NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐỒNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ THUẦN CỦA MỘT SỐ TỔ HỢP TẰM ĐANG CHỌN TẠO BẰNG DẤU CHUẨN PHÂN TỬ RAPD Đặng Đình Đàn, Nguyễn Thị Thanh Bình SUMMARY Study on molecular genetic similarity of some selected Vietnamese silkworm combinations by RAPD markers Random amplified polymorphic DNA (RAPD) method described by Williams and Welsh & McClelland in 1990 use primers annealing to homologous target sites randomly distributed in the genome of Bombyx mori L. The technology has provided a tool for genetic analyses of biological subjects and it has been applied succefully in genetic selection as well as breeding for many agriculture subjects. In this research, ten RAPD primers were surveyed to reveal molecular genetic similarity of five selected Vietnamese silkworm combinations. The results obtained showed that the coefficients of genetic similarity of silkworm combinations change from 0,62 to 0,93 and the genotype homomorphism vary from 73,77% on combination C2 to 78,01% on combination A18. The method has been proved more efficient in comparison with the traditional assessment method. The possibility for applying the method in selection and breeding practice of Bombyx mori L. was diccused. Keywords: Bombyx mori L., genetic similarity, genotype homomorphism, RAPD. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tạo giống, người ta đã tiến hành chọn lọc với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử, đã có những giống vật nuôi và cây trồng trong đó có tằm dâu được chọn tạo bằng phương pháp này. Ở Việt Nam, nuôi tằm là một trong những nghề có từ lâu đời, nhưng việc chọn tạo giống cho đến nay vẫn tiến hành theo phương pháp truyền thống nên có một số hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật mới vào công tác giống là vấn đề cần thiết, trong đó có xác định độ thuần của giống và tổ hợp lai trên cơ sở phân tích đa hình phân tử của chúng bằng kỹ thuật RAPD. Đây là một trong những kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp hơn so với những kỹ thuật phân tử khác, được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng hiệu quả trong hướng nghiên cứu trên. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Vật liệu Năm tổ hợp tằm lưỡng hệ L2, C2, C21B, A18, A27 đang chọn tạo thuộc đề tài tạo giống tằm xuân thu của Trung tâm Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Tách chiết AD: Theo Wiliam và cộng sự. 2.2. Xác định nồng độ AD: Bằng phương pháp quang phổ. 2.3. Kiểm tra AD: Trên gel agaroze 0,8% và chụp ảnh ở máy geldoc. 2.4. hân gen: Bằng kỹ thuật PCR, mồi do hãng Invitrogen tổng hợp. Thể tích dùng cho mẫu là 20 µl. Chu trình nhiệt theo tài liệu của Chapterjee và cộng sự. Sn phNm PCR kim tra trên gel agaroze 1,3% - 1,5%. 2.5. Phân tích kết quả: Bng Excel, thng kê sinh hc và phn mm N TSYS.2.0. H s ng dng ưc tính theo công thc ca N ei và Li. III. KT QU VÀ THO LUN 1. Tách chiết và tinh sạch AD từ mẫu tằm ADN ưc tách chit t mu tm ca các t hp lai bng kit ca Fermentas, các bưc tin hành thc hin theo ch dn ca nhà sn xut gm nghin mn mu trong dung dch m tách chit, phân hu protein bng proteaza K, loi b tp cht bng phenol:chloroform, ta ADN bng ethanol, loi ARN bng Rnaza, ta tip bng ethanol  thu ADN sch. Sn phNm ADN ưc chy in di kim tra, ánh giá trên gel agaroze 0,8% và hình 1 là kt qu thu ưc. Kt qu hình 1 cho thy, sn phNm nhn ưc ã loi ht ARN , các vch gn và có trng lưng phân t ln hơn 21,6 kb. ADN ưc bo qun lnh trong dung dch TE. Hình 1. Ảnh điện di AD 1 - 5: ADN của 5 mẫu. M: ADN λ/EcoRI+HindIII Độ sạch và nồng độ ADN được giới thiệu ở bảng 1. Kết quả bảng 1 cho thấy tỉ lệ OD 260 nm /OD 280 nm dao động từ 1,79 đến 1,98 chứng tỏ ADN thu được có đủ độ sạch để làm nguyên liệu cho PCR trong