T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 1 KẾT QUẢ CHỌN TẠO DÒNG NGÔ NẾP THUẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BAO PHẤN Đinh Công Chính 1 , Bùi Mạnh Cường 2 , Trần Đình Long 3 , Đoàn Thị Bích Thảo 2 , guyễn Thị Thu Hoài 2 , guyễn Thiện Huyên 4 SUMMARY Results on Development of Inbred Lines of Waxy Corn by Double Haploid using Anther Culture Technology Development of inbred lines of waxy corn by double haploid using anther culture technology was undertaken in the ational Maize Research Institute of Vietnam, based on 8 Vietnamese landraces, 5 hybrids imported from China, 17 hybrids from Thailand. Results showed that rate of embryo formation, plant regeneration and fertile plants in waxy corn was lower than that of field corn. Percentage of fertile plants was highest in anther cultured germplasm from Thailand, at 7.87%, which resulted in 105 waxy corn lines. Among these lines, 36 lines accounted for 34.9% were agronomically acceptable, good tolerant to abiotic stresses and yielded over 20 quintals per hectare. Especially lines developed from local germplasm had low yield but showed well performance under drought condition. This waxy corn inbred line nurseries have met requirement for analysis of genetic diversity and development of waxy corn hybrids. Keywords: Anther culture, waxy corn inbred lines, plant regeneration, embryo formation, fertile plants. I. §ÆT VÊN §Ò Xây dựng tập đoàn dòng thuần phục vụ công tác chọn tạo giống ngô lai nói chung có vai trò hết sức quan trọng. Trước đây, công tác chọn tạo dòng thuần chủ yếu dựa vào phương pháp chọn tạo truyền thống, những năm cuối thế kỷ 20 được bổ sung phương pháp tạo dòng đơn bội kép (Bùi Mạnh Cường và cs., 1996; 1998; Lê Huy Hàm và cs., 2003, 2005; Buter B và cs., 1994). Phương pháp này rất có hiệu quả trong chọn tạo dòng thuần nhờ những ưu điểm nổi bật như rút ngắn thời gian tạo dòng, tạo ra cá thể có tỷ lệ đồng hợp tử cao về kiểu gen (Bùi Mạnh Cường và cs., 1996, 1998). Do vậy, được áp dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam (Buter B, 1997; Chalyka S.T,1999; Gaillard A và cs., 1991; Genovesi, A.D và cs., 1990). Ở nước ta, phương pháp này được áp dụng chủ yếu trên đối tượng ngô tẻ. Còn ở ngô nếp, ngô đường thì chưa có công trình nào đề cập đến, vì vậy, trong bài báo này chúng tôi muốn trình bày một số kết quả 1 Cục Trồng trọt-Bộ Nông nghiệp và PTNT; 2 Viện Nghiên cứu Ngô; 3 Hiệp hội Giống cây trồng Việt Nam; 4 Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam 2 chn to dũng ngụ np thun bng phng phỏp nuụi cy bao phn. II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Vt liu nghiờn cu - Thớ nghim c tin hnh trờn 8 qun th np a phng ó c chn lc vi cỏc tớnh trng tt nh chng , chu hn, bnh, cht lng ngon, bao gm: Np M105, np Mốo Vc, np Nự Tõy Ninh, np trng Cũ Nũi, np Cao Lc, np Phỳ Lng 1, 2, 3 c bo qun v duy trỡ ti qu gen ca Vin Nghiờn cu Ngụ. 5 ging ngụ np lai nhp ni t Trung Quc: You 1, You 2, You 3, You 4, You 5 v 17 ging np lai nhp ni t Thỏi Lan: SW 226-SW290 v 4 t hp lai kộp gia cỏc vt liu trờn. + Mụi trng nuụi cy: Thớ nghim tin hnh trờn h thng mụi trng: - Mụi trng to cu trỳc phụi (M1): YP + 400 mg/l Cazein hydrolysate + 0,1 mg/l TIBA + 100 mg/l L.Proline + 90 g/l ng sucrose + 5 g/l than hot tớnh. - Mụi trng tỏi sinh cõy (M2): MS + 2,0 mg/l Kinetin + 30 g/l ng sucrose + 100 mg/l mio-inositol. - Mụi trng ra r to cõy hon chnh (M3): 1/2MS + 1,5 mg/l NAA + 30 g/l ng sucrose +100 mg/l mio-inositol + 5 g/l than hot tớnh. - Mụi trng ra ngụi: Giỏ th tru hun + 1/10 MS. 2. Phng phỏp nghiờn cu - Tt c cỏc vt liu trc khi s dng trong nuụi cy u c lai vi dũng cm ng AC24. - X lý mu (c) nhit 10 0 C trong 10-14 ngy, khụng cú ỏnh sỏng. Soi bo t di kớnh hin vi, chn on c cú bo t phỏt trin giai on hai nhõn sm. Kh trựng mu c bng dung dch HgCl 2 0,05%. Tỏch ly bao, cy vo mụi trng to cu trỳc phụi (M1) trong a petri. Cỏc cu trỳc phụi t kớch thc t 1-2 mm c cy chuyn sang mụi trng tỏi sinh (M2). Cõy tỏi sinh cú cỏc b phn thõn lỏ, cao khong 1-2cm c cy chuyn sang mụi trng to cõy hon chnh (M3). Cõy kho mnh cú y b phn thõn, lỏ, r c luyn trong iu kin mụi trng thớch hp v tin hnh ra ngụi trờn nn giỏ th tru hun + 1/10 dung dch MS. Sau 7- 10 ngy khi cõy ra r mi, tin hnh chuyn cõy trng ra t. Chm súc v ỏnh giỏ kh nng sinh trng, phỏt trin ca dũng mi c to ra: c im hỡnh thỏi, t l hu th, s cõy cho thu hoch, s cõy d dng, III. KếT QUả Và THảO LUậN 1. T l to phụi, tỏi sinh cõy v cõy hu th ca cỏc vt liu T l to phụi, tỏi sinh cõy, cõy hu th c túm tt bng 1, 2, 3, 4: 8 ngun vt liu a phng a vo nuụi cy to dũng trong 2 v thu 2008 v xuõn 2009 cú t l to phụi trung bỡnh trong v thu l 2,79%, v xuõn 4,75%; t l tỏi sinh cõy trong v thu 7,26% v v xuõn 4,14%; nh vy, t l to phụi v xuõn cú xu hng cao hn v thu, xong t l tỏi sinh cõy thỡ ngc li, v thu cú t l cao hn v xuõn, iu ny c lp li 5 ngun vt liu ca Trung Quc vi t l to phụi v thu 3,78% v v xuõn 3,83%, t l tỏi sinh cõy v thu 6,49% v v xuõn 5,21%; 17 ngun vt liu Thỏi Lan: T l to phụi v thu 4,26%, v xuõn 5,43%; t l tỏi sinh cõy v thu 11,84% v v xuõn 9,84%. Trong 8 ngun vt liu a phng ch cú 2 ngun vt liu l np Mốo Vc v np Phỳ Lng 2 cú t l cõy hu th cao T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 3 lần lượt 11,3% và 21,3%. Tổng số dòng tạo mới từ 2 nguồn vật liệu này là 25 dòng, trong đó nếp Mèo Vạc 4 dòng và Phú Lương 2 là 21 dòng. Căn cứ vào tiêu chuNn ánh giá dòng chn ưc 8 dòng có kh năng s dng trong ó np Mèo Vc 2 dòng và Phú Lương 2 6 dòng. Trong 5 ngun vt liu nhp ni t Trung Quc ch có 2 ngun vt liu là You 4 và You 5 cho t l cây hu th cao ln lưt là 8,4% và 14,4%, tng s dòng to mi 37, s dòng t yêu cu 4 (bng 2). i vi 17 ngun vt liu ca Thái Lan có 10 ngun vt liu có t l tái sinh cây hu th cao (bng 3). S dòng to mi 43, s dòng t yêu cu 26. ánh giá chung cho thy (bng 4) t l to phôi trung bình ca các vt liu nhp ni t Thái Lan cao nht t 4,71%, tái sinh cây t 9,71% và t l cây hu th 7,87%, thp nht là vt liu a phương ca Vit N am. Tng s dòng t yêu cu có th s dng trong các thí nghim tip theo là 36 dòng. N u so sánh kt qu trên vi vt liu ngô t cho thy t l to phôi, tái sinh cây, cây hu th u thp hơn, iu này có th do các vt liu chưa ưc chn lc và môi trưng nuôi cy chưa phù hp cn tip tc nghiên cu  hoàn thin. 2. Đặc điểm nông sinh học của các dòng đơn bội kép Trên cơ s 36 dòng ưc to ra t các vt liu bng phương pháp nuôi cy bao phn, chn ra 22 dòng ưu tú  ánh giá c tính nông sinh hc phc v cho các thí nghim tip theo. V thi gian sinh trưng, các dòng có thi gian sinh trưng t 93 ngày (N 17, N 12) n 105 ngày (N 8, N 9) u thuc nhóm chín sm. Các dòng to ra t vt liu a phương có kh năng chu bnh, sâu và hn khá hơn các dòng ưc to ra t các ngun vt liu nhp ni. Các tính trng hình thái, các dòng có chiu cao trung bình t 83cm (N 27) n 165cm (N 8), c dài, nhánh c nhiu. N hìn chung, các dòng có tính n nh cao, th hin qua ch s CV% ca các tính trng cao cây, cao bp, dài c. Trong các tính trng theo dõi thì tính trng s nhánh c có ch s CV% cao nht, bình quân ln hơn 10%. Kt qu trên phn ánh các dòng to ra bng phương pháp nuôi cy bao phn có  thun di truyn tt, có th áp ng cho các thí nghim lai to. 3. ăng suất và yếu tố cấu thành năng suất N ăng sut và yu t cu thành năng sut (bng 5). Các dòng np thun nhìn chung bp ngn. Dòng có chiu dài bp dài nht là N 25 t 11,7cm, dòng có chiu dài bp ngn nht N 1 (7,1cm), ưng kính bp trung bình t 3,5cm, dòng có ưng kính bp ln nht là N 8, N 18 (4,3cm), dòng có ưng kính bp nh nht là N 1 (2,9cm). Tuy nhiên, có 2 yu t cu thành năng sut áng lưu ý là s hàng ht u t t 12-14 hàng ht và t l ht/bp cao, u t trên 80%. ây cũng là 2 yu t khá quan trng quyt nh năng sut dòng. Các tính trng này khá n nh ưc biu hin qua h s CV%. n nh nht là ưng kính bp, s hàng ht và chiu dài bp, v năng sut các dòng np u có năng sut t trên 20 t/ha, tr 2 dòng có năng sut t thp nht là N 1 (11,1 t/ha), N 9 (18 t/ha), dòng t năng sut cao nht là N 17 (34 t/ha), cao tương ương vi dòng to ra t gen pool N 30 (34,2 t/ha).  mt khía cnh nào ó cho thy, tp oàn dòng np có năng sut cao cho phép to ra ging np lai có năng sut t 50 t/ha. IV. KÕT LUËN T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 4 1. Có th ng dng k thut nuôi cy bao phn trong to dòng ngô np thun. N gun vt liu nhp ni t Thái Lan có t l to phôi, tái sinh cây, cây hu th cao hơn vt liu nhp ni t Trung Quc và ngun vt liu bn a ca Vit N am. 2. Tp oàn dòng thun ưc to ra t k thut nuôi cy bao phn có các tính trng nông hc khá n nh, kh năng chng chu khá, năng sut khá cao và n nh, có th s dng trong các thí nghim phân tích a hình di truyn và to ging lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Mạnh Cường, Trần Hồng Uy và cộng sự, 1996. “Kt qu bưc u nghiên cu bao phn”, Tp chí N ông nghip và Công ngh thc phNm, s 403, tr.17-18. Bùi Mạnh Cường, guyễn Hữu Đống và cộng sự, 1998. “N ghiên cu to cây ngô ơn bi kép bng k thut nuôi cy bao phn”, Tp chí N ông nghip và Công ngh thc phNm, s 428, tr.64-65. Lê Huy Hàm, 2003. “N ghiên cu ci tin hiu qu nuôi cy bao phn ngô i vi x lý manitol trong iu kin in vitro” Tp chí Di truyn và ng dng, s 2, tr.10-14. Lê Huy Hàm, guyễn Thị Khánh Vân, 2005. “Phát trin và ng dng k thut ơn bi trong chn to ging ngô ưu th lai”, Khoa hc Công ngh N ông nghip và Phát trin nông thôn-20 năm i mi, N XB. Chính tr Quc gia. Buter B., Jumpatong C., 1994. “Application of the anther culture technique in a corn breeding project in Thailand, Astracts 7 th Intl. Congr. Of plant tissue and cell culture, Firenze, June 12-17:85. Buter B., 1997. “In vitro haploid production in maize” In: “In vitro Haploid production in higher plants”. Kluwer Academic Publishers, Vol. 4: 37-71 Chalyka S.T., 1999. “Use of maternal haploids for improving maize inbred lines”, Maize Gen. Coop. N ewsletter 73: 54-56. Gaillard A., Vergne P., 1991. “Optimisation of maize microspore isolation and culture conditions for reliable plant regeneration” Plant Cell Reports. 10: 55-58. Genovesi, A.D., R.A.Yingling, 1990. “Isolated microspore culture of Zea mays L.” Abstr. 7th Int. Congr. Plant tissue and cell culture IAPTC, Amsterdam, A7-19: 19. gười phản biện: PGS. TS. N guyn Văn Tut T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5 Bảng 1. Tỷ lệ tạo phôi, tái sinh cây, cây hữu thụ từ các vật liệu địa phương (Viện ghiên cứu gô, năm 2007) T T Nguồn gốc Tỷ lệ tạo phôi (%) Tỷ lệ tái sinh (%) Tỷ lệ cây hữu thụ (%) Tổng số dòng T.08 X.09 TB T.08 X.09 TB T.08 X.09 TB Số dòng tạo mới Số dòng sử dụng 1 Nếp M105 4,40 4,00 4,20 4,55 - - - - - - - 2 Nếp Mèo Vạc - 18,5 6 - - 13,1 7 - - 11,30 - 4 2 3 Nếp Nù Tây Ninh - 6,00 - - - - - - - - - 4 Nếp trắng Cò Nòi 6,33 2,50 4,41 7,02 - - - 1,30 - - - 5 Nếp Cao Lộc - 2,00 - - - - - - - - - 6 Nếp Phú Lương 1 1,00 - - - - - - - - - - 7 Nếp Phú Lương 2 6,92 5,00 5,96 19,2 8 20,0 0 19,6 4 11,60 21,30 16,45 21 6 8 Nếp Phú Lương 3 3,67 - - 27,2 7 - - 11,00 - - - - TB 2,79 4,75 1,82 7,26 4,14 2,45 2,82 4,2 2,05 25 8 Bảng 2. Tỷ lệ tạo phôi, tái sinh cây, cây hữu thụ của các vật liệu từ Trung Quốc (Viện ghiên cứu gô, năm 2008) TT Nguồn gốc Tỷ lệ tạo phôi (%) Tỷ lệ tái sinh (%) Tỷ lệ cây hữu thụ (%) Tổng số dòng T.08 X.09 TB T.08 X.09 TB T.08 X.09 TB Số dòng tạo mới Số dòng sử dụng 1 You 1 - 2,00 - - - - - - - - - 2 You 2 - 1,00 - - - - - - - - - 3 You 3 2,43 2,00 2,21 - - - - - - - - 4 You 4 5,13 2,40 3,76 5,19 8.33 6,76 - 8,40 - 14 2 5 You 5 9,83 11,75 10,79 27,27 17,73 22,50 17,40 11,40 14,40 23 2 TB 3,78 3,83 3,35 6,49 5,21 5,85 3,48 3,96 2,88 37 4 Bảng 3. Tỷ lệ tạo phôi, tái sinh cây, cây hữu thụ của các vật liệu có nguồn gốc từ Thái Lan (Viện ghiên cứu gô, năm 2008) TT Nguồn gốc Tỷ lệ tạo phôi (%) Tỷ lệ tái sinh (%) Tỷ lệ cây hữu thụ (%) Tổng số dòng T.08 X.09 TB T.08 X.09 TB T.08 X.09 TB Số dòng tạo mới Số dòng sử dụng 1 SW 226 2,89 1,00 1,94 - 7,73 - - 1,40 - - - 2 SW 305 1,38 1,00 1,19 - 20,0 - - 1,40 - 3 3 3 SW 307 2,82 1,00 1,91 6,25 - - - - - - - T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 4 SW 227 2,50 - - - - - - - - - - 5 SW 236 3,00 16,67 9,83 - 6,00 - - - - - - 6 SW 303 1,80 2,29 2,04 - - - - - - - - 7 SW 237 2,75 8,43 5,59 27,17 15,08 21,17 21,30 11,30 16,30 2 2 8 SW 273 8,00 6,93 7,46 20,83 14,7 17,76 22,30 17,40 19,85 3 1 9 SW 261 2,33 3,00 2,66 17,43 11,11 14,27 14,60 13,30 13,95 3 1 10 SW 275 7,63 4,40 6,01 19,67 18,18 18,92 15,60 21,70 18,70 2 1 11 SW 282 12,26 11,60 11,93 6,03 5,17 5,60 - - - - - 12 SW 285 3,67 2,50 3,08 18,18 6,00 12,90 11,40 31,40 7,21 6 4 13 SW 290 4,43 9,40 6,91 6,45 6,38 6,41 6,38 21,80 14,09 8 3 14 SW 303 x SW 273 4,17 3,29 3,73 16,00 21,70 18,85 16,90 11,30 14,90 7 4 15 SW 304 x SW 273 5,44 3,25 4,34 12,24 15,38 13,81 21,40 11,80 16,60 3 3 16 SW 273 x SW 304 5,89 6,67 6,28 37,74 15,00 26,37 14,60 5,70 10,15 3 3 17 SW 305 x SW 226 2,50 8,00 5,25 13,33 5,00 9,16 1,30 3,10 2,20 3 1 TB 4,26 5,43 4,71 11,84 9,84 9,71 8,57 8,91 7,87 43 26 Bảng 4. Tỷ lệ tạo phôi, tái sinh cây, cây hữu thụ và số dòng đạt yêu cầu của các vật liệu (Viện ghiên cứu gô, năm 2009) TT Vật liệu Tổng số nguồn nuôi cấy Tỷ lệ tạo phôi TB (%) Tỷ lệ tái sinh cây (%) Tỷ lệ cây hữu thụ (%) Số dòng đạt yêu cầu 1 Việt Nam 8 1,82 2,45 2,05 6 2 Trung Quốc 5 3,35 5,85 2,88 4 3 Thái Lan 17 4,71 9,71 7,87 26 . häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 1 KẾT QUẢ CHỌN TẠO DÒNG NGÔ NẾP THUẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BAO PHẤN Đinh Công Chính 1 , Bùi Mạnh Cường 2 ,. và cs., 1994). Phương pháp này rất có hiệu quả trong chọn tạo dòng thuần nhờ những ưu điểm nổi bật như rút ngắn thời gian tạo dòng, tạo ra cá thể có