TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Tập 75A, Số 6, (2012), 49-55 49 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM Trichoderma VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Sclerotium rolfsii Sacc TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Trần Thị Thu Hà 1,2 , Phạm Thanh Hòa 1 1 Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế 2 Viện Tài Nguyên Môi Trường và Công Nghệ Sinh học, Đại học Huế Tóm tắt. Nấm Scleroitum rolfsii là nấm có nguồn gốc từ đất và có phổ ký chủ rộng. Việc phòng trừ nấm S. rolfsii gặp nhiều khó khăn. Nấm đối kháng Trichoderma có nhiều tiềm năng trong phòng trừ sinh học nấm S. rolfsii. Bốn mươi chủng nấm Trichoderma được phân lập từ 8 mẫu đất khác nhau ở Thừa Thiên Huế và Quảng Trị. Khảo nghiệm khả năng ức chế và đối kháng với S. rolfsii, có 11 chủng đối kháng cao; 26 chủng đối kháng trung bình, và 3 chủng đối kháng yếu. Mười một chủng ức chế cao có hiệu quả ức chế sợi nấm dao động 61,39 - 88,06%. Thời gian hình thành hạch nấm khi có mặt của nấm Trichoderma kéo dài hơn từ 5,33 - 7,67 ngày so với đối chứng (4,67 ngày). Sáu chủng nấm Trichoderma có khả năng ức chế giảm số lượng hạch nấm hình thành 0,00 - 1,91 hạch nấm/cm 2 tản nấm so với đối chứng (3,93 hạch nấm/cm 2 tản nấm). Trong đó đáng chú ý chủng ĐR 16 có khả năng ức chế hoàn toàn sự hình thành hạch nấm S.rolfsii, làm cho hạch nấm không hình thành được. Từ khoá: Đối kháng, hạch nấm, nấm có nguồn gốc từ đất, Trichoderma 1. Đặt vấn đề Nấm Sclerotium rolfsii là một trong những nấm có nguồn gốc từ đất, gây hại vùng rễ cây trồng cạn và có phổ ký chủ rộng. Nguồn bệnh của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật dạng sợi nấm, hạch nấm. Hạch nấm có sức sống cao, tồn tại từ năm này qua năm khác và là nguồn bệnh cho các cây trồng vụ sau, năm sau. Nấm S. rolfsii gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau, nhưng phổ biến nhất là gây hại trên lạc và cây trồng họ cà (Kolte, 1997). Hàng năm, thiệt hại do bệnh gây ra trên cây lạc ở Ấn Độ ước tính khoảng 27% về năng suất lạc, ở Australia vào khoảng 25% (Middleton, 1980). Ở Việt Nam, vùng Đông Nam Bộ có tỷ lệ bệnh 8-10% ở giai đoạn trước thu hoạch; miền Bắc Việt Nam tỷ lệ bệnh lên tới 20-25% (Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, 1991; Mehan et al., 1991). Nấm Trichoderma được ứng dụng để bảo vệ cây trồng chống các nấm và vi khuẩn gây bệnh. Nấm Trichoderma đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng thông qua nhiều cơ chế bao gồm ký sinh, chất kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của 50 Khả năng đối kháng của nấm trichoderma… nấm bệnh (Nguyễn Văn Đĩnh et al., 2007). Hiện nay, việc phòng trừ nấm S. rolfsii chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học. Tuy nhiên biện pháp này không bền vững và ảnh hưởng đến môi trường. Để phòng trừ nấm S. rolfsii chúng tôi phân lập nấm đối kháng Trichoderma và đánh giá hiệu lực ức chế của chúng đến tản nấm và sự hình thành hạch nấm của S. rolfsii trong điều kiện in vitro để chọn ra chủng Triochoderma có tiềm năng phòng trừ nấm S. rolfsii. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Bốn mươi chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập ở Thừa Thiên Huế và Quảng Trị (Bảng 1). Chủng nấm Sclerotium rolfsii Sacc H001 được phân lập từ vùng trồng lạc ở Phong Hòa, Phong Điền, Thừa Thiên Huế (Trần Thị Thu Hà et al., 2011). Lấy mẫu đất sâu xuống cách mặt đất 15 - 20 cm (khoảng 5 kg/điểm) cho vào bao nilong sạch (100m 2 lấy 7 điểm (35kg)), đem trộn đều, lấy ra khoảng 5kg cho vào bao nilong đem về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập. Sau đó lấy ngẫu nhiên ra 3g đất phân lập bằng phương pháp pha loãng trên môi trường chọn lọc ½ PDA theo phương pháp của Elad (1981) có bổ sung propamocarb (Askew, Laing, 1993). Tiến hành cấy truyền và làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử (Lester et al., 2008). Nhận dạng hình thái của nấm Trichoderma theo phương pháp của Elad (1981). Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma phân lập được đối với nấm S. rolfsii H001 trong điều kiện in vitro. Sử dụng môi trường ½ PDA trên đĩa petry Ø 9 cm. Cấy nấm đối kháng Trichoderma và nấm Sclerotium rolfsii đối xứng trên cùng một đĩa môi trường ½ PDA. Công thức đối chứng chỉ cấy nấm Sclerotium rolfsii, không cấy nấm Trichoderma (Nguyễn Thị Thuần et al., 1996). Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh được phân thành 4 cấp và đánh giá mức độ kháng (Nguyễn Thị Thuần et al., 1996; Trần Kim Loang et al., 2009). Tóm tắt như sau: + Đối kháng cao (+++): Nấm Trichoderma ức chế nấm S. rolfsii ≥60%. + Đối kháng trung bình (++): Nấm Trichoderma ức chế S. rolfsii ≥40-59. + Đối kháng yếu (+): Nấm Trichoderma ức chế nấm S. rolfsii ≤40-20. + Không đối kháng (-): Nấm Trichoderma ức chế nấm S. rolfsii ≤19. Đo đường kính tản nấm của nấm gây bệnh S. rolfsii và nấm Trichoderma sau 5 ngày (cm) nuôi cấy để tính % ức chế và đánh giá mức độ đối kháng. Tính hiệu quả ức chế theo công thức Abort. Theo dõi thời gian hình thành hạch nấm S. rolfsii trên đĩa petry cấy đối xứng với TRẦN THỊ THU HÀ, PHẠM THANH HÒA 51 nấm Trichoderma. Đếm số hạch nấm tạo thành ở đĩa có cả nấm Trichoderma và S. rolfsii và ở đĩa đối chứng. Tính số hạch nấm hình thành/cm 2 tản nấm S. rolfsii. Thí nghiệm được bố trí với 3 lần nhắc lại. Số liệu được xử lý bằng ANOVA (Tukey test) bằng phần mềm thống kê SPSS 13.0 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Phân lập nấm Trichoderma từ các mẫu đất Hầu hết các mẫu đất dùng phân lập đều thấy có sự hiện diện của nấm Trichoderma với số lượng chủng phân lập được khác nhau. Trong 8 mẫu đất chúng tôi phân lập tổng cộng được 40 chủng nấm Trichoderma (Bảng 1). Bảng 1. Kết quả phân lập nấm Trichoderma từ các mẫu đất khác nhau T T Ký hiệu Phân lập từ Địa điểm lấy mẫu Số chủng Trichoderma 1 ĐR Đất rác Quảng Thọ, Quảng Điền, TT Huế 3 2 ĐLT Đất dưới vỏ trấu, rơm ủ Quảng Thọ, Quảng Điền, TT Huế 8 3 ĐP Đất dưới đống phân chuồng Quảng Thọ, Quảng Điền, TT Huế 4 4 ĐRN Đất dưới đống rơm Quảng Thọ, Quảng Điền, TT Huế 1 5 ĐĐ Đất trồng tiêu Cam thành, Cam Lộ, Quảng Trị 11 6 ĐV Đất phù sa trồng lạc Cam Thành, Cam Lộ, Quảng Trị 6 7 ĐTL Đất trồng lạc Quảng Thọ, Quảng Điền, TT Huế 3 8 ĐTƠ Đất trồng ớt Quảng Thọ, Quảng Điền, TT Huế 4 Tổng 40 3.2. Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma phân lập được đối với nấm S. rolfsii. Trong 40 chủng nấm Trichoderma được khảo sát tính đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii, có 11 chủng ức chế mạnh, chiếm 27,5%; 26 chủng mẫu đối kháng trung bình, chiếm 65,0% và 3 mẫu đối kháng yếu, chiếm 7,5%. 52 Khả năng đối kháng của nấm trichoderma… Bảng 2. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm S. rolfsii H001 Mức đối kháng của Trichoderma Số chủng Tỉ lệ (%) Đối kháng cao 11 27,5 Đối kháng trung bình 26 65,0 Đối kháng yếu 3 7,5 Không đối kháng 0 0,0 Tổng 40 100,0 Chúng tôi tiếp tục tập trung khảo sát đánh giá hiệu quả ức chế của các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh (Bảng 3). Hiệu lực ức chế tản nấm S. rolfsii dao động từ 61,39 - 88,06%. Chủng có hiệu lực ức chế cao nhất là ĐR16. Hạch nấm là giai đoạn bắt buộc trong chu kì phát triển của nấm S. rolfsii, do nhiều sợi nấm đang kết lại với nhau tạo ra hạch nấm. