Đang tải... (xem toàn văn)
Đánh giá hàm lượng các chất β-agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT β -AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỨC ĂN GIA SÚC VÀ DƯ LƯỢNG TRONG THỊT GIA SÚC BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ. Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01 Phản biện 1: GS.TSKH. Nguyễn Công Hào Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng Phản biện 3: PGS.TS. Trương Thế Kỷ Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Văn Thị NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. GS.TS. Chu Phạm Ngọc Sơn 2. TS. Trầ n Kim Tính Tp. Hồ Chí Minh - 2011 Trang 1 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol [14] . Salbutamol được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol…Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent (Theo tài liệu trên trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Salbutamol) Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nh ược chức năng gan [14] . Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN & PTNT) [11] . Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm 2005-2008 phần lớn chỉ dừng lại ở mức độ định tính và định lượng bằng ELISA với độ chính xác chưa cao. Việc định lượng chính xác dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cầ n được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác định tồn dư β-agonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có. Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên c ứu về salbutamol (sal) và clenbuterol (clen) được công bố trong và ngoài nước, đồng thời nhờ sự hỗ trợ về thiết bị của Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký TP Hồ Chí Minh, Phòng Thí nghiệm Chuyên sâu của trường Đại Học Cần Thơ, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Đánh giá hàm lượng các chất β -agonists (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Mục đích nghiên cứu Đề tài này được thực hiện với mong muốn: • Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằ ng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước. • Theo dõi mức độ tồn lưu của clen và sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa clen và sal. • Điều tra sơ bộ tình hình sử dụng hợp chất β-agonist, cụ thể là sal và clen, trong thức ăn gia súc và kh ả năng tồn lưu của chúng trong thịt gia súc ở một số tỉnh đồng bằng sông Trang 2 Cửu Long (Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang). Đối tượng và phạm vi nghiên cứu a. Các mẫu thức ăn gia súc: lấy mẫu từ các cơ sở bán thức ăn gia súc, gia cầm gồm một số loại được ký hiệu như sau: NH, MT, HG, CTC, CC, CG, TAS80, ST, ADBC, ODBAS, TA11C30, TATNB, TĐĐ 6711, CT (mẫu được lấy từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 9 năm 2009). b. Mẫu thịt heo, thịt gà nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứ a nồng độ nhất định clen và sal để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy. c. Mẫu thịt dùng cho điều tra được lấy từ các tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang, Thành phố Cần Thơ d. Thiết bị phân tích • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access của Thermo Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh) • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LC/MS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh) Phạm vi nghiên cứu • Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích (clenbuterol và salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ. • Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng tồn dư clenbuterol và salbutamol trong thịt heo, thịt gà. • Phân tích 1700 mẫu thức ăn chăn nuôi và thịt heo, thịt gà, sơ bộ đánh giá tình hình sử dụng clenbuterol