TèM HIU K THUT NHN SINH KHI T BO SU KHOANG (S. litura) Lờ Vn Trnh SUMMARY Identification of culture technologies on cell propagation of S. litura Some trials to identify necessary factors for insect cell culture of Spodoptera litura have been done in last year. The result of trails had indicated that the medium of Ex-Cell 14420 with 10% FBS was appropriate for development of insect cell culture with density of cells reached to 4,2 x 10 10 cells per mililit. When cell culture with this medium including 10% FBS at pH= 7,0, the density of cells was as 3,6 x 10 10 after six days of culturing. If cells cultured in medium with pH were 6,5 and 7,5, the density of cells was significantly decreased. Among of 5 mediums without FBS have been tested, it was identified that the medium of Ex- Cell 14420 was considered to be most appropriate for cell culture with its density up to 3,2 x 10 10 cell/ml. Keywords: Spodoptera litura, insect cell culture, cell propagation I. ĐặT VấN Đề Cỏc ch phNm sinh hc s dng tỏc nhõn vi rỳt NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) u rt chuyờn tớnh v cú hiu qu cao trong phũng tr sõu khoang núi riờng v cỏc sõu hi cõy trng nụng, lõm nghip núi chung. Tuy nhiờn, cỏc loi vi rỳt ch cú th tn ti, phỏt trin c trong cỏc t bo sng v trong iu kin mụi trng thớch hp. Vỡ vy, vic sn xut ch phNm vi rỳt ũi hi phi c thc hin trờn c th sõu sng hoc trờn cỏc mụ, t bo sõu hi cũn sng. Lõu nay, vic sn xut NPV vn tin hnh theo phng phỏp th cụng, bng cỏch nuụi sõu sng s lng ln, sau ú nhim vi rỳt NPV ca loi sõu tng ng, ri nghin lc v em ra s dng. Theo cỏch ny thỡ sn xut ch phNm NPV tr sõu hi khú cú th thc hin vi qui mụ cụng nghip, vỡ nuụi c s lng ln mt loi sõu hi phc v sn xut ch phNm l mt vn ht sc khú khn v phi cú iu kin v nh xng, trang thit b. ng dng cụng ngh nuụi nhõn sinh khi t bo cụn trựng sn xut ch phNm NPV vi qui mụ cụng nghip ó v ang bt u phỏt trin ti mt s nc trờn th gii. Trong thi gian qua, chỳng tụi ó tỡm hiu theo nh hng ny, kt qu thu c bc u cú nhiu trin vng, m ra nh hng mi trong vic ng dng cụng ngh t bo phỏt trin ch phNm sinh hc bo v cõy trng. II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Vt liu nghiờn cu - Thc liu dũng t bo sõu khoang c phỏt trin t mụ phụi ca sõu khoang. - Cỏc loi mụi trng nuụi nhõn t bo cụn trựng, cỏc loi khỏng sinh c dng (nh Gentamicine, Fujione) v huyt thanh ph tr FBS (fetal bovin serum) trong nuụi nhõn do Cụng ty In-Vitrogen cung cp. - Dng c nuụi cy t bo, nh: Bỡnh nuụi cy lc khuNn loi 25 cm 2 v 75 cm 2 . 2. Phương pháp nghiên cứu Vic nghiên cu k thut nuôi nhân sinh khi t bào ưc tin hành theo phương pháp ca Granados et al. (2007) và Agathos (1994). Các thí nghim ưc tin hành vi các công thc môi trưng có b sung thành phn b tr FBS khác nhau. Nhc li 5 ln, mi ln nhc li là 1 bình. T bào ưc nuôi cy trong bình c vch Corning lc khuNn có din tích 25 cm 2 . Ngun t bào cho thí nghim có hàm lưng 1,5 x 10 7 t bào/ml. Sau 6 ngày nhân nuôi  nhit  n nh tùy theo tng thí nghim. Sau ó, theo dõi mt  t bào trong các ln nhc li. III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 1. Tỷ lệ thành phần