Nguyễn Hữu Minh – ảnh hưởng của các mức bổ sung bột sắn vào khẩu phần ăn Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) trong nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi bằng máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Đoàn Thị Khang * , Phan Thanh Đạm, Đào Đức Hảo và Dương Thu Anh Bộ môn Phân tích thức ăn và sản phẩm chăn nuôi, Viện Chăn nuôi *Tác giả để liên hệ: TS. Đoàn Thị Khang, Trưởng Bộ môn phân tích thức ăn & sản phẩm chăn nuôi, Viện Chăn nuôi ĐT: (04) 8 385941/ 0912 008346 ABSTRACT Using HPLC for determination of aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) The method used is this study was AOAC (2000). After using colum Mycosep 226 aflazon for cleaning aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) in the samples, the samples was put into HPLC for operation. It showed that: RSD of calibration was acceptable (< 2%) and R 2 (determinant co-fficient) between standard samples and analysed sample was high (0.999). It meant that our laboratory can determine aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) with an acceptable accuracy. Use of AOAC method, we can determine the concentration of aflatoxin in a range from 0.3 to 20 ng/g sample. Key words: HPLC, materials, animal feeds Đặt vấn đề Aflatoxin là sản phẩm từ loài nấm độc có tên là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, những loài nấm mốc có khả năng sinh độc này tồn tại, phát triển trong hạt ngô, đậu, lạc, hạt gòn… Điều kiện tốt nhất cho loài nấm mốc phát triển ở trong kho là 25- 32 0 C và độ ẩm trên 85%. Với hàm lượng aflatoxin 100-400 µg/kg (ppb) đã có khả năng gây bệnh cho các loài vật nuôi như các bệnh về gan, với các con vật nuôi nhỏ thì rất nhạy với aflatoxin, đặc biệt là thuỷ cầm. Chỉ với nồng độ aflatoxin >400 µg/kg (ppb) thì đã có thể gây chết vật nuôi (Van Egmond và cs., 1995). ở Việt Nam với khí hậu nóng, ẩm là điều kiện tốt cho nấm mốc phát triển trên các loại nông sản, thực phẩm. Nó là một nguyên nhân lớn gây giảm sức cạnh tranh của ngành chăn nuôi trong nước. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định độc tố nấm mốc aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 , G 2 bằng máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để đảm bảo chọn lọc được các nguyên liệu sạch đáp ứng xuất, nhập khẩu cũng như phục vụ sản xuất thức ăn trong nước. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ở đây chúng tôi tiến hành xác định aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, với tiêu chuẩn AOAC (AOAC-chapter 19, P.3-5-2000) (Mary W. Truckses. 1990). Dựa vào tính chất phân bố của các độc chất trong pha động và pha tĩnh khác nhau, chúng có sự tương tác khác nhau do đó mà các chất khác nhau sẽ tách ra theo thời gian khác nhau trong cột tách. Sau đó aflatoxin được phát hiện nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 ng/g cho mỗi aflatoxin B1,B2,G1,G2. Dùng đường chuẩn Nguyễn Hữu Minh – ảnh hưởng của các mức bổ sung bột sắn vào khẩu phần ăn của từng loại aflatoxin mà ta tính được nồng độ của chúng, phương pháp đòi hỏi phải sạch mẫu để chạy trên máy sắc ký lỏng. Thông thường người ta dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch để làm sạch mẫu nghĩa là cho mẫu qua cột làm sạch, cột có đặc tính giữ lại aflatoxin trong cột, sau đó dùng accetontril rửa phân giải chất aflatoxin ra (Leo M.L Nollet, 1992). Phương pháp này đỏi hỏi lượng hoá chất rửa giải lớn từ 30 đến 50ml và làm khô mẫu bằng khí nitơ. Dùng mẫu cho chạy trên máy để xác định hàm lượng aflatoxin. ở đây chúng tôi sử dụng cột làm sạch Mycosep # 226 columns có tác dụng ngược lại nghĩa là cột có tác dụng cho độc chất (aflatoxin, zearelerone, deoxynivalenol) đi qua còn giữ lại tạp chất với khả năng thu hồi của cột là 98,4% với aflatoxin và lượng mẫu đem làm khô chỉ có 1ml. Quy trình phân tích Lắc với 100ml accetonitril: H 2 O (9: 1) Làm sạch mẫu bằng cột mycosep #226 Cân 50g mẫu Ly tâm, lấy dịch mẫu (3000 vòng/phút, 10 phút) Được dịch mẫu đã làm sạch Làm khô bằng nitơ Hàm lượng B1, B2, G1, G2 Chạy trên máy HPLC Hoà tan mẫu với 0,1ml trifluoroacetic+ 0,9ml H 2 O: acetone (9: 1) Thiết bị, hoá chất Thiết bị Máy sắc ký lỏng cao áp; Cột tách C 18 ; Cột làm sạch mycosep #226; Đầu dò huỳnh quang; Máy ly tâm chân không. Hoá chất Accetonitril; Methanol; Trifluoroacetic; Acetone Nguyên lý hoạt động Xác định độc chất Aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp với tiêu chuẩn AOAC (AOAC-chapter 19, P.3-5-2000). Dựa vào tính chất phân bố của aflatoxin trong pha động và pha tĩnh khác nhau, chúng có sự tương tác khác nhau do đó mà các chất khác nhau sẽ bị tách ra theo thời gian khác nhau trong cột tách. Sau đó aflatoxin được phát hiện nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 ng/g cho mỗi aflatoxin. Dùng đường chuẩn của từng loại aflatoxin mà ta tính được nồng độ của chúng, phương pháp đòi hỏi phải làm sạch mẫu để chạy trên máy sắc ký lỏng. ở đây chúng tôi sử dụng cột làm sạch Mycosep #226 columns có tác dụng cho độc chất (aflatoxin, zearelerone, deoxynivalenol) đi qua, giữ lại tạp chất với khả năng thu hồi của cột là 98,4% với aflatoxin và lượng mẫu đem làm khô Nguyễn Hữu Minh – ảnh hưởng của các mức bổ sung bột sắn vào khẩu phần ăn là 1ml. Hoà tan mẫu với 0,1ml trifluoroacetic + 0,9ml H 2 O: acetone. Phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp với - Cột tách C18 (250mm, 4,6mm, 5mm)- Tốc độ dòng 0.8ml/phút - Pha động H 2 O: Methanol (3: 2) - Đầu dò huỳnh quang (l ex = 365,l cm =450nm) - Lượng bơm mẫu 20ml - Nhiệt độ cột tách 40 0 C * Đối tượng xác định độc chất là các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi - Khô dầu đậu tương, khô dầu lạc - Cỏ khô, phụ phẩm nông nghiệp - Các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm Kết quả và thảo luận Sắc đồ Aflatoxin Hình 1- Sắc đồ aflatoxin chuẩn được chạy trên máy Qua sắc đồ của aflatoxin chuẩn cho thấy khả năng tách các aflatoxin là rất tốt. Chúng tôi tiến hành chạy 5 lần cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu < 2% và của diện tích peak là <5%. Hình 2- Sắc đồ aflatoxin chuẩn ở các nồng độ khác nhau 5;10; 20ppb 5 ppb 10 ppb 20 ppb Nguyễn Hữu Minh – ảnh hưởng của các mức bổ sung bột sắn vào khẩu phần ăn Tiến hành xây dựng đường chuẩn ở các nồng độ 5; 10; 20ppb để lập đường chuẩn. Qua đó thấy rằng độ tuyến tính các nồng độ khác nhau của các aflatoxin là rất tốt R đều đạt 0,999. Kết qủa này cho thấy rằng sự ổn định của máy HPLC là rất cao. R-Squared = 0.998366 R-Squared = 0.999750 R-Squared =0.998036 R-Squared = 0.998965 Hình 3- Sắc đồ aflatoxin chuẩn ở các nồng độ khác nhau Chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu trên các loại nguyên liệu, thức ăn chăn nuôi và cho kết quả tốt: Khả năng tách peak tốt và hầu như không có peak lạ Nguyễn Hữu Minh – ảnh hưởng của các mức bổ sung bột sắn vào khẩu phần ăn Hình 4- Sắc đồ aflatoxin trong các loại nguyên liệu thức ăn chăn nuôi Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thu hồi của tất cả quá trình phân tích (xác định độ sai số hệ thống của phương pháp) chúng tôi tiến hành chạy mẫu chuẩn (mẫu thêm một lư- ợng chuẩn đã biết 2,5ppb) với 5 lần lặp lại. Từ đó tính được độ lệch trung bình so với giá trị thực tế là ± 10% cho kết quả tốt như phương pháp đưa ra là độ thu hồi từ 90,6 đến 100%. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với TCVN (TCVN 6910: 1: 2001) (2001). Bảng 1: Kiểm tra độ thu hồi khi thêm 2,5ppb của mỗi loại aflatoxin vào nguyên liệu Loại độc chất aflatoxin µg/kg (ppb) Tên mẫu Aflatoxin G 1 Aflatoxin B 1 Aflatoxin G 2 Aflatoxin B 2 Mẫu ngô 0 5.8452 0 2.7451 Bột sắn Afla B 1 Afla G 1 Khô dầu lạc Afla B 1 Afla B 2 Nguyễn Hữu Minh – ảnh hưởng của các mức bổ sung bột sắn vào khẩu phần ăn Mẫu ngô 0 5.7845 0 2.8526 Mẫu ngô + 2,5 ppb 2.3691 8.1454 2.6879 5.0868 Mẫu ngô + 2,5 ppb 2.3731 8.1107 2.7025 5.1577 Mẫu ngô + 2,5 ppb 2.3573 8.1985 2.6316 5.0782 Mẫu ngô + 2,5 ppb 2.3456 8.1756 2.6948 5.2842 Mẫu ngô + 2,5 ppb 2.4157 8.0896 2.7152 5.2017 Bảng 2: Kiểm tra độc tố aflatoxin trong một số mẫu ngô (ppb) Tên độc chất (ppb) Tên mẫu Aflatoxin B 1 Aflatoxin B 2 Aflatoxin G 1 Aflatoxin G 2 Ngô mốc 113.691 11.8674 0 0 Ngô Hà Tây 2.0857 0 0 0 Ngô lưu kho 119.6204 7.2342 0 0 Ngô Hà Nam 19.9089 1.1949 0 0 Ngô hạt Hà Tây 0 0 0 0 Ngô hạt mới thu 0 0 0 0 Ngô hạt Trạm TN 0 0 0 0 Ngô Cty Techna 17.5498 0.8897 1.6903 0 Ngô Bắc Giang 2.6583 0 0 0 Ngô TT Hà Tây 23.3998 1.7714 0 0 Ngô Cty ADO 4.7017 0 0 0 Ngô hat Cty ADO 2.3215 0 0 0 Ngô hạt Cty Techna 0 0 0.2357 0 Ngô hạt Ha Nam 0.3887 0 0 0 Ngô hạt Trạm TN 0 0 0 0 Bảng 3: Thành phần độc chất trong khô đỗ (ppb) Tên mẫu Aflatoxin B 1 Aflatoxin B 2 Aflatoxin G 1 Aflatoxin G 2 Khô đỗ IV2.2 2.2511 0 0 0 Khô đỗ IV1.2 2.9477 0.7843 0 0 Khô đỗ II.1.2 0 0 0 0 Khô đỗ III.2.2 0 0 0 0 Khô đỗ V.1.2 0 0 0 0 Khô dầu lạc 71.5270 12.0177 0 0 Khô đỗ 1963/05 0 0 0 0 Khô đỗ III.1.2 0 0 0 0 Bảng 4: Thành phần độc chất trong thức ăn chăn nuôi (Đơn vị: ppb) Nguyễn Hữu Minh – ảnh hưởng của các mức bổ sung bột sắn vào khẩu phần ăn Tên mẫu Aflatoxin B 1 Aflatoxin B 2 Aflatoxin G 1 Aflatoxin G 2 Cám hỗn hợp C662 37.3161 2.8405 0 0 Cám siêu đậm đặc 15.1783 6.3836 0 0 Cám hh lợn thịt 13.2508 0 0 0 TĂ cho gà đẻ 23.4333 1.9762 0 0 HH lợn thịt 0 0 0 0 TĂ tinh 714 11.5310 0 0 0 TĂ tinh 785 8.5409 3.0480 0 0 Cám hh 185/nc 31.3321 2.6799 0 0 Cám hh H225 23.7780 2.1036 0 0 TĂ cho đà điểu 559/nc 16.2412 3.0576 0 0 TĂ cho đà điểu 561nc 20.3268 0 0 0 TĂ cho cá 0 0 0 1.2436 Thức ăn gia súc 23/6 3.7909 0 0 0 Thức ăn gia súc 43/12 5.935 0 0 0 TĂ chan nuôi 129.1855 13.3154 0 0 TĂ viên M1 11.9982 0 2.2352 0 TĂ viên M2 5.0049 0 0 0 Cám TP1 5.0859 0 0 0 TĂ nuôi chim 0 0 0 0 TĂ cho đà điểu 560nc 15.935 1.941 0 0 TĂ hh lợn 888 0 0 0 0 TĂ hh lợn 808 0 0 0 0 TĂ hh lợn 800 0 0 0 0 TĂ hh lợn 151S 0 0 0 0 TĂ ĐGS 1.1660 0 0 0 Kết luận Đã xây dựng được quy trình tối ưu cho phương pháp xác định độc chất aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 , G 2 trong các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi. Phòng Phân tích đã phân tích được thành phần độc chất aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 , G 2 trong các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi Các thông số kỹ thuật, độ chính xác đều phù hợp với phương pháp phân tích và hãng sản xuất. Tài liệu tham khảo Leo M.L Nollet. 1992. Food analysis by HPLC Mary W. Truckses. 1990. AOAC Methods (17 th Version) 2000 chapter 19,.P: 3 - 5 TCVN 6910:1: 2001 (ISO: 5725-1:1994). 2001. Độ chính xác của phương pháp đo và kết quả đo Van Egmond H.P, Heisterkamp S.H và Paulsh W.E.E.C 1995. Xác định aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi, phụ phẩm và các chất nhiễm bẩn. /. . sắn vào khẩu phần ăn Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) trong nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi bằng máy sắc ký. ăn trong nước. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ở đây chúng tôi tiến hành xác định aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, với tiêu chuẩn AOAC