết sau để 35 - 37 °C vòng 18-24 c Thử nghiệm Methyl Red and Voges-Proskauer Methyl red nhằm kiểm tra khả tạo trì acid tạo từ trình lên men glucose vi sinh vật Voges - Proskauer nhằm xác định khả sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trình lên men glucose số vi sinh vật • Mơi trường: Sử dụng mơi trường MR - VP Broth • Thuốc thử: Methyl Red: o Đỏ methyl 0.1 g o Etanol 95 300 ml o Nước cất 2000 ml Voges-Proskauer: Alpha-naphthol, chất tạo màu 5% Kali Hydrooxide, 40%, chất oxy hóa • Các kiểm sốt dương tính âm tính nên thực sau chuân bị lô môi trường lơ thuốc thử Các kiểm sốt đề xuất bao gồm: Kiểm sốt dương tính: s.aureus Kiểm sốt âm tính: Escherichia colỉ • Quy trình thử nghiệm: Methyl Red: Cấy mẫu vào ống MR - VP broth sinh vật thử nghiệm, ủ 24 35°c Sau ủ, nhỏ giọt thuốc thừ vào dịch ni cấy, chuyển đỏ dương tính, vàng âm tính Voges-Proskauer: Cấy mẫu vào ống MR - VP broth sinh vật thử nghiệm, ủ 24 35°c Sau ủ, hút ml dung dịch vào ống nghiệm Thêm 0.6 mL alpha naphthol 5%, 0,2 mL KOH 40% theo thứ tự Lắc nhẹ ống để môi trường tiếp xúc với oxy khí để ống yên 10 đen 15 phút Neu ống chuyển đỏ nâu dương tính, vàng nhạt âm tính d Thử nghiệm Calatase Thử nghiệm Catalase dùng đê thử nghiệm khả thủy phân H2O2 thành H2O 02, tạo bọt khí dựa vào chế vi khuân sinh enzym catalase để thủy phân Lấy khuân lạc trét lên mặt lam kính nhỏ H2O2 30% Quan sát sau l-2s: có bọt khí xuất phản ứng dương tính, khơng có bọt khí xuất phản ứng âm tính e Thử nghiệm Oxidase Thừ nghiệm oxidase sử dụng để xác định vi khuẩn sinh cytochrome oxidase c, enzyme chuồi vận chuyển điện tử vi khuẩn Lấy que cấy lấy khuẩn lạc miết miếng giấy tẩm sằn hóa chất phản ứng miết Quan sát kết vịng 10s đầu Phản ứng dương tính cho kết màu xanh tím f Thử nghiệm khả di động Thử nghiệm nhằm xác định khả di động vi sinh vật Nuôi khuẩn môi trường thạch mem (Semi-Nutrient Agar) 0.5% thạch ống nghiệm, u 24 35°c, thấy đường cấy không bị xê dịch âm tính, đường cấy mọc lan mơi trường dương tính 2.2.4 Đánh giá tính kháng kháng sinh vi sinh vật phân lập Tiến hành sàng lọc chọn chủng đa kháng thuốc sử dụng phương pháp khuếch tán đìa thạch dựa theo hướng dần Viện Tiêu chn Phịng thí nghiệm Lâm sàng (CLSI, 2015) 19 Các xét nghiệm thực thạch Mueller Hinton, loại thuốc kháng sinh thường sử dụng Hoạt tính kháng khuẩn loại kháng sinh kiểm tra cho tất chủng phân lập kết sè giải thích theo hướng dẫn xét nghiệm độ nhạy đĩa kháng sinh Viện Tiêu chn Phịng thí nghiệm Lâm sàng cung cấp kết ghi nhạy, kháng trung gian kháng Các chủng kháng loại kháng sinh khác coi chủng đa kháng thuốc (MDR) định danh, số lượng chủng MDR phân lập từ mồi mẫu ghi lại Các kháng sinh sau thử nghiệm chúng thuộc họ riêng biệt: gentamicin (GE) nồng độ đĩa kháng sinh 10 pg; methicillin (Met) nồng độ đìa kháng sinh pg; kanamycin (Km) nồng độ đĩa kháng sinh 30 pg; tetracyclin (TE) nồng độ đĩa kháng sinh 30 pg; imipenem (IPM) nồng độ đìa kháng sinh 10 pg; streptomycin (Sm) nồng độ đĩa kháng sinh 10 pg; ampicillin (Am) nồng độ đĩa kháng sinh 10 pg; Rifampicin (Rf) nồng độ đĩa kháng sinh 30 pg; trimethoprim (TMP) nồng độ đìa kháng sinh 1,25 pg chloramphenicol (Cm) nồng độ đìa kháng sinh 30 pg Nồng độ kháng 10 sinh chủng kiêm tra lựa chọn dựa liệu tài liệu dừ liệu Viện Tiêu chuân Lâm sàng Xét ngiệm (CLSI) 20 Tất khuân thu từ việc phân lập thực phẩm lên men truyền thống nuôi lại đĩa MH ủ qua 24h 37°c Sau đó, lấy vi khuẩn tăng sinh pha dung dịch nước muối 0.9% nồng độ 0.5 McFarlane trải lên đĩa MH đặt đĩa kháng sinh ủ 24 Sau q trình ủ, tiến hành đo đường kính vòng vi khuân tạo thành 11 CHƯƠNG KẾT QUÃ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sự phổ biến kiểu hình kháng thuốc Sau ủ thạch TSA khoảng 24 37°c, sử dụng phương pháp quan sát đếm khuẩn lạc cho thấy: nhìn chung, hình thái tồn chủng hình trịn, lồi, nhằn không suốt Hầu hết tất khuẩn lạc vi khuân có màu trắng số số chúng có màu vàng Đánh giá phong phú vi khuẩn dị dưỡng kháng sulfamethoxazole (SMX) từ nem chua, dưa chua tương bần Hà Nội (Bảng 1) Trong nem chua, số lượng vi khuẩn kháng SMX 0.35x1 o4 (CFU/g) tổng số lượng vi sinh dị dưỡng 1.37xl06 (CFU/g) Ỏ dưa chua, số lượng vi khuẩn kháng SMX 0.76x1 o4 (CFU/g) tổng số lượng vi sinh dị dường 1.89xlO6 (CFU/g) Trong tương bần, số lượng vi khuẩn kháng SMX 0.53x1 o4 (CFU/g) tổng số lượng vi sinh dị dường 3.19xl06 (CFU/g) Bảng Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh thực phâm lên men khác Sản phâm Vi khuẩn kháng SMX (CFU/g) Tổng số vi sinh vật dị dưỡng (CFU/g) Tỉ lệ Nem chua (0.35 ±0.2) X 104 (1.54 +0.28) X 106 0.24%+ 0.18 Dưa chua (0.76 +0.23) X 104 (1.89 ± 0.72) X 106 0.45% + 0.27 Tương bần (0.53 + 0.36) xio4 (3.19 +0.8) X 106 0.17%+ 0.11 12 Hình Tỷ lệ vi khuân kháng thuốc ba loại thực phâm Các giá trị trung bình chín lần lặp lại sừ dụng đê đại diện cho phân bố loại thực phâm Các chừ khác khác biệt đáng kể (Tukey’s HSD test, p