các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 1. Kết quả đánh giá độ sạch của AD tách chiết bằng kit TT OD260/280 TT OD260/280 TT OD260/280 TT OD260/280 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1,84 1,87 1,79 1,96 1,86 1,84 1,86 1,89 1,98 1,87 1,97 1,96 1,97 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 1,82 1,81 1,92 1,98 1,89 1,85 1,90 1,82 1,81 1,92 1,91 1,89 1,98 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 1,86 1,79 1,85 1,89 1,86 1,96 1,79 1,95 1,92 1,91 1,94 1,92 1,86 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 1,86 1,93 1,92 1,87 1,86 1,85 1,79 1,83 1,79 1,85 1,90 1,81 1,89 2. Phân tích tương đồng di truyền và xác định độ thuần của các tổ hợp tằm Sử dụng 10 mồi RAPD đã tuyển chọn từ đề tài độc lập khác để khuếch đại ADN của các tổ hợp tằm. Hình 2, 3 là ảnh điện di 21,6 kb 1 2 3 4 5 M sn phNm PCR ca mt s t hp vi mi khác nhau. Phân on khuch i ưc ghi nhn là 1 và không khuch i là 0. Tt c các phân on ưc ưa vào chương trình N TSYST 2.0  phân tích quan h di truyn trong các t hp tm và h s tương ng di truyn ca các t hp tm ưc trình bày trong bng 2, 3, 4, 5, 6. Kt qu bng 2 cho thy, h s tương ng di truyn ca t hp tm C21B bin ng khong 0,623 n 0,926 và  khong 0,6 có 6 cp chim 16%,  khong 0,7 có 20 cp chim 44%, khong 0,8 có 12 cp chim 27%, khong 0,9 có 6 cp chim 13%. T hp tm C2 (bng 3) có h s tương ng di truyn dao ng t 0,624 n 0,892, trong ó  khong 0,6 có 24 cp chim 24%, khong 0,7 có 18 cp chim 40%, khong 0,8 có 16 cp chim 36%. T hp tm L2 (bng 4) có s thay i ca h s tương ng t 0,644 n 0,933,  khong 0,6 có 8 cp chim 18%, khong 0,7 có 14 cp chim 31%, khong 0,8 có 20 cp chim 44% và khong 0,9 có 3 cp chim 0,07%. T hp tm A18 (bng 5) có h s tương ng t 0,684 n 0,948,  khong 0,6 có 7 cp chim 16%, khong 0,7 có 15 cp chim 33%, khong 0,8 có 18 cp chim 40% và 0,9 có 5 cp chim 11%. T hp tm A27 (bng 6) ch s này bin thiên t 0,674 n 0,930,  khong 0,6 có 6 cp chim 13%, khong 0,7 có 24 cp chim 53%, khong 0,8 có 14 cp chim 31% và khong 0,9 ch duy nht 1 cp chim 2%.  thun ca ging theo du chuNn phân t ưc xác nh bng t l các phân on ng hình trên tng s các phân on ưc nhân và kt qu ưc trình bày  bng 7. Kt qu bng 7 cho thy, trong các t hp ang chn to thì t hp tm C2 có  thun thp nht t 73,77%, sau ó là t hp C21B - 74,44%, t hp L2 - 75,00%, t hp A27 - 77,42% và cao nht là t hp A18 t 78,01%. Kt qu nhn ưc phù hp vi cách ánh giá bng phương pháp truyn thng và công b ca mt s tác gi khác. Cho n nay, cách ánh giá  thun c truyn cn nhiu thi gian,  chính xác hn ch và ph thuc nhiu vào kinh nghim ca ngưi nuôi. Vi s tr giúp ca du chuNn phân t có th ch ng và ánh giá nhanh ch tiêu này. ây là nhng kt qu ban u ca vic s dng du chuNn phân t ánh giá  thun ca ging, m ra kh năng h tr hiu qu cho công tác chn to ging, góp phn ci thin cht lưng ging tm trong tương lai. Hình 2. Sản phm PCR mồi 0P019 M: marker 1 kb 1 - 10: Tổ hợp L2; 11 - 20: Tổ hợp C2 Hình 3. Sản phm PCR mồi HB10 M: marker 1kb 1 - 10: Tổ hợp C21B; 11 - 20: Tổ hợp A18 Bảng 2. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm C21B C21B.1 C21B 2 C21B.3 C21B.4 C21B.5 C21B.6 C21B.7 C21B.8 C21B.9 C21B.10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C21B.1 1.000 C21B 2 0.926 1.000 C21B.3 0.766 0.798 1.000 C21B.4 0.689 0.818 0.623 1.000 C21B.5 0.768 0.766 0.843 0.926 1.000 C21B.6 0.652 0.778 0.767 0.744 0.768 1.000 C21B.7 0.722 0.926 0.711 0.926 0.667 0.878 1.000 C21B.8 0.812 0.829 0.700 0.656 0.678 0.786 0.822 1.000 C21B.9 0.700 0.722 0.812 0.852 0.926 0.926 0.856 0.812 1.000 C21B.10 0.756 0.744 0.756 0.733 0.767 0.821 0.865 0.724 0.711 1.000 Bảng 3. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm C2 C2.1 C2 2 C2.3 C2.4 C2.5 C2.6 C2.7 C2.8 C2.9 C2.10 C2.1 1.000 C2 2 0.742 1.000 C2.3 0.763 0.654 1.000 C2.4 0.785 0.882 0.817 1.000 C2.5 0.796 0.828 0.642 0.654 1.000 C2.6 0.882 0.871 0.721 0.774 0.742 1.000 C2.7 0.682 0.624 0.785 0.796 0.742 0.828 1.000 C2.8 0.684 0.786 0.817 0.648 0.774 0.678 0.860 1.000 C2.9 0.817 0.682 0.652 0.882 0.785 0.882 0.871 0.658 1.000 C2.10 0.892 0.785 0.765 0.774 0.892 0.764 0.892 0.774 0.892 1.000 Bảng 4. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm L2 L2.1 L2 2 L2.3 L2.4 L2.5 L2.6 L2.7 L2.8 L2.9 L2.10 L2.1 1.000 L2 2 0.711 1.000 L2 3 0.822 0.856 1.000 L2.4 0.844 0.878 0.822 1.000 L2.5 0,678 0.878 0.822 0.933 1.000 L2.6 0.722 0.778 0.767 0.744 0.744 1.000 L2.7 0.844 0.656 0.711 0.644 0.667 0.811 1.000 L2.8 0.878 0.644 0.700 0.878 0.678 0.822 0.922 1.000 L2.9 0.644 0.722 0.711 0.844 0.689 0.900 0.844 0.878 1.000 L2.10 0.756 0.744 0.756 0.733 0.878 0.878 0.844 0.833 0.867 1.000 Bảng 5. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm A18 A18.1 A18.2 A18.3 A18.4 A18.5 A18.6 A18.7 A18.8 A18.9 A18.10 A18.1 1.000 A18.2 0.895 1.000 A18.3 0.843 0.948 1.000 A18.4 0.921 0.921 0.868 1.000 A18.5 0.737 0.842 0.842 0.763 1.000 A18.6 0.816 0.763 0.763 0.842 0.658 1.000 A18.7 0.764 0.763 0.816 0.737 0.658 0.895 1.000 A18.8 0.895 0.947 0.895 0.921 0.789 0.816 0.763 1.000 A18.9 0.895 0.711 0.895 0.684 0.605 0.895 0.737 0.763 1.000 A18.10 0.737 0.684 0.632 0.868 0.948 0.763 0.763 0.868 0.868 1.000 Bảng 6. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm A27 A27.1 A27.2 A27.3 A27.4 A27.5 A27.6 A27.7 A27.8 A27.9 A27.10 A27.1 1.000 A27.2 0.744 1.000 A27.3 0.864 0.744 1.000 A27.4 0.884 0.698 0.814 1.000 A27.5 0.837 0.721 0.791 0.884 1.000 A27.6 0.698 0.768 0.698 0.744 0.767 1.000 A27.7 0.791 0.721 0.698 0.884 0.86 0.814 1.000 A27.8 0.721 0.86 0.767 0.767 0.791 0.744 0.791 1.000 A27.9 0.791 0.674 0.744 0.744 0.721 0.721 0.767 0.93 1.000 A27.10 0.721 0.744 0.674 0.721 0.837 0.837 0.837 0.862 0.837 1.000 Bảng 7. Kết quả xác định độ thuần của các tổ hợp tằm Các tổ hợp C2 L2 C21B A18 A27 Độ thuần (%) 73,77 75,00 74,44 78,01 77,42 IV. KẾT LUẬN Sử dụng 10 mồi RAPD chọn lọc để phân tích tương quan di truyền của 5 tổ hợp tằm đang chọn tạo, hệ số tương quan được xác định trong khoảng 0,62 đến 0,93 và độ thuần thay đổi từ 73,77% ở tổ hợp C2 đến 78,01% ở tổ hợp A18, kết quả phù hợp với cách đánh giá theo phương pháp truyền thống, cần nghiên cứu hoàn thiện để đưa ứng dụng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 guyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, ông Văn Hải, 2004. Nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng 1/2004, tr. 19 - 24. 2 gô Lê Thương, Trịnh Hữu Hằng, guyễn Thị Thanh Bình, 2005. Nghiên cứu đa hình phân tử và nhận biết một số giống tằm lưỡng hệ Việt Nam bằng kỹ thuật PCR - RAPD. Hội nghị Khoa học toàn quốc những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống - 11/2005, tr.1424 - 1427. 3 Trần Duy Dương, Lưu Thị gọc Huyền, Vũ Đức Quang, Hoàng Tuyết Minh, 1999. Sử dụng phương pháp RAPD trong nghiên cứu đa hình một số dòng lúa phục vụ cho công tác giống. Hội nghị Công nghệ Sinh toàn quốc. NXB KH & KT, tr.1452 - 1458. 4 Chatterjee S.., Pradeep A.R, 2003. Molecular markers (RAPD) associated with growth, yield and origin of the silkworm Bombyx mori L. in Indian. Genetika, 39(12), pp.1612 - 1624. 5 William J.G.K., Kubelik, K.J. Livak, J.A.F. Rafalski, S.V. Tingey, 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primer are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res, 8, pp.6531 - 6535. gười phản biện: Trần Duy Quý T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 . NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐỒNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ THUẦN CỦA MỘT SỐ TỔ HỢP TẰM ĐANG CHỌN TẠO BẰNG DẤU CHUẨN PHÂN TỬ RAPD Đặng Đình Đàn,. Phân tích tương đồng di truyền và xác định độ thuần của các tổ hợp tằm Sử dụng 10 mồi RAPD đã tuyển chọn từ đề tài độc lập khác để khuếch đại ADN của