KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG KHOAI MÔN SỌ BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO guyễn Quang Thạch 1 , Đào Huy Chiên 2 , Đỗ Thị Bích ga 2 , guyễn Thị Hương 1 , guyễn Thị Phương Thảo 1 , gô Thị Huệ 2 , Trịnh Văn Mỵ 2 SUMMARY Research on taro seed rapid multiplication by in vitro technology Taro varieties are multiplied by in vitro and in vivo technology, aim to reduce loss of seed by traditional storage method. This researching result base on for rapid multiplication process of Taro seed production with in cluding: 1. Facing disifection of eye tubers are double disinfection by HgCl 2 0.1% in 15 minute, after those sample are deeped in Jonhson solution in 15 minute: ObtainableResult 66,67 - 86,67%. 2. Use MS + 3mg/l BAP+ 0,5mg/l αAA and MS + 1,5 mg/l TDZ solution are best for rapid multiplication of Taro seed production, they were increased coefficent multiplicaon 5,2 times and 6,4 times. 3. Microtubers of seed are produced by MS with saccaroza 140 g/l under light to be best. Obtain 100% Plants has had tubers, 3,71-3,90 tubers/plant. 4. In vitroplant are trasfered to bracked in burn grain when weight plantlet 1,5 - 3,0 gram to be best. Height from 6,2- 17,6 after 14 days. 5. Invitro plant are growed in nursery seedling 14 days is best before planting in nethouse. 100% survival plants and 1.505,5 - 3.398,2 gram/plant. Keywords: MS (medium solution), In vitroplant, BAP, TDZ, αAA, saccaroza, rapid multiplication I. §ÆT VÊN §Ò Phương pháp nhân ging in vitro ã ưc áp dng trên nhiu i tưng cây trng trong ó có cây khoai môn s, vi nhiu ưu im vưt tri so vi các phương pháp nhân ging truyn thng như: H s nhân ging cao, to ra cây con ng u, sch bnh Theo nhiu nghiên cu v nhân ging in vitro cây khoai môn s cho thy: T l nhim nm, khuNn khi vào mu khoai môn s khá cao (50 - 60%), chưa ánh giá ưc kh năng thích nghi ca cây nuôi cy mô ra ngoài t nhiên T nhng tn ti trên tin hành “ghiên cứu nhân giống cây khoai môn sọ bằng phương pháp in vitro và in vivo” nhm nhân nhanh ging môn s sch bnh, góp phn bo tn ngun tài nguyên di truyn a dng khoai môn s ng thi phát trin chúng thành cây hàng hoá có giá tr không ch  Vit N am mà còn hưng xut khNu ra khu vc và trên th gii. 1 Vi n Sinh hc nông nghip, i hc N ông nghip H à N i. 2 Trung tâm N ghiên cu và Phát trin Cây có c, Vin Cây lương thc và Cây thc phNm. II. VậT LIệU V PHƯƠN G PHáP N GHIÊN CứU 1. Vt liu nghiờn cu Gm cỏc ging khoai s: Khoai mụn tớm (MT); khoai S Vng (SoV); khoai s Ho Bỡnh (HB), khoai s Lng Giang (LG3), khoai s Sapa. 2. Phng phỏp nghiờn cu Thớ nghim nuụi cy in vitro tin hnh theo phng phỏp hin hnh, iu kin nhit phũng: 22 - 25 0 C; ỏnh sỏng: 2000- 2500 lux, thi gian chiu sỏng:16 h/ngy; Nm phũng: 70 %. 2.1. To ngun vt liu khi u in vitro C mụn s c ra sch di vũi nc sch trong 20 phỳt sau ú ra sch bng x phũng trong 15 phỳt, ra li nhiu ln bng nc ct vụ trựng, trỏng li bng cn 70 0 trong 30 giõy, ra li nhiu ln bng nc ct vụ trựng v kh trựng bng cỏc cht kh trựng khỏc nhau, mu ó kh trựng c cy vo mụi trng khi ng MS, sau 4 tun tin hnh o m cỏc ch tiờu v sinh trng-phỏt trin. 2.2. ghiờn cu mụi trng nhõn nhanh thớch hp Sau khi to ngun nguyờn liu ban u sch bnh, cỏc mt ng c ct thnh cỏc lỏt mng (0,3-0,4mm) a vo nuụi cy. Thớ nghim trờn 21 mu, 3 ln lp li. Nghiờn cu trờn 04 t hp iu ho sinh trng: a) nh hng ca t hp BAP v - NAA n kh nng tỏi sinh chi trc tip t mu cy. b) nh hng nng Adenine Sulfat kt hp vi BA v IAA n s phỏt sinh chi t mu cy. c) Nghiờn cu nh hng ca TDZ n kh nng nhõn chi v cht lng chi khoai mụn s. d) Nghiờn cu nh hng ca IAA v NAA n kh nng ra r khoai mụn s. 2.3. ghiờn cu mụi trng to c in vitro thớch hp Cõy con tiờu chuNn c cy sang mụi trng MS. Sau 2 tun iu kin phũng, khi cõy con ó cú b r hon chnh, b sung dung dch ng vụ trựng vi nng 120g/l ri t cõy trong iu kin khỏc nhau: iu kin to c trong búng ti v iu kin ỏnh sỏng phũng. 3. Phng phỏp x lý s liu Cỏc s liu c x lý theo chng trỡnh Excel, IRRISTAT 4.0. III. KếT QUả V THảO LUậN 1. ghiờn cu nh hng ca thi gian kh trựng bng dung dch Johnson kt hp vi HgCl 2 0.1% n vic to vt liu khi u in vitro S dng dung dch Johnson kh trựng i vi mt c khoai s cỏc thi gian khỏc nhau cho cỏc kt qu khỏc nhau, nu khụng s dng dung dch kh trựng Johnson ch dựng n l HgCl 2 0.1% t l nhim nm khuNn khi vo mu khỏ cao (61.91%), khi kt hp kh trựng HgCl 2 0.1% vi ngõm mu trong dung dch Johnson trong 5, 10, 15 v 20 phỳt, kt qu khi ngõm mu trong dung dch thi gian 15 phỳt t l mu sch bnh cao t 81,9% và t l mu sng t 71,40%. Thi gian x lý lâu hơn 15 phút, tuy t l nhim bnh thp nhưng s nh hưng n sc sng ca mu và thi gian x lý ngâm mu ít hơn 15 phút t l mu nhim bnh cao hơn. S kt hp gia hoá cht kh trùng b mt Johnson vi dung dch HgCl 2 0,1% là phương pháp ti ưu  to ra mu sch bnh trưc khi ưa vào nhân nhanh khoai môn s bng phương pháp nuôi cy mô theo công thc HgCl 2 0.1% (15 phút) + Johnson (15 phút) (bng 1). Bảng 1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng Johnson kết hợp với HgCl 2 0,1% đến hiệu quả khử trùng (sau 4 tuần theo dõi) CT Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%) HgCl 2 0,1% Johnson TL mẫu sống tạo cây (%) TL mẫu chết (%) CT1 15 0 61,91 33,33 4,76 CT2 15 5 38,10 61,90 0,00 CT3 15 10 33,33 66,67 0,00 CT4 15 15 19,10 71,40 9,50 CT5 15 20 9,52 61,90 28,58 2. Xác định các biện pháp nhân nhanh thích hợp cho cây khoai môn sọ 2.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α- AA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy Các cht iu hoà sinh trưng BAP và α- NAA ưc kt hp trong môi trưng nuôi cy ã nh hưng n kh năng tái sinh chi rõ rt, khi gi nguyên nng  α- NAA 0,5mg/l và thay i nng  BAP 1,2, 3 và 4mg/l kt qu cho thy sau 8 tun nuôi cy vi 2 ln cy chuyn (4 tun cy chuyn mt ln) (bng 2, hình 1): Vi nng  ti công thc 4 (3mg/l BAP + 0,5mg/l αNAA) là công thc có kh năng tái sinh chi trc tip tt nht.  công thc này không ch có t l tái sinh cao (73,45%), s chi to ưc trên 1 mu cy nhiu (t 3,9 chi/mu), cht lưng chi cũng tt hơn các công thc khác. T l chi cht thp nht 26,55% trong khi ó công thc không s dng cht iu hoà sinh trưng (công thc i chng) 96,67%, các công thc khác s dng các cht iu hoà BAP và α-NAA  nng  1, 2 và 4 mg/l cht BAP t l mu cht cao nht là 55,44 % và thp nht là 31,68%. S dng t hp (3mg/l BAP + 0,5mg/l αNAA) h s sinh chi cao gp 3,9 ln so vi không s dng cht iu hoà sinh trưng. Bảng 2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α- AA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) Công thức Chất ĐTST (mg/l môi trường) Số mẫu đưa vào TL mẫu tái sinh (%) TL mẫu chết (%) Số chồi tái sinh TB (chồi/mẫu) BAP αNAA 1 (Đ/C) 0 0 21 3.33 96.67 1.00 2 1 0.5 21 45.64 54.36 1.70 3 2 0.5 21 55.44 44.56 2.40 4 3 0.5 21 73.45 26.55 3.90 5 4 0.5 21 68.32 31.68 3.10 LSD 0.05 0.24 CV% 4.70 2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-AA đến khả năng nhân chồi khoai môn sọ Nng  ca cht iu hoà sinh trưng BAP và αNAA nh hưng rõ rt n kh năng nhân nhanh khoai môn s vi nng  3mg/l BAP + 0.5mg/l αNAA, sau 7 tun nuôi cy s chi tăng lên 119.7 chi t 21 chi ban u, tương ng vi h s nhân là 5.2 ln (bng 3) tăng so vi i chng 300%. Cht lưng chi ưc ánh giá qua chiu cao, s lá và hình thái chi. Kt qu o m và quan sát các ch tiêu trên  thi im sau 4 tun nuôi cy ưc ghi li  bng 4: Sc sng ca chi t mc trung bình, lá hơi nh nhưng nhiu lá, chiu cao t mc trung bình 2,5cm thp hơn các công thc khác. Bảng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α AA đến hệ số nhân chồi CT Chất ĐTST (mg/l môi trường) Số mẫu cấy Động thái bật chồi (chồi) Hệ số nhân BAP α NAA 5 tuần 6 tuần 7 tuần CT1 (Đ/C) 0 0.5 21 30.0 30.0 30.0 1.3 CT2 1 0.5 21 46.8 49.3 54.2 2.3 CT3 2 0.5 21 52.0 64.0 80.5 3.5 CT4 3 0.5 21 82.7 108.4 119.7 5.2 CT5 4 0.5 21 74.1 82.7 98.9 4.3 LSD 0.05 0.38 CV% 4.1 Bảng 4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và αAA đến chất lượng chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) CT Chất ĐTST (mg/l) C. cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá) Hình thái chồi BAP α NAA CT1 (Đ/C) 0 0.5 1.9 1.2 Chồi nhỏ, lá bé, xanh nhạt, rất ít lá CT2 1 0.5 4.7 1.9 Chồi mập, lá to, xanh đậm, ít lá CT3 2 0.5 3.3 3 Chồi mập, lá to, xanh đậm, ít lá CT4 3 0.5 2.5 5 Chồi TB, lá nhỏ, xanh đậm, nhiều lá CT5 4 0.5 3.4 3.6 Chồi và lá TB, thân lá hơi xanh nhạt LSD 0.05 0.35 0.19 CV% 3.9 4.5 2.3 Ảnh hưởng của nồng độ Adenine sulfat kết hợp với BA và IAA đến hệ số nhân chồi Trong môi trưng nuôi cy cơ bn MS b sung mt s cht iu hoà sinh trưng BA, IAA và Adenine sulfat vi nng  cht BA 5 mg/l môi trưng, cht IAA1 mg/l môi trưng và nh hưng  các nng  khác nhau ca Adenine sulfat  các nng : Không b sung cht Adenine sulfat, b sung 20; 40 và 60 mg/l môi trưng. Kt qu cho thy, vi công thc MS + 5mg/l BA + 1mg/l IAA + 40mg/l Adenine sulfat t hiu qu cao nht, h s nhân là 6,8 ln, tăng 353,3% so vi i chng khi không b sung cht iu hoà sinh trưng và tăng 43% so vi công thc khng sung cht iu hòa sinh trưng Adenine sulfat. Bảng 5. Ảnh hưởng nồng độ Adenine Sulfat kết hợp với BA và IAA đến sự phát sinh chồi từ mẫu cấy (sau 4, 6 và 8 tuần theo dõi) CT HSN (sau 4 tuần) C. lượng chồi HSN (sau 6 tuần) C.lượng chồi HSN (lần) (sau 8 tuần) C.lượng chồi CT1: MS (Đ/C) 1.25 + 1.50 + 1.50 + CT2: MS + 5mg/l BA + 1mg/l IAA 1.62 ++ 3.37 ++ 4.75 ++ CT3: MS + 5mg/l BA + 1mg/l IAA + 20mg/l Adenine sulfat 2.20 ++ 4,00 ++ 6.48 ++ CT4: MS + 5mg/l BA + 1mg/l IAA + 40mg/l Adenine sulfat 2.40 +++ 4.08 +++ 6.80 +++ CT5: MS + 5mg/l BA + 1mg/l IAA + 60mg/l Adenine sulfat 1.68 ++ 3.52 + 4.96 ++ CV% 2.40 LSD 0.05 0.26 Ghi chú: (+) B bao lá ngoài chi khô héo, (++) chi màu xanh, (+++) chi mp, xanh. 2.4. ghiên cứu ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân chồi và chất lượng chồi H s nhân  các công thc có b sung TDZ là khá cao, chng t nh hưng ca TDZ n kh năng nhân chi ca khoai môn s là rt tt. Công thc tt nht 1.5mg/lTDZ (bng 6 và 7) h s nhân 6,4 ln, tăng so vi i chng 540% Bảng 6. Ảnh hưởng của TDZ đến hệ số nhân chồi Công thức Số mẫu cấy Động thái bật chồi (chồi) HSN (lần) 5 tuần 6 tuần 7 tuần CT 1: MS (Đ/C) 18 30.0 30.0 30.0 1.0 CT2: MS + 1mg/l TDZ 18 88.3 106.5 124.8 4.7 CT3: MS +1,5mg/l TDZ 18 94.0 117.9 148.1 6.4 CT4: MS + 2mg/l TDZ 18 81.7 106.3 121.4 5.3 LSD 0.05 0.54 CV% 4.20 Bảng 7. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến chất lượng chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) CT Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá) Hình thái chồi CT 1: MS (Đ/C) 2.4 1.8 Chồi nhỏ, lá bé, xanh nhạt, rất ít lá CT2: MS + 1mg/l TDZ 4.5 3.7 Thân lá TB, xanh đậm, nhiều lá CT3: MS + 1,5mg/l TDZ 4.1 5.1 Thân lá TB, xanh đậm, nhiều lá CT4: MS + 2mg/l TDZ 4.9 4.4 Thân nhỏ, lá TB, xanh nhạt LSD 0.05 0.17 0.35 CV% 2.2 4.7 2.5. ghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Bảng 8. Sự phát sinh rễ môn sọ trên các môi trường ra rễ khác nhau sau 2 tuần (giống môn tím) MT nền Than hoạt tính IAA (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ TB/cây (sau 2 tuần) 1/2MS 0 0 0 100 5.3 2 0 0 100 6.5 0 1.5 0 100 6.4 0 0 1.5 100 7.4 MS 0 0 0 100 7.3 2 0 0 100 7.2 0 1.5 0 100 7.9 0 0 1.5 100 6.4 Môi trưng nn MS cây môn s sinh trưng phát trin tt, r trng, mp và không có khác bit nhiu v cht lưng cây con (k c môi trưng MS không b sung cht iu tit sinh trưng). iu này cho thy vic s dng môi trưng MS là môi trưng ra r môn s em li hiu qu cao (bng 8). 2.6. ghiên cứu tạo củ in vitro 2.6.1. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến sự hình thành củ in vitro (giống môn tím) Bảng 9. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến việc tạo củ môn sọ in vitro giống môn tím (sau 90 ngày) Phương thức nuôi cấy Tỷ lệ hình thành củ (%) Khối lượng trung bình củ cái Số củ con trung bình/cây (củ) Khối lượng trung bình củ con (g) Tối hoàn toàn 0 - - - Điều kiện phòng 100 3.45 2.50 0.41 1/2 i vi các cây trong iu kin có ánh sáng, vic to c tin hành rt thun li, t l to c t 100%. Không nhng th, t các c cái còn mc ra các c con như trong iu kin in vivo. 2.6.2. ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự hình thành củ in vitro giống MT Bảng 10. Ảnh hưởng nồng độ đường đến sự hình thành củ in vitro giống MT (sau 90 ngày) CT Nồng độ đường (%) Tỷ lệ hình thành củ (%) Khối lượng TB củ cái (g) Số củ con TB/cây (củ) Khối lượng TB củ con (g) CT1 8 100 3.29 1.92 0.17 CT2 10 100 3.32 2.31 0.49 CT3 12 100 4.93 3.71 0.52 CT4 14 100 5.70 3.90 0.50 CT5 16 100 5.71 4.10 0.51 CV% 2.45 LSD 0.05 1.06 T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 Kt qu nghiên cu cho thy nng  ưng 14% cho khi lưng c ln nht t 5.70 g/c. V khi lưng trung bình c CT4 và CT5 không có s khác bit rõ rt do ó vì li ích kinh t chúng ta nên s dng nng  14% ưng  to c môn s in vitro. IV. KÕT LUËN 1. Ch  kh trùng ti ưu cho mu mt ng khoai môn s là ch  kh trùng kép, s dng dung dch HgCl 2 0,1% trong 15 phút sau ó ngâm mu vào dung dch Johnson trong 15 phút, vi phương pháp này to t l mu sch trên các ging t t 66,67- 86,67%. 2. Nghiên cu nh hưng ca t hp BAP và α- NAA n kh năng tái sinh chi trc tip t mu cy. Vi nng  3mg/l BAP + 0,5mg/l αNAA là công thc có kh năng tái sinh chi trc tip tt nht. 3. nh hưng ca t hp BAP và α-NAA n kh năng nhân chi khoai môn s, nh hưng rt rõ rt n kh năng tái sinh chi trc tip t mu nuôi cy ban u và làm tăng h s nhân chi cùng trên công thc 3mg/l BAP + 0,5mg/l αNAA. 4. nh hưng ca nng  Adenine sulfat kt hp vi BA và IAA n h s nhân chi vi công thc MS + 5mg/l BA + 1mg/l IAA + 40mg/l Adenine sulfat t hiu qu cao nht, h s nhân là 6,8 ln. 5. TDZ là môi trưng nhân nhanh có trin vng i vi môn s. Trên nn môi trưng MS+1.5mg/lTDZ cho h s nhân ca các ging thí nghim t 8,07-9,12 ln sau 8 tun nuôi cy. 6. Môi trưng ra r hiu qu là môi trưng MS không b sung cht iu tit sinh trưng. 7. Vic to c môn s in vitro trong iu kin ánh sáng phòng thí nghim trên môi trưng nn MS có b sung 140g/l ưng là ti ưu, có th áp dng  to c môn s in vitro sch bnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Chang R.C.O; Chong-Jin Goh, 1994. High frequency direct shoot regeneration from corm axillary buds and rapid clonal propagation of taro, Colocasia esculenta var. esculenta (L.) (Araceae). Plant science ISSN 0168-9452 CODEN PLSE4 - 1994, vol.104, n 0 1, pp. 93 - 100 (19 ref) 2. Duong Tan hut, guyen Thi Dieu Huong, Dinh Van Khiem, 2003. Study on tissue culture and its correlative factor of Colocasia esculenta, Horticulture digest. 3. L P yman and J Arditti, 1984. Effects of 2, 3, 5 - Triiodobenzoic Acid on Plantlet Formation from Cultured Tissue of Taro, Colocasia esculenta (L.) Schott (Araceae), Annal of Botany Company 54, p 459 - 466. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 9 4. Murakami, K.; ishioka, J.; Matsubara, S., 1998. Somaclonal variation in plants regenerated from callus and protoplasts of taro (Colocasia esculenta), v.87 p. 127 - 132. gười phản biện: PGS. TS. Nguyn Văn Vit . KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG KHOAI MÔN SỌ BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO guyễn Quang Thạch 1 , Đào Huy Chiên 2 ,. ti trên tin hành “ghiên cứu nhân giống cây khoai môn sọ bằng phương pháp in vitro và in vivo” nhm nhân nhanh ging môn s sch bnh, góp phn bo