và salbutamol ở thành phố Cần thơ và hai tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang Điểm mới của luận án. • Xây dựng thành công phương pháp định lượng clenbuterol và salbutamol bằng LC/MS/MS, có sử dụng nội chuẩn đồng vị clenbuterol-d 9 và salbutamol-d 3 , làm tăng độ tin cậy của phương pháp. • Quy trình phân tích tương đối không quá phức tạp nhưng đạt các yêu cầu trong quy định của Châu Âu về hiệu suất thu hồi, giới hạn phát hiện (theo quyết định 2002/657/EC). • Phân tích hơn 1700 mẫu gồm: Thức ăn chăn nuôi (TACN), thịt heo và thịt gà ở thành phố Cần Thơ và hai tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang trong ba năm 2007-2009. • Xác định khả nă ng lưu tồn của clenbuterol và salbutamol trong thịt gà và thịt heo qua thử nghiệm nuôi gà, nuôi heo trực tiếp bằng chất kích thích clenbuterol, salbutamol với các nồng độ đưa vào thức ăn cho các nghiệm thức thí nghiệm là 400, 600, 1000μg/kg; thực tế, cho đến nay, chưa có tác giả nào ở Việt Nam thực hiện nghiên cứu tương tự. Trang 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở nước ngoài và trong nước. 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Năm 2001, tác giả Woodward K.N [77] thuộc viện nghiên cứu về thuốc thú y ở Anh đã nghiên cứu quá trình chuyển hóa và độc tính của clenbuterol trên một số loài động vật (chuột, khỉ, trâu, bò, ngựa). Các tác giả Warriss P. D và cộng sự (1990 và 1991) [73],[74] , Fawcett J. P và cộng sự (2004) [40] đã nghiên cứu ảnh hưởng của salbutamol lên thịt heo, các chuyển hóa về mặt sinh học của gia súc khi sử dụng hợp chất này. Theo các tài liệu đã công bố, từ năm 1990 đến 2011, nhiều tác giả đã nghiên cứu phương pháp phân tích clenbuterol, bằng LC-MS, LC-MS/MS với các giá trị LOD cho clenbuterol trong nhiều nền mẫu khác nhau (thịt, gan, thận, thức ăn chăn nuôi, mẫu máu ) thường đạt từ 0,02 dến 9 ppb [33]; [34],[41],[50],[54],[72],[75] ; với phương pháp phân tích β-agonist trên các nền mẫu sinh học bằng sắc ký khí (GC-MS), các nghiên cứu được công bố cho giá trị LOD của clenbuterol < 0,5 ppb hoặc không công bố giá trị LOD [55] . Riêng trong năm 1999, Guy và cộng sự [43] thuộc trung tâm nghiên cứu Nestlé - Switzerland đã thông báo phương pháp phân tích clenbuterol trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (với qui trình chiết mẫu bằng acid HClO 4 ) với LOD đạt 0,01 ppb, hiệu suất thu hồi đạt 63-70%. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước - Việc phân tích clenbuterol, salbutamol tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam vào năm 2006 chủ yếu được thực hiện với phương pháp ELISA (dựa vào phản ứng kháng nguyên - kháng thể) [6] . Tuy nhiên, phương pháp này chủ yếu có tính sàng lọc và có thể cho kết quả dương tính giả. Theo quyết định 2002/657/ EC của châu Âu, một phương pháp sàng lọc, dù đã được chứng minh có thể áp dụng được cho đối tượng kiểm nghiệm, vẫn phải được xác minh lại bằng một phương pháp có tính khẳng định hơn nếu nghi ngờ về kết quả. - Năm 2007, Phạm Xuân Viết và cộng sự [16] , Trường Đại Học Dược Hà Nội đã nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, một tứ cực, để định lượng salbutamol trong huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol ở các nồng độ 10, 75, 200ppb khoảng 80%. - Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM đã nghiên cứu và xây dựng qui trình phân tích clenbuterol bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD đối với TACN là 0,16 ppb (clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD đối với thịt là 0,05 ppb (clen), 0,07 ppb (sal) báo cáo đề tài cấp thành phố năm 2008. - Năm 2009, Bùi Quốc Anh (công ty Inotech – Thành phố Hồ chí Minh) nghiên cứu đề tài bộ kit phát hiệ n nhanh chất clenbuterol trong thịt gia súc gia cầm trong thời gian 2 giờ. Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp định tính dựa trên sự biến đổi màu của thuốc thử. Năm 2010, Nguyễn Thị Chân và cộng sự [2] thuộc trung tâm phân tích và thí nghiệm TPHCM, đã nghiên cứu đề tài “ Xác định clenbuterol trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS) ” giới hạn phát hiện LOD = 0,03ppb. Nhóm nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị và do đó không tận dụng được ưu thế của loại nội chuẩn nầy. Trang 4 1.2. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ β-agonists 1.2.1. Clenbuterol - Công thức phân tử : C 12 H 18 Cl 2 ON 2 - Khối lượng phân tử: 276,0796 đvC - Công thức cấu tạo Cl Cl H 2 N NH OH - Tên gọi: 2–(tert–butylamino)–1–(4–amino–3,5–dichlorophenyl)ethanol Trong y học, clenbuterol có tác dụng làm dãn phế quản, dãn cơ trơn ở cuống phổi, clenbuterol còn là dược phẩm được chỉ gây tổn định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như: hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người. Trong thú y, clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứ ng đường hô hấp ở ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu, bò, Thuốc có thể thải dần qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài. 1.2.2. Salbutamol - Công thức phân tử: C 13 H 21 O 3 N - Khối lượng phân tử: 239,152 đvC - Công thức cấu tạo: HO HO NH OH - Tên gọi: 2–(tert–Butylamino)–1-(3–hydroxyethyl–2–hydroxyphenyl)ethanol Salbutamol được ứng dụng trong y học để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu nghiệm. Thuốc điều trị bệnh hen suyễn có chứa salbutamol có nhiều trên thị trường trong nước cũng như trên thế giới. Tác dụng của clenbuterol và salbutamol lên động vật nuôi và người Clenbuterol và salbutamol tích lũy trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,… 1.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Thiết bị gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) và phần điều khiển và xử lý số liệu (data processor). Bộ phân tích khối ba tứ cực Với hệ thống ba tứ cực, chế độ vận hành rất phong phú, cho phép có nhiều thông tin hữu ích trong phân tích, thí dụ có thể chạy Full Scan, SIM, Full Scan MS/MS hay Product ion, SRM (Selected Reaction Monitoring). Trang 5 1.4. Quy trình định tính và định lượng β- agonists (salbutamol và clenbuterol) Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol và clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau • Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu) • Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích • Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích. Trang 6 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị và hóa chất 2.1.1. Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm: • Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động • Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI và APCI • Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck) • Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký 2.1.2. Hóa chất và dung dịch thử • Nước cất 2 lần khử ion, CH 3 OH loại HPLC; H 3 PO 4 , p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC và K 2 HPO 4 , p.a (pure analysis); Dung dịch thử K 2 HPO 4 0,1M • Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H 2 O (0,1% HCOOH) (v/v) 2.1.3. Chất chuẩn và nội chuẩn • Clenbuterol hydrochloride, Dr. Ehrenstorfer, 95% (C 12 H 18 Cl 2 ON 2 ,HCl) • Clenbuterol–d 9 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C 12 H 9 D 9 Cl 2 ON 2 ). • Salbutamol sulfate, Dr. Ehrenstorfer, 99 % (C 13 H 22 O 3 N, ½ H 2 SO 4 • Salbutamol–d 3 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C 13 H 19 D 3 O 3 N). 2.2. Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS. 2.2.1 Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (Sử dụng chế độ Full scan) Để đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của thiết bị LC-MS/MS trong phân tích vết clenbuterol (clen) và salbutamol (sal), cần phải tối ưu hóa các thông số vận hành của máy. Quá trình khảo sát gồm các bước sau: - Chuẩn bị dung dịch của riêng từng chấ t sal sulfate, clen hydrochloride, sal-d 3 , clen-d 9 . Các dung dịch đều có nồng độ 10ppb. Trên phần mềm Xcalibur, chọn các thông số thích hợp: Điều chỉnh khoảng khối lượng nguyên tử cần quét để thu được đủ số ion cần thiết cụ thể từ 50 đến 400 Da 2.2.2. Khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ SRM: Selected Reaction Monitoring) ─ Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm clen, sal với nồ ng độ mỗi chất khoảng 10ppb. ─ Điều chỉnh năng lượng phân mảnh tiền ion (tính theo volt, thực chất là eV), mỗi lần tăng lên hoặc giảm xuống một hoặc hai đơn vị cho đến khi nào độ nhạy tức cường độ mũi sắc ký, không tăng nữa thì dừng lại. 2.2.3. Khảo sát nhiệt độ ống mao quản ─ Chọn nhiệt độ cần kh ảo sát cho ống mao quản, bắt đầu khảo sát ở nhiệt độ 300 o C. ─ Điều chỉnh nhiệt độ tăng dần, mỗi lần tăng lên 25 o C đến khi nào độ nhạy không tăng nữa thì dừng lại. Sau khi cài đặt nhiệt độ, tiêm trực tiếp hỗn hợp dung dịch chuẩn 10ppb vào hệ thống MS/MS Trang 7 2.2.4. Khảo sát chương trình dung môi 2.2.4.1. Khảo sát theo chương trình đẳng dòng Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn của 2 chất clen, sal với nồng độ khoảng 5ppb được pha trong pha động là MeOH:H 2 O (10:90). ─ Tiến hành phân tích hỗn hợp dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị với các thông số đã tối ưu hóa, dùng cột sắc ký C18 và pha động chạy HPLC theo chương trình đẳng dòng (tốc độ dòng 0,5ml/phút) 2.2.4.2. Khảo sát thành phần pha động theo chương trình gradient Với tốc độ dòng đã chọn, tiến hành khảo sát chương trình gradient dung môi bằng cách phân tích hỗn hợp dung dịch chuẩn 5ppb clen và sal đã chuẩn bị. Tính độ phân giải R S và hệ số đối xứng A S theo công thức sau. 21 12 0,5( ) RR S tt R WW − = + với 2 R t : thời gian lưu của chất phân tích 2 (clenbuterol) 1 R t : thời gian lưu của salbutamol chất phân tích 1 (salbutamol) 1 b W : chiều rộng đáy của mũi sắc ký của chất phân tích 1 2 b W : chiều rộng đáy của mũi sắc ký của chất phân tích 2 Yêu cầu : R S ≥ 1,3 ( khi R S < 1 cần thay đổi các thông số thực nghiệm) S b A a = với b: độ dài của phân nửa đoạn bên phải của đường ngang vẽ ở 10% chiều cao mũi sắc ký a: độ dài của phân nửa đoạn bên phải của đường ngang vẽ ở 10% chiều cao mũi sắc ký Yêu cầu : Mũi sắc ký được chấp nhận khi 0,9 < A S < 1,2 2.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây dựng đường chuẩn Do clen và sal bị cấm không được có theo tiêu chuẩn Việt Nam nên phần đánh giá khoảng tuyến tính cần khảo sát với khoảng nồng độ sal, clen ≤ 200μg/L (ppb). Với các mẫu có nồng độ C o (nồng độ cuối khi tiêm vào máy) vượt quá 200μg/L, cần giảm lượng mẫu cân. Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, bình phương hệ số tương quan lớn hơn 0,99. Dung dịch chuẩn được pha chế từ chuẩn gốc có nồng độ clen:118 ppm, sal: 189ppm 2.3. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu. 2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại clen, sal và nội chuẩn đồng vị trên c ột SCX. ─ Bước 1: Chuẩn bị 6 ống ly tâm nhựa 50ml. Mỗi ống ly tâm chứa: 0,1ml hỗn hợp nội chuẩn (sal-d 3 : 4ppb; clen-d 9 : 2ppb) + 0,1ml hỗn hợp chuẩn gồm (sal: 7,763 ppb; clen: 1,981ppb) + 10ml K 2 HPO 4 0,1M có giá trị pH tương ứng trong 6 ống ly tâm lần lượt là 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5. Lắc (vortex) các ống ly tâm ─ Bước 2: Chuẩn bị cột SPE (Strata-SCX), hoạt hóa mỗi cột SPE bằng 6ml MeOH, 6ml H 2 O khử ion, 6ml đệm K 2 HPO 4 0,1M có pH ứng với pH ở bước 1. ─ Bước 3: Cho tất cả dung dịch ở bước 1 lên cột SPE, (dung dịch chảy chậm qua cột với tốc độ 1ml/1 phút). Trang 8 ─ Bước 4: Rửa cột SPE lần lượt bằng 3ml nước, 3ml hỗn hợp MeOH:H 2 O (10 : 90), rút chân không đến khô ─ Bước 5: Rửa giải chất cần phân tích bằng 5ml hỗn hợp MeOH : NH 4 OH đđ (95:5). Sau đó thổi khô dịch rửa giải dưới dòng khí nitơ. ─ Bước 6: Hút chính xác 1mL pha động là: MeOH:H 2 O (15:85), cho vào ống nghiệm đã thổi khô. ─ Bước 7: Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm và tiêm mẫu vào thiết bị LC-MS/MS với các thông số đã được tối ưu hóa. 2.3.2. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal. Sử dụng các thông số kỹ thuật đã được tối ưu hóa của hệ thống LC/MS/MS để khảo sát độ lặp lại củ a tín hiệu đo trên 6 lần lặp lại, khi thêm 1ml chuẩn clen nồng độ 0,495ppb, chuẩn sal nồng độ 0,776 ppb, (chứa nội chuẩn xác định clen-d 9 và sal-d 3 ) vào mẫu trắng, tách chiết, làm sạch và định mức cuối cùng là 1ml với pha động. Các đại lượng thời gian lưu trung bình R t , độ lệch chuẩn trung bình (RSD%) được xác định dựa trên kết quả phân tích và được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel. 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích Trong phân tích LC-MS/MS, nền mẫu có thể ảnh hưởng lớn trên kết quả phân tích ở hai giai đoạn: chuẩn bị mẫu (hiệu suất tách chiết giảm) và định lượng trên đầu dò khối phổ (hiệu suất tạo ion), nên có hiện tượng khử ion. Một cách khắc phục hiệu ứng không tốt của nền mẫu là dùng nội chuẩn đồng vị. Do chuẩn và nội chuẩn có thời gian lưu xem như bằng nhau, ảnh hưởng của nền mẫu trên chuẩn và nội chuẩn trong hai giai đoạn chuẩn bị mẫu và định lượng trên đầu dò khối phổ về nguyên tắc là giống nhau. Với clen và sal, nội chuẩn đồng vị lần lượt là clen-d 9 và sal-d 3 . Để định lượng clen và sal, đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu như sau: - Nội chuẩn có cùng nồng độ, chất phân tích có nồng độ khác nhau, được thêm vào những lượng mẫu trắng bằng nhau trước khi xử lý. - Mẫu được xử lý trong những điều kiện giống nhau, thể tích định mức và thể tích dung dịch bơm vào máy cũng giống nhau. 2.3.4. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu Trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích, cần thiết phải xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu (thịt và TACN) biểu thị mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích pic ion định lượng clen (m/z 203,01) và clenbuterol-d 9 (m/z 204,01), tỉ lệ diện tích ion định lượng sal (m/z 148,10) và sal-d 3 ( m/z 151,15) thu được theo nồng độ chuẩn clen, sal tương ứng. Việc xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu giúp xác định hiệu suất thu hồi một cách chính xác hơn. Trang 9 )(, 1 0 Vm C X × = 2.3.5. Xác định hiệu suất thu hồi Xác định hiệu suất thu hồi của clen và sal trên mẫu trắng, trên nền thịt, TACN, gan Chuẩn bị dung dịch chuẩn: 1ml dung dịch chuẩn sal và clen trong MeOH ở các nồng độ khác nhau: Clen: 0,1; 0,25; 0,5; 1; 10; 20 ; 50; 100 μg/L (ppb) Sal: 1,6 ; 4; 10; 50; 100 ; 155 μg/L (ppb) Sử dụng mẫu trắng Chuẩn bị các mẫu thịt (gan) và thức ăn chăn nuôi, mỗi mẫu 2g, cho vào các ống ly tâm nhựa dung tích 50mL. Bổ sung các dung dịch chuẩn sao cho nồng độ mỗi chất trong mẫu từ 0,05 - 75 μg/L (ppb) theo dãy nồng độ đã nêu, (thực hiện 03 lần), để yên 1 giờ. Sau đó, tách chiết làm sạch (chọn pH = 6,0 ở bước 2). Yêu cầu : Độ lệch chuẩn (RSD%) tính theo diện tích pic sắc kí của 03 lần thực hiện riêng biệt trên cùng một nồng độ phải nhỏ hơn 10 %. • Hiệu suất thu hồi trên các nền mẫu khác nhau phải đáp ứng quy định của châu Âu (theo 2002/657/EC): • Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm được tính theo công thức sau: Trong đó: - X: nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L - C o : nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, μg/L - 1: Thể tích định mức 1 mL - m: khối lượng mẫu (g) hoặc (V) thể tích mẫu phân tích, (mL) 2.4. Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (LOD, LOQ) Thêm dung dịch chuẩn sal, clen vào mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu thịt (mẫu trắng) sao cho hàm lượng các chất có trong mẫu khá nhỏ. Xử lý mẫu và thực hiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS theo các điều kiện đã chọn. Tìm nồng độ chuẩn trong nền mẫu tối thiểu của clen và sal (C min Clen và C min Sal ) sao cho sau khi tách chiết và làm sạch (clean up) và tiêm vào máy với thể tích 25 μL dung dịch, mũi sắc đồ khối có cường độ T đáp ứng được điều kiện: 315 S T N <= < Với: S là cường độ tín hiệu, N là nhiễu nền Giới hạn phát hiện của phương pháp C min được tính theo công thức: min 3 C LOD T = Giới hạn định lượng được tính theo công thức: LOQ ≈ 3 x LOD 2.5. Thực nghiệm nuôi gà lấy mẫu - Kiểm tra dư lượng của clen và sal trong mẫu thử nghiệm 2.5.1. Phương tiện thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành trên 24 gà nòi lai (12 gà nòi mái và 12 gà nòi trống) có trọng lượng 0,6 ± 0,1kg trong thời gian 21 ngày Thức ăn và khẩu phần thí nghiệm: Thức ăn được mua một lần tại địa điểm bán thức ăn vào đầu thí nghiệm, phối hợp thành một khẩu phần cơ sở, các nghiệm thức được bổ sung [...]... dõi Tiêu tốn thức ăn (g/ngày) Hệ số chuyển hóa thức ăn: xác định bằng cách chia tổng số thức ăn trong kỳ thí nghiệm cho tăng trọng Dư lượng của clenbuterol và salbutamol trong thịt, gan và thận heo sau thời gian thử nghiệm 2.7 Điều tra tình hình sử dụng clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi, thịt heo, thịt gà ở thành phố Cần thơ, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Hậu Giang trong thời gian 3 năm từ... ractopamine được cho phép dùng trong một số nước, mở rộng vào các đối tượng gia súc gia cầm khác, đồng thời đánh giá mức độ tồn lưu của chúng theo thời gian tính từ lúc ngừng không cho gia súc, gia cầm ăn thức ăn có chứa β-agonist • Chúng tôi mong rằng phương pháp nầy sẽ được những phòng kiểm nghiệm, nghiên cứu áp dụng trong kiểm tra dư lượng β-agonist trong thức ăn chăn nuôi, gia súc gia cầm nhằm đảm bảo có... gan gà và 8 mẫu thận d Các chỉ tiêu theo dõi - Tiêu tốn thức ăn: lượng thức ăn cho ăn trừ đi lượng thức ăn thừa - Hệ số chuyển hóa thức ăn: tiêu tốn thức ăn / tăng trọng salbut - Dư lượng clenbuterol và salbutamol trong thịt, gan và thận gà sau thời gian thử nghiệmamol và clenbutar 2.6 Thực nghiệm nuôi heo lấy mẫu- Kiểm tra dư ượng của clen và sal trong mẫu thử nghiệm 2.6.1 Phương tiện thí nghiệm Từ ngày... của Châu Âu là 0,1 µg/kg trong thịt và 0,5 µg/kg trong gan Clen tích lũy trong thịt, gan, thận hơi lớn hơn so với sal Với nghiệm thức C, tổng trọng lượng gà sau thí nghiệm khoảng 1,2 kg và với nồng độ trung bình clen và sal trong thịt lần lượt là 117,43 µg/kg và 78,05 µg/kg, cho rằng hàm lượng thịt khoảng 1 kg thì tổng hàm lượng sal và clen trong thịt gà là 195 µg/kg, một hàm lượng quá lớn, ảnh hưởng... hóa thức ăn (HSCTA) Về tăng trọng: Kết quả thí nghiệm chỉ rằng bổ sung clen + sal đã cải tiến được tăng trọng gà rõ rệt (P . các chất β -agonists (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” Nghiên cứu. β -AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỨC ĂN GIA SÚC VÀ DƯ LƯỢNG TRONG THỊT GIA SÚC BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ. Chuyên ngành:
