DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NI Bị sinh sản có KL 367,66kg; TGĐDLSĐ 78,58 ngày; SLPGĐT 1,71 lần Bị tơ có KL 308,20kg; TĐDLĐ 17,06 tháng tuổi; TPGLĐ 18,13 tháng tuổi SLPGĐT 1,58 lần/thai TÀI LIỆU THAM KHẢO Chi cục thống kê huyện Châu Thành, Cầu Kè, Tiểu Cần, Cầu Ngang, Trà Cú, Duyên Hải, TX Duyên Hải, Càng Long TP Trà Vinh (2017-2019) Báo cáo kết điều tra chăn nuôi 2017-2019 Cục thống kê tỉnh Trà Vinh (2017-2019) Niên giám thống kê 2017-2019 Cục Chăn nuôi (2017-2019) Số liệu thống kê số lượng bò phân theo địa phương năm 2017-2019 Trương Văn Hiểu Nguyễn Thị Kim Quyên (2021) Hiện trạng ni bị sinh sản tỉnh Trà Vinh Tạp chí KHKT Chăn ni, 265(5.21): 52-58 Phí Như Liễu, Nguyễn Văn Tiến Hoàng Thị Ngân (2017) Kết lai tạo nuôi dưỡng bê lai hướng thịt An Giang Tạp chí KHCN Chăn ni, 76(6.17): 91-99 Phạm Văn Quyến, Giang Vi Sal, Huỳnh Văn Thảo, Trầm Thanh Hải, Trần Văn Nhứt, Thạch Thị Hòn Trần Văn Trước (2019) Kết điều tra, khảo sát tình hình phát triển chăn ni bị thị trường tiêu thụ thịt bò huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh Tạp chí KHCN Chăn ni, 101(7.19): 78-88 Phạm Văn Quyến, Hoàng Thị Ngân, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Văn Tiến, Giang Vi Sal, Bùi Ngọc Hùng, Lê Việt Bảo, Nguyễn Minh Trí Phạm Văn Tiềm (2021) Hiện trạng chăn ni bị lai hướng thịt TP Hồ Chí Minh Tạp chí KHKT Chăn ni, 266(6.21): 34-40 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS DỊCH TẢ LỢN DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NCE2 Trần Đức Hoàn1*, Đồn Thị Thảo1, Nguyễn Thị Hương Giang1 Nguyễn Đình Nguyên1 Ngày nhận báo: 30/03/2021 - Ngày nhận phản biện: 30/04/2021 Ngày báo chấp nhận đăng: 04/05/2021 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm ứng dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction) để chẩn đoán bệnh dịch tả lợn cổ điển dựa đoạn gen ncE2 virus Giống virus sử dụng nghiên cứu phân lập từ lợn chết tỉnh Bắc Giang năm 2018 Cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trình tự nucleotide ngân hàng gen giới (NCBI) Bằng phương pháp RT-PCR với điều kiện tối ưu hóa, kết nghiên cứu cho thấy, virus dịch tả lợn cổ điển phát triển tốt môi trường tế bào PK15a DMEM bổ sung 5% huyết bào thai bê Giống virus gây nhiễm môi trường tế bào theo hướng dẫn tổ chức OIE Phản ứng RT-PCR thực thành công với cặp mồi CSF324/326 nhiệt độ gắn mồi 50-60°C Trình tự, gen ncE2 virus dịch tả lợn giải trình với độ dài 284bp, mã hóa 93 axít amin, độ tương đồng 99% so với chủng công bố ngân hàng gen NCBI Kết nghiên cứu sở phân tích tính di truyền virus dịch tả lợn cổ điển lưu hành Việt Nam Từ khóa: Gen ncE2, lợn, Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction, virus dịch tả ABSTRACT Detection of clasical swine fever virus base on ncE2 gene using Reverse TranscriptPolymerase Chain Reaction (RT-PCR) The study aimed to application of Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction technique to diagnose clasical swine fever disease base on E2 of virus gene fragment The virus strain used in this study was isolated from dead pigs in Bac Giang province in 2018 A pair of specific primers were designed basing on nucleotide sequences on NCBI (National Center for Biotechnology Information) Through out RT-PCR with the optimal condition of reaction, the results showed that, clasical swine fever virus could grow on the PK15a cell medium in DMEM supplement 5% calve embryo serum Virus strain was infected on the cells medium according to Organization of Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang * Tác giả liên hệ: TS Trần Đức Hồn, Khoa Chăn ni - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang; Điện thoại: 0965 679 819; Email: dr.hoan288@gmail.com 20 KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI International Epidemiology RT-PCR reaction was successfully detected with the pair of primers CSF324/326 at the annealing temperature from 50-60°C The seqencing of clasical swine fever virus ncE2 gene of this strain with 284bp, encoding 99 amino acids, similarity of 99% as compare with the published one in the Genebank The results of the study is basic to analyze clasical swine fever virus genetic in Vietnam Keywords: Gene ncE2, Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction, fever virus ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với mơ hình chăn ni quy mơ cơng nghiệp ngày phát triển kéo theo dịch bệnh ngày trở nên phức tạp Trong đó, bệnh dịch tả lợn cổ điển (Classical Swine Fever-CSF) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn lây lan nhanh, tỷ lệ chết cao (85100%) cho lứa tuổi gây thiệt hại nặng nề kinh tế (Nguyễn Thị Phương Duyên ctv, 2001) Bệnh dịch tả lợn virus thuộc chi Pestivirus, họ  Flaviviridae gây ra; bệnh lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa đường hơ hấp tiếp xúc trực tiếp với lợn ốm gián tiếp qua chất tiết, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi (Nguyễn Tiến Dũng, 1999; Bhaskar ctv, 2015) Ở Việt Nam, bệnh dịch tả lợn phát lần vào năm 1923-1924 Houdener Từ  đến cịn tồn phổ biến luôn mối đe doạ nghiêm trọng ngành chăn nuôi lợn nước ta (Đào Trọng Đạt Nguyễn Tiến Dũng, 1985; Nguyễn Tiến Dũng, 1999) Cho đến nay, cơng tác chẩn đốn, phịng chống bệnh vấn đề nan giải Trong công tác chẩn đốn hay phịng trị bệnh, phương pháp truyền thống dựa dịch tễ lâm sàng ngày bộc lộ nhiều khuyết điểm theo kịp tình hình diễn biến bệnh Trong việc áp dụng cơng nghệ sinh học vào chẩn đoán bệnh phát huy tác dụng hiệu đặc biệt việc chẩn đoán nhanh xác mầm bệnh góp phần khơng nhỏ trình điều trị ngăn chặn dịch bệnh lấy lan Để phân tích xác virus gây bệnh dịch tả lợn với virus khác chi KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 Pestivirus BVDV, BDV , kỹ thuật RTPCR trở nên hữu ích với đoạn gen 5’NTR, E2, NS5B việc phân biệt chủng virus dịch tả lợn tổng kết phân biệt chủng virus dịch tả lợn nhiều nước giới kể châu Á, nghiên cứu nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh tạo tiền đề cho nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus dịch tả lợn sau VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Virus dịch tả lợn, phân lập từ lợn chết Bắc Giang năm 2018 Các dụng cụ hóa chất phịng thí nghiệm cần thiết: Môi trường cho nuôi cấy tế bào; vật liệu, sinh phẩm dùng phản ứng RT-PCR hóa chất dùng điện di ADN 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào Virus dịch tả lợn nuôi cấy tế bào PK15a theo phương pháp nuôi cấy tế bào Tế bào từ môi trường nitơ lỏng, nuôi vào chai nuôi T25 bổ sung vừa đủ 6ml mơi trường Sau đó, ni tủ ấm 37°C 5% CO2 Tế bào theo dõi hàng ngày qua quan sát kính hiển vi quang học 2.2.2 Phương pháp gây nhiễm virus dịch tả lợn dòng tế bào PK15a Được thực theo hướng dẫn OIE gồm bước sau: Chuẩn bị tế bào PK15a bám đáy 100% Gây nhiễm virus, nuôi tủ ấm 37°C 5% CO2 Thu virus sau 4-5 ngày gây nhiễm 2.2.3 Chiết tách, tinh RNA virus dịch tả lợn Sử dụng kít thương mại chiết tách, tinh RNA virus dịch tả lợn làm “khuôn 21 DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI mẫu” cho việc tổng hợp cDNA, bước thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Hỗn hợp phản ứng: Total RNA 5µl; 5mM dNTPs 2µl; H2O 5µl Đem ủ 65°C phút, sau ủ đá phút Bổ sung 4µl 5X First-Strand Buffer; 1µl 0.1 M DTT; 1µl RNaseOUT; 1µl SuperScript III RT (200 U/µl) Trộn đều, ủ 55°C 60 phút Dừng phản ứng 70°C 15 phút, bổ sung 1µl (2U) RNase H ủ 37°C 20 phút 2.2.5 Thiết kế mồi đặc hiệu gen vùng noncoding E2 virus dịch tả lợn Để thiết kế cặp mồi đặc hiệu gen noncoding E2 (ncE2) virus dịch tả lợn, 20 trình tự gen E2 công bố ngân hàng liệu NCBI Trình tự đầu 5’ 3’ gen đích sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng noncoding E2 virus dịch tả lợn Trình tự cặp mồi cho nhân gen vùng noncoding E2 virus dịch tả lợn với thông số thể qua bảng 2.2.4 Phương pháp tổng hợp cDNA Phản ứng tổng hợp cDNA từ khuôn mRNA thực sau: Bảng Các thông số kỹ thuật primer khuếch đại vùng ncE2 virus dịch tả lợn Tên CSF-324 CSF-326 F/R Forward Reverse Trình tự ATGCCCACAGTAGGACTAGCA TCAACTCCATGTGCCATGTAC 2.2.6 Phương pháp PCR Phương pháp PCR (sau sinh tổng hợp cDNA RT-PCR) tiến hành sở phương pháp phổ biến truyền thống Chu trình nhiệt sau: Tiền khởi động 94°C phút; duỗi mạch 94°C 30 giây; gắn mồi 60°C 30 giây; kéo dài 72°C 30 giây kết thúc 72°C 10 phút 22 Length (bp) 21 23 Độ dài 284bp Sản phẩm phản ứng PCR điện di gel Agarose 2% dung dịch TAE 1x 2.2.7 Phương pháp giải trình tự gen Sản phẩm PCR tinh theo kít hướng dẫn nhà sản xuất, gửi tới Công ty Biotech, Hàn Quốc để giải trình tự gen virus dịch tả lợn, đọc phần mềm Chromas KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nuôi cấy tế bào Để đảm bảo cho thí nghiệm gây nhiễm vi rút nhân giống vi rút đạt kết tốt, bước quan trọng phải có tế bào nuôi trạng thái phát triển tốt phủ đầy đáy chai 100% sau 1-2 ngày nuôi cấy Vì vậy, lượng tế bào cấy chuyển ban đầu cần tối thiếu từ 2x105 tế bào/ ml đến 5x105 tế bào/ml, đồng thời q trình ni cấy phải đảm bảo đầy đủ điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ, CO2 thích hợp Trong nghiên cứu này, tế bào PK15a nuôi cấy môi trường DMEM bổ sung 5% huyết bào thai bê phát triển khỏe mạnh sau ngày nuôi cấy tế bào PK15a bám đáy mọc kín chai ni Tế bào mạnh khỏe, phát triển tốt, hình thái đặc trưng hình đa giác, có tế bào chết Hình thái quan sát soi kính hiển vi soi ngược cho thấy tế bào hoàn toàn khỏe mạnh, không bị tạp nhiễm đủ tiêu chuẩn để gây nhiễm virus dịch tả lợn Sau hình ảnh tế bào PK15a sau 24 nuôi cấy chụp qua kính hiển vi với độ phóng đại 10x20 Hầu hết nghiên cứu virus dịch tả lợn giới sử dụng dịng tế bào có nguồn gốc từ dòng tế bào thận lợn, khả tăng trưởng virus dịch tả lợn mạnh 48 sau gây nhiễm đạt cao 120 tế bào PK15 (Leifer ctv, 2010) Hình Tế bào PK15a sau 24 ni cấy (20X) 3.2 Kết gây nhiễm virus dịch tả lợn dịng tế bào PK15a Sau có tế bào PK15a phát triển tốt, phủ đầy đáy chai 100%, tiến hành gây nhiễm virus dịch tả lợn chủng từ thực địa theo quy trình hướng dẫn OIE (Hình 2) cho thấy sau ngày theo dõi tế bào PK15a gây nhiễm virus dịch tả lợn tế bào PK15a bám đáy tốt, giữ hình thái đặc trưng tế bào khơng có bệnh tích tế bào gây virus dịch tả lợn Tiến hành thu tế bào để tách chiết RNA tổng số kiểm tra phản ứng RT-PCR để kiểm tra có mặt virus dịch tả lợn sau gây nhiễm Hình Tế bào PK15a gây nhiễm virus dịch tả lợn với độ phóng đại 40X KHKT Chăn ni số 267 - tháng năm 2021 23 DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NI 3.3 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng RT-PCR Để xác định điều kiện tối ưu nhiệt độ bắt cặp cặp primer chẩn đoán vùng noncoding E2 virus dịch tả lợn, sử dụng khuôn cDNA chuẩn virus dịch tả lợn Kết chạy điện di thạch agarose 2%, 100V 25 phút thể hình ứng RT-PCR phát đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn (Hình 4) Hình Phổ điện di sản phẩm RT-PCR phân lập Kết phản ứng PCR gradient kiểm tra nhiệt độ bắt cặp tối ưu mồi (Hình 3) cho thấy xuất băng ADN kích thước khoảng 300bp nhiệt độ bắt cặp khác 50-63°C Kích thước phù hợp với kích thước dự kiến gen ncE2 virus dịch tả lợn theo thiết kế khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu (284bp) Từ kết hình cho thấy cặp mồi CSF324/326 cho hoạt động tốt khơng có tượng dimer, nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR khuếch đại vùng noncoding gen E2 virus dịch tả lợn 50-63°C Một số nghiên cứu giải mã trình tự gen kỹ thuật phát virus dịch tả lợn kỹ thuật RT-PCR cho thấy nhiệt độ bắt mồi gen E2 khoảng 50-63°C nhiệt độ tối ưu phù hợp cho kết tốt (Rios ctv, 2017; Elina ctv, 2017) Kết kiểm tra RT-PCR sau gây nhiễm virus dịch tả lợn tế bào PK15a thể qua hình cho thấy sau 48h gây nhiễm virus dịch tả lợn tế bào PK15a cho kết dương tính với phản ứng RT-PCR Như vậy, cặp mồi CSF324/326 khuếch đại vùng ncE2 virus dịch tả lợn thiết kế cho kết đặc hiệu với chủng virus dịch tả lợn phân lập từ thực địa Trong năm gần đây, kỹ thuật chẩn đoán nhanh bệnh dịch tả lợn công bố Vishal Chander ctv (2014) nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nhanh dịch tả lợn phương pháp miễn dịch học, kết hợp với biểu lâm sàng Hoffmann ctv (2005) nghiên cứu phát triển kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán nhanh xác bệnh dịch tả lợn Với kỹ thuật đại, cho phép phát sớm virus dịch tả lợn từ dịch họng lợn mà không cần lấy máu (Stefano ctv, 2018) Tuy nhiên, kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử dựa gen quan trọng E2, 5’-NTR NS5B cho kết nhanh xác (Sandra ctv, 2017; Elina ctv, 2017) 3.4 Ứng dụng RT-PCR phát đoạn gen noncoding E2 Virus dịch tả lợn Từ kết phân lập virus dịch tả lợn từ thực địa tỉnh Bắc Giang, tiến hành tách chiết RNA tổng hợp cDNA theo phương pháp mô tả phần phương pháp nghiên cứu Phản ứng PCR thực dựa kết tối ưu phần 3.3 Kết phản 3.5 Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn Trình tự gen khung đọc đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn tách dịng thể hình cho thấy trình tự đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn sử dụng để blast lên ngân hàng liệu NCBI Kết cho thấy đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn Hình Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR M: thang ADN chuẩn 1kb; giếng 1-8: sản phẩm RT-PCR 24 KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NI nghiên cứu có độ tương đồng 99% so với gen ncE2 virus dịch tả lợn cơng bố Khi so sánh trình tự nhận thấy gen ncE2 tách dịng có nucleotide khác so với dịng cơng bố trình tự amino axit tương đồng điểm sai khác Từ kết cho thấy cặp primer CSF324/326 thiết kế cho kết tương đồng có độ đặc hiệu với chủng phân lập thực địa Hình Trình tự gen gen ncE2 virus dịch tả lợn tách dòng KẾT LUẬN Đã phân lập virus dịch tả lợn chủng thực địa dòng tế bào PK15a Cặp mồi CSF324/326 dùng để chẩn đoán virus dịch tả lợn lưu hành Việt Nam Có thể sử dụng cặp mồi CSF324/326 dùng để phân tích di truyền virus dịch tả lợn lưu hành Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Bhaskar N., Ravishankar C., Rajasekhar R., Sumod K., Sumithra T.G and John K (2015) Molecular typing and phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolates from Kerala, India Virus disease, 26(4): 260-66 Nguyễn Tiến Dũng (1999) Dịch tả lợn cổ điển vấn đề thời Tạp chí KHKT Thú y, 4(2): 48-55 Nguyễn Thị Phương Duyên, Đỗ Văn Khuyên Dư Đình Quân (2001) Khảo sát hội chứng sốt, táo bón bỏ ăn đến chết đàn lợn sinh sản đàn lợn tỉnh Khánh Hòa Quảng Ngãi Báo cáo KHCNTY, Bộ NN PTNT, 10-12/4/2001 Đào Trọng Đạt Nguyễn Tiến Dũng (1985) Về tình hình dịch tễ bệnh dịch tả lợn cổ điển Việt nam vấn đề phòng chống bệnh Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật nông nghiệp (1981-1985)-Phần Chăn nuôi -Thú y KHKT Chăn nuôi số 267 - tháng năm 2021 Elina K., Nagendra N.B., Manab D., Gitika R., Kongkon B., Nipu D., Durlav P.B and Sachin K (2017) Molecular characterization of classical swine fever virus isolates from India during 2012-14 Acta Tropica, 170: 180-89 Hoffmann B., Beer M., Schelp C., Schirrmeier H., and Depner K (2005) Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever J Virol Methods, 130(1-2): 36-44 Leifer I., Everett H., Hoffmann B., Sosan O., Crooke H and Beer M (2010) Escape of classical swine fever C-strain vaccine virus from detection by C-strain specific real-time RT-PCR caused by a point mutation in the primer-binding site J Virol Methods, 166(1-2): 98-00 Rios L., Coronado L., Naranjo-Feliciano D., MartinezPerez O., Perera C.L and Hernandez-Alvarez L (2017) Deciphering the emergence, genetic diversity and evolution of classical swine fever virus Sci Rep., 7(1): 17887 Sandra B., Christoph S., Julia H., Jolene C and Martin B (2017) Classical swine fever-an updated review Viruses J., 86: 1-24 10 Stefano P., Ilaria P., Monica G., Francesco F and Gian M.D.M (2018) Detection of Classical swine fever virus infection by individual oral fluid of pigs following experimental inoculation J Vet Dia Inv., 29(2): 254-257 11 Vishal C., S Nandi, C Ravishankar, V Upmanyu and Rishendra V (2014) Classical swine fever in pigs: recent developments and future perspectives Anim Hea Res Rev., 15(1): 87-01 25 ... phản ứng PCR khuếch đại vùng noncoding gen E2 virus dịch tả lợn 50-63°C Một số nghiên cứu giải mã trình tự gen kỹ thuật phát virus dịch tả lợn kỹ thuật RT- PCR cho thấy nhiệt độ bắt mồi gen E2... cho thấy trình tự đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn sử dụng để blast lên ngân hàng liệu NCBI Kết cho thấy đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn Hình Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT- PCR M: thang ADN chuẩn... nghiên cứu Phản ứng PCR thực dựa kết tối ưu phần 3.3 Kết phản 3.5 Xác định trình tự nucleotide đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn Trình tự gen khung đọc đoạn gen ncE2 virus dịch tả lợn tách dòng thể