huyết thanh bổ trợ cho phát triển tế bào Tin hành thí nghim nuôi nhân t bào sâu khoang trên 2 loi môi trưng có cha các thành phn huyt thanh b tr khác nhau. Kt qu nêu trong bng 1 cho thy khi nuôi nhân t bào trên môi trưng Ex-Cell 14420 có cha 10% cht b tr FBS thì hàm lưng t bào t mc cao nht, t ti 4,2 x 10 10 t bào trong 1 mililit. ng thi, có t l t bào sng t ti 97,2% và t l t bào có hình dng tiêu chuNn t ti 82,3%. Trong khi ó, nu nuôi nhân t bào trong môi trưng Ex-Cell 14420 có cha 10% huyt thanh bò thì cũng t hàm lưng t bào khá cao, ti 3,1 x 10 10 t bào/ml, t l t bào sng t ti 92,5% và t l t bào tiêu chuNn t ưc là 72,6%. Trong khi ó, nu không có 10% cht b tr (FBS hoc huyt thanh bò) mà ch có môi trưng Ex- Cell 14420 thì cũng ch t hàm lưng t bào là 2,7 x 10 10 t bào/ml và t l t bào sng t 96,6% và t l t bào tiêu chuNn t 80,3%. Khi nuôi nhân trên môi trưng Schneider 0146 cũng din ra xu hưng tương t như i vi vic nuôi nhân t bào trong môi trưng Ex-Cell 14420. Khi nuôi nhân t bào trong môi trưng Schneider 0146 có b sung 10% FBS thì hàm lưng t bào t khá cao, lên ti 2,6 x 10 10 t bào/ml và t t l t bào sng ti 95,5% và t l t bào tiêu chuNn ti 78,3%. Còn s dng 10% huyt thanh bò thì hàm lưng t bào t 2,4 x 10 10 t bào/ml và t l t bào sng t 89,1% và t l t bào tiêu chuNn t 65,6%. Nu ch dùng môi trưng nuôi nhân là Schneider 0146 không có 10% thành phn b tr thì ch t hàm lưng 1,2 x 10 10 t bào/ml vi t l t bào sng là 94,5% và t l t bào có hình dng tiêu chuNn ch t 78,0%. Bảng 1. Hàm lượng tế bào sau nuôi nhân trên các môi trường chứa huyết thanh khác nhau (Viện BVTV, 2010) Công thức Môi trường nuôi nhân Hàm lượng tế bào (tb/ml) % tế bào sống % tế bào tiêu chuẩn 1 Ex-Cell 14420 chứa 10% FBS 4,2 x 10 10 d 97,2 82,3 2 Ex-Cell 14420 chứa 10% huyết thanh bò 3,1 x 10 10 c 92,5 72,6 3 Schneider 0146 chứa 10% FBS 2,6 x 10 10 b 95,5 78,3 4 Schneider 0146 chứa 10% huyết thanh bò 2,4 x 10 10 ab 89,1 65,6 5 Ex-Cell 14420 (Đ/c 1) 2,7 x 10 10 b 96,6 80,3 6 Schneider 0146 (Đ/c 2) 1,2 x 10 10 a 94,5 78,0 Bng 1 cho thy, môi trưng Ex-Cell 14420 có cha 10% thành phn b tr là FBS hoc huyt thanh bò  nuôi nhân t bào sâu khoang là rt thích hp hơn so vi môi trưng Schneider. Vi các môi trưng này vic nuôi nhân t bào sâu khoang có th cho phép t tương ng là 3,1 x 10 10 và 4,2 x 10 10 t bào/ml. Tuy nhiên, trong thc t nu s dng huyt thanh bò s găp nhiu khó khăn trong vic m bo tiêu chuNn cht lưng n nh. 2. Điều kiện pH của môi trường nuôi nhân iu kin pH ca môi trưng nhân nuôi có nh hưng rt ln n kh năng phát trin ca t bào. Theo Freshney (1987) và Weiss et al. (1981), hu ht các loi t bào côn trùng trong quá trình phát trin s lưng u yêu cu pH môi trưng  mc trung tính. Nu iu kin ca môi trưng ch t pH ≤ 6,0 kt hp vi nhit  nuôi cy thp ≤ 20 0 C thì các enzym tái t hp không hot ng và quá trình phân chia t bào không din ra. Ngưc li, nu pH cao (pH ≥ 7,2) kt hp nhit  ≥30 0 C thì quá trình phân chia t bào b c ch vì các enzym b phân rã. Nghiên cu kh năng phát trin s lưng t bào trong iu kin pH môi trưng nuôi nhân khác nhau và ưc iu chnh trưc khi nuôi nhân bng NaOH. T bào ưc nuôi cy trong môi trưng Ex- Cell 14420 và Schneider có cha 10% thành phn b tr FBS. Ngun t bào khi ưa vào thí nghim có hàm lưng 2,1 x 10 6 t bào/ml theo t l dch t bào và môi trưng là 1: 3. Kt qu thu ưc sau 6 ngày nhân nuôi (Bng 2) cho thy khi pH môi trưng nuôi nhân là 7,0 hoc 7,5 thì hàm lưng t bào tăng lên rõ rt  c 2 loi môi trưng. Vi môi trưng nuôi nhân là Ex-Cell 14420 có hoc không b sung FBS thì sau 6 ngày  iu kin pH = 6,5 t hàm lưng t bào tương ng là 6,9 x 10 9 và 5,9 x 10 9 t bào/ml. Nhưng khi nuôi nhân  môi trưng pH = 7,0 thì hàm lưng t bào tăng lên mt cách áng k, t ti 3,6 x 10 10 và 3,2 x 10 10 t bào/ml (tương ng) và khi pH = 7,5 thì mt  t bào có gim i, t 1,2 x 10 10 và 1,0 x 10 10 t bào/ml (tương ng) Còn vi môi trưng nuôi nhân t bào là Schneider 0146 thì hàm lưng t bào  pH môi trưng là 7,0 và 7,5 cũng cao hơn áng k so vi hàm lưng t bào thu ưc khi nuôi nhân  môi trưng có pH = 6,5. Tương ng vi pH = 6,5 thì hàm lưng t bào  môi trưng Schneider có thêm 10% FBS là 1,4 x 10 9 t bào/ml và không b sung thêm 10% FBS là 1,0 x 10 9 t bào/ml. Khi nuôi nhân bng môi trưng này có b sung 10% FBS  pH = 7,0, thì sau 6 ngày hàm lưng t bào t ưc là 2,1 x 10 9 t bào/ml và  môi trưng không có FBS thì hàm lưng t bào t ưc là 1,3 x 10 9 t bào/ml. Khi pH = 7,5 thì s liu tương ng là 0,8 và 0,7 x 10 10 t bào/ml. Như vy, tùy theo tng loi môi trưng nuôi cy khác nhau hàm lưng t bào thu ưc có khác nhau, nhưng iu kin pH ca môi trưng nuôi nhân thích hp là 7,0. iu này cũng phù hp vi công b ca Freshney R. (1987). Bảng 2. Hàm lượng tế bào thu được khi môi trường nuôi nhân có pH khác nhau (Vin BVTV, 2010) Công thức Môi trường nuôi nhân Hàm lượng tế bào (tb/ml) pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 7,5 1 Ex-Cell 14420 + 10% FBS 6,9 x 10 9 3,6 x 10 10 1,2 x 10 10 2 Ex-Cell 14420 5,6 x 10 9 3,2 x 10 10 1,0 x 10 10 3 Schneider 0146+ 10% FBS 1,4 x 10 9 2,1 x 10 10 0,8 x 10 10 4 Schneider 0146 1,0 x 10 9 1,3 x 10 10 0,7 x 10 10 3. Môi trường thích hợp cho nuôi nhân tế bào sâu khoang Tin hành ánh giá kh năng phát trin sinh khi t bào  các môi trưng khác nhau không có 10% huyt thanh b tr FBS. Kt qu theo dõi nêu  bng 3 cho thy  nhit  nuôi nhân là 27 0 C t bào phát trin tt  môi trưng Ex- Cell 14420 t ti mt  3,02 x 10 10 t bào/ml, sau ó là môi trưng Schneider 0146 t mt  1,46 x 10 10 t bào/ml. Vi các môi trưng IPL-41; TNM- FH và môi trưng TC-100 cho hiu qu nhân sinh khi t bào thp hơn, vi mt  t bào tương ng là 1,60 x 10 9 ; 1,68 x 10 9 và 0,96 x 10 9 t bào/ml. Bảng 3. Mật độ tế bào ở các môi trường nuôi nhân khác nhau (Viện BVTV, 2010) Công thức thí nghiệm Môi trường nuôi nhân Mật độ tế bào sau 6 ngày nuôi nhân (tế bào/ml) 1 Ex- Cell 14420 3,02 x 10 10 c 2 Schneider 0146 1,46 x 10 10 d 3 IPL- 41 1,60 x 10 9 b 4 TNM- FH 1,68 x 10 9 b 5 TC-100 0,96 x 10 9 a Như vy, trong s 5 loi môi trưng tham gia thí nghim, khi nhân nuôi t bào  Ex- Cell 14420 nhit  27 0 C thì môi trưng Ex- Cell 14420 cho hiu qu nhân sinh khi t bào tt nht. Sau ó là môi trưng Schneider 0146. Còn các môi trưng IPL-41; TNM-FH và TC-100 cho hiu qu thp hơn hn. Kt qu thí nghim này cũng chng t vic b sung huyt thanh b tr là cn thit giúp cho quá trình phát trin sinh khi ca t bào sâu khoang t hiu qu cao như ca Granados và Mc Kenna (1995) ã ch rõ. IV. KÕT LUËN 1. Khi nuôi nhân t bào trên môi trưng Ex-Cell 14420 có cha 10% cht b tr FBS thì hàm lưng t bào t mc cao nht, t ti 4,2 x 10 10 t bào trong 1 mililit, t l t bào sng t ti 97,2% và t l t bào có hình dng tiêu chuNn t ti 82,3%. 2. Vi môi trưng nuôi nhân là Ex- Cell 14420 có hoc không b sung FBS thì sau 6 ngày  iu kin pH = 6,5 t hàm lưng t bào tương ng là 6,9 x 10 9 và 5,9 x 10 9 t bào/ml. N hưng  môi trưng pH = 7,0 thì hàm lưng t bào t ti 3,6 x 10 10 khi có b sung 10% FBS và t 3,2 x 10 10 t bào/ml nu không b sung 10% FBS và khi pH = 7,5 thì mt  t bào gim i, ch t 1,2 x 10 10 và 1,0 x 10 10 t bào/ml (tương ng). 3. Trong s 5 loi môi trưng tham gia thí nghim, thì môi trưng Ex- Cell 14420 t cao nht, ti mt  3,02 x 10 10 t bào/ml. Sau ó là môi trưng Schneider 0146, t 1,46 x 10 10 t bào/ml. Các môi trưng IPL- 41; TN M- FH và môi trưng TC-100 cho hiu qu nhân sinh khi t bào thp hơn, vi mt  t bào tương ng là 1,60 x 10 9 ; 1,68 x 10 9 và 0,96 x 10 9 t bào/ml. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Viện Bảo vệ thực vật. 2001. Báo cáo tng kt  tài khoa hc cp Nhà nưc KHCN.02.07B (1996-2000): Nghiên cu áp dng công ngh vi sinh (vi khuNn, vi nm, virut)  sn xut ch phNm sinh hc BVTV trong phòng tr sâu hi cây trng. 134 trang. 2. Việt H. T., Cảm .V. và nnk. 2002. Mt s kt qu nghiên cu v N PV (N uclear Polyhedrosis Virus) và kh năng s dng trong phòng tr sâu hi cây trng. Tuyn tp công trình nghiên cu bo v thc vt 2000- 2002. N XB N ông nghip, Hà N i, Trang 113- 130. 3. Agathos S.. 1994. Large scale insect cell production. Book: Inscet Cell Biotechnology by Editors: Maramorosch K. and Mclntosh. CRC Press, Tokyo. Pg. 89- 103. 4. Elanchezyan K. 2009. Insect cell culture and biotechnology. Current Biotica. Vol.3. N o.3. 2009. Tamil N adu Agriculturl University Publising House. Pg. 458- 489. 5. Freshney R. 1987. Culture of animal cell. Manual of basic technique. Second edited; Wiley- Liss, N ew York. 397 pages. 6. Granados R.R. and Mc Kenna K.A. 1995. Insect cell culture methods and their use in virus research. Baculorvirus expression systems and biopesticides. Editors: Shuler M.L., Wood H.A., Granados R.R., Hammer D.A. Wiley - Liss, Inc. N ew York. 1995. Pg. 13-40. 7. Maiorella B., Inlow D., Shauger A. Ad Harano D. 1988. Large scale insect cell culture for recombinant protein production. Biotechnology Journal. N o. 6 (1988). Pg. 1406-1410 8. Weiss S.A., Smith G.C., Kalter S.S. and Vaughn J.L. 1981. Improved method for the production of insect cell cultures in large volume. In Vitro Jounal. N o. 17. Pg. 495- 502. Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Vấn T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 . thanh bò  nuôi nhân t bào sâu khoang là rt thích hp hơn so vi môi trưng Schneider. Vi các môi trưng này vic nuôi nhân t bào sâu khoang có th. (Viện BVTV, 2010) Công thức Môi trường nuôi nhân Hàm lượng tế bào (tb/ml) % tế bào sống % tế bào tiêu chuẩn 1 Ex-Cell 14420 chứa 10% FBS 4,2