NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (HL2) TỪ MÔ LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Hoàng Thị Lan Hương, Lê Huy Hàm, Nguyễn Xuân Linh, Nguyễn Thị Kim Lý Summary Study on micropropagation of Phalaenopsis (HL2) from leaf tips Flower stalks of Phalaenopsis anthura Moscow 2 (HL2) were cut into 3 cm long single - node cuttings with parts internodes, each node holding one dormant bud. The cuttings were surface - sterilized with H 2 O 2 15% for 20 min. Segments were then cultivated on the MT medium after 8 months, each dormant bud developed in to explant.Young leaf from explants were cutted in to 1 cm 2 segments and cultured on MT medium supplemented with cytokinin [(kinetin (KIN), N6 - benzyladenine (BAP) and Thidiazuron (TDZ)]. The leaf segments developed protocorm like body (PLBs) within 12 weeks depending on the growth medium. An optimum of 17,7 PLBs developed from leaf explants on medium supplemented with 2 mg/l BAP + 1,0 mg/l TDZ. Upon subculture in MT with 50 g potato/l, the PLBs differentiated into plantlet within 8 weeks. Keywords: Flower stalks, dormant bud, protocorm, cytokinins, BAP, KIN, TDZ, PLBs. MT: Vacine and Went (VW) + 7 g/l agar + 10 g/l sugar + 3 g/l charcoal. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lan Hồ điệp (Phalaenopsis) là một trong những loài phong lan có giá trị kinh tế cao và rất được ưa chuộng bởi đó là loài hoa rất đa dạng, phong phú về hình dáng, màu sắc, độ bền hoa dài và thích nghi với điều kiện trong phòng. Trong những năm gần đây, thị trường hoa lan Hồ điệp có sức tiêu thụ lớn hơn bất kỳ một loại hoa nào khác. Tuy nhiên, sản xuất loại hoa này ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, chưa đáp ứng được nhu cầu của thị trường về năng suất, chất lượng và thường xuyên phải nhập nội. Do lan Hồ điệp là loại đơn thân nên rất khó nhân giống theo phương pháp cắt đỉnh chồi, trong khi đó nhân giống từ hạt của những quả tự thụ phấn sẽ tạo ra một lượng cây lớn trong thời gian ngắn và dễ nhân giống, nhưng kỹ thuật này không giữ được ưu thế đồng nhất của cây hoa lan F1 mà bị phân ly mạnh ở thế hệ F2. Chính vì vậy để tạo ra một quần thể cây đồng đều giữ nguyên đặc tính cây mẹ, hệ số nhân giống cao, chủ động trong việc cung cấp giống đòi hỏi cần phải nghiên cứu tìm ra phương pháp nhân giống có hiệu quả nhất. Nội dung trình bày dưới đây nhằm giới thiệu kết quả nghiên cứu về quy trình nhân giống lan Hồ điệp từ lá bằng phương pháp nuôi cấy Invitro. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Mắt ngủ cành hoa của giống lan Hồ điệp HL2 (Phalaenopsis anthura Moscow 2) sau khi nở từ 3 - 4 bông được làm vật liệu nuôi cấy. Giống có nguồn gốc từ Hà Lan, được chọn lọc và đưa ra sản xuất từ Trung tâm Hoa cây cảnh - Viện Di truyền nông nghiệp. Qua nghiên cứu, đánh giá và sản xuất trong điều kiện Việt Nam cho thấy giống có khả năng thích ứng cao với đặc điểm hoa to, màu trắng, sọc tím, môi hồng, độ bền hoa từ 8 - 9 tuần, có khả năng chống chịu bệnh thối nhũn, thời gian xuất hiện ngòng hoa vào đầu tháng 12. 2. Phương pháp nghiên cứu - ghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu vô trùng khởi đầu: Nguồn mẫu ban đầu để tạo nguyên liệu vô khuNn trong ng nghim là mt ng ca cành hoa. Cành hoa sau khi ã n ưc 3 - 4 hoa ưc ct thành nhng on dài khong 3 cm có mang mt ng. Các mu ưc kh trùng bng H 2 O 2  các nng  10%, 15% và thi gian 15 phút, 20 phút và 25 phút, sau ó ưc ra li bng nưc ct 3 ln. Sau khi kh trùng, các mu ưc cy vào môi trưng MT (Vacine and Went (VW) + 10 g/l sucrose + 7 g agar + 3 g/l than hot tính). - ghiên cứu tạo protocorm: Thí nghim nghiên cu nh hưng ca cht iu tit sinh trưng BAP (N 6 - benzyladenine), KIN (kinetin) và TDZ (Thidiazuron)  các nng  khác nhau n kh năng to protocorm t mNu lá. Lá t các chi mc lên t mt ng ca cành hoa ct thành nhng mNu lá có din tích 1 cm 2 cy vào các môi trưng MT có b sung các cht iu tit sinh trưng  các nng  khác nhau. - ghiên cứu nhân nhanh: Thí nghim nghiên cu nh hưng ca mt s cht ph gia hu cơ (chui và khoai tây) lên s nhân nhanh chi t các cm protocorm ca mNu lá. Cy các cm protocorm vào môi trưng MT có b sung chui và khoai tây  các nng  khác nhau. Các thí nghim ưc b trí ngu nhiên vi 3 ln nhc li, mi công thc 30 mu. - Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghim ưc tin hành ti Trung tâm Hoa cây cnh, Vin Di truyn N ông nghip trong iu kin hoàn toàn nhân to, có th ch ng iu chnh ánh sáng, nhit ,  Nm theo ý mun. Trong thí nghim này ánh sáng ưc s dng là ánh sáng lnh ca èn neon, thi gian chiu sáng 10 h/ngày, cưng  chiu sáng 2400 - 3000 lux, nhit  27 ± 1 0 C,  Nm 65 - 70%. III. KT QU VÀ THO LUN 1. ghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu vô trùng khởi đầu  to ngun vt liu ban u cho quá trình nhân nhanh, mt ng ca cành hoa ưc kh trùng bng H 2 O 2  nng  và thi gian khác nhau. Bảng 1. Kết quả phương thức khử trùng mẫu (sau 4 tuần) Nồng độ H 2 O 2 Thời gian khử trùng Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) 10% 15 phút 20 phút 25 phút 50,0 40,0 26,6 10,0 6,6 13,3 40,0 53,3 60,0 15% 15 phút 20 phút 25 phút 30,0 6,6 3,3 10,0 10,0 23,3 60,0 83,3 73,3 Kt qu bng 1 cho thy: Khi kh trùng bng H 2 O 2  các nng  khác nhau (15 - 20%) thì t l mu sng tăng theo t l thun vi thi gian kh trùng và ngưc li t l mu nhim gim i. Kh  mc 15% H 2 O 2 trong thi gian 20 phút t t l mu sng cao nht (83,3%). 2. ghiên cứu tạo protocorm ây là giai on quyt nh hiu qu và tc  ca công ngh nhân ging. Giai on này cn t các yêu cu sau: + Tìm ra môi trưng thích hp nht  to ra h s nhân ging cao nht. + Các th tin chi to ra ng nht v mt di truyn, có sc sinh trưng cao, ít bin d. Trong giai on này, chúng tôi ã ln lưt nghiên cu tác dng ca các cht iu hoà sinh trưng riêng r hoc kt hp  các nng  khác nhau lên mNu lá cây lan H ip nhm mc ích tìm ra t hp ti ưu các cht iu hoà sinh trưng cho h s nhân ging cao nht trong ng nghim. Sau 8 tun, các mt ng ca cành hoa hình thành nên cây con. Ct lá ca các cây con này thành các mNu lá có kích thưc khong 1 cm 2 cy vào môi trưng MT cơ bn có b sung các cht iu hoà sinh trưng  các nng  khác nhau. Bảng 2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành protocorm (sau 12 tuần) Nồng độ của các chất diều hòa sinh trưởng mg/l Tỷ lệ tạo protocorm mới (%) Hệ số nhân (lần) BAP 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 0 0 24,4 33,3 17,8 0 0 0 4,0 ± 0,81 6,2 ± 1,34 4,3 ± 1,37 KIN 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 0 0 15,6 21,1 0 0 0 4,9 ± 1,37 5,6 ± 1,40 BAP + TDZ 2,0 +0,0 2,0 +0,5 2,0 +1,0 2,0 +1,5 2,0 +2,0 33,3 42,2 77,8 27,8 Tạo callus 6,2 ± 1,34 9,9 ± 1,82 17,7 ± 2,57 7,7 ± 2,22 0 KIN + TDZ 2,5 + 0,0 2,5 +0,5 2,5 +1,0 2,5 +1,5 2,5 +2,0 21,1 31,1 63,3 Tạo callus Tạo callus 3,6 ± 0,68 7,4 ± 1,08 10,3 ± 2,11 0 0 Qua bng 2 cho thy:  công thc không b sung hoc có b sung BAP và KIN nhưng ở nồng độ thấp mẫu đều không phát sinh hình thái. Nhưng ở những công thức sau hệ số nhân và tỷ lệ tạo protocorm tăng lên khi bổ sung BAP ở nồng độ 1,5 - 2,5 mg/l và KIN ở nồng độ 2,0 - 2,5 mg/l. Đối với BAP, tỷ lệ tạo protocorm và hệ số nhân đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 2 mg/l (33,3% và 6,2 lần), đối với KIN ở nồng độ 2,5 mg/l (21,1% và 5,6 lần). Mẫu được cấy trong môi trường kết hợp giữa BAP và TDZ; KIN và TDZ có ảnh hưởng rất tích cực lên sự hình thành protocorm từ lá. Tỷ lệ tạo protocorm và hệ số nhân tăng lên rõ rệt và đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 2 mg/l BAP + 1,0mg/l TDZ (77,8% và 17,7 lần) và 2,5 mg/l KIN + 1,0 mg/l TDZ (63,3% và 10,3 lần). Tuy nhiên ở nồng độ cao mẫu sẽ tạo callus. Như vậy, môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh protocorm là: MT + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l TDZ. 3. hân nhanh chồi Sau khi nhân nhanh các thể protocorm, chúng tôi nghiên cứu tác dụng của chất phụ gia lên sự hình thành chồi từ các thể protocorm bằng cách cấy các thể protocorm vào môi trường MT có bổ sung khoai tây và chuối ở các nồng độ khác nhau. Khoai tây và chuối đều ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ tạo chồi. Bảng 3 cho thấy, ở tất cả các công thức có bổ sung khoai tây đều cho hệ số nhân và tỷ lệ tạo chồi cao hơn so với đối chứng và đạt cao nhất ở công thức 50 g/l khoai tây (8,6 lần và 75,6%). Tuy nhiên, nếu bổ sung ở nồng độ cao, sự hình thành chồi từ cụm protocorm giảm đi. Còn ở những công thức có bổ sung chuối hoặc tổ hợp chuối và khoai tây thì hệ số nhân và tỷ lệ tạo chồi giảm đi theo tỷ lệ nghịch với nồng độ. Hệ số nhân và tỷ lệ tạo chồi thấp nhất ở công thức 150 g/l khoai tây + 150 g/l chuối lần lượt là 2,1 lần và 14,4%. Bảng 3. Ảnh hưởng của chất phụ gia hữu cơ lên sự hình thành chồi (sau 8 tuần) Nồng độ (g/l) Hệ số nhân (lần) Tỷ lệ tạo chồi (%) MT MT + 30 gKT MT + 50 gKT MT + 100 gKT MT +150 gKT MT + 30 gCH MT + 50 gCH MT + 100 gCH MT +150 gCH MT + 30 gKT + 30 gCH MT + 50 gKT + 50 gCH MT + 100 gKT + 100 gCH MT + 150 gKT + 150 gCH 5,1 7,8 8,6 7,2 6,9 6,3 5,4 3,8 2,7 6,3 5,4 4,8 2,1 47,8 65,5 75,6 67,8 66,7 52,2 35,6 24,4 11,1 57,8 47,8 28,9 14,4 Môi trưng thích hp nht cho nhân nhanh cây con là: MT + 50 g/l khoai tây. IV. KẾT LUẬN - Mắt ngủ của cành hoa được khử trùng bằng H 2 O 2 15% trong thời gian 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất là 83,3%. - MNu lá có din tích 1 cm 2 sau 12 tun phát sinh ra 17,7 PLBs trong môi trưng MT + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l TDZ. - Sau khi nhân nhanh protocorm, cy chuyn các protocorm này vào môi trưng MT + 50 g khoai tây/l, sau 8 tun hình thành chi con vi h s nhân là 8,6 chi/ cm protocorm. TÀI LIU THAM KHO 1 Arditti, J., Ernst, R., 1993. Micropropagation of orchids, John Wiley and Sons, New York, US. 2 Ishii, Y., Takamura, T., Goi, M., Tanaka, M., 1998. Callus induction and somatic embryogenesis of phalaenopsis, Plant Cell Rep., 17: pp: 446 - 450. 3 Park, Y.S., Kakuta, S., Kano, A., Okabe, M., 1996. “Efficient propagation of protocorm - like bodies of Phalaenbopsis in liquid medium”, Plant Cell Tiss. Organ Cult., 45: pp. 79 - 85. 4 Park, Y.S., Murthy, H.., Paek, K.Y, 2002. Rapid propagation of Phalaenopsis from floral stalk - derived leaves, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant.,38, pp:168 - 172. 5 Polonca Kosir, Suzana Skof, Zlata Luthar, 2004. Direct shoot regeneration from nodes of Phalaenopsis orchid, Cobiss code 1.01. gười phản biện: Trần Duy Quý T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5 . NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (HL2) TỪ MÔ LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Hoàng Thị Lan Hương, Lê Huy Hàm, Nguyễn. quả nghiên cứu về quy trình nhân giống lan Hồ điệp từ lá bằng phương pháp nuôi cấy Invitro. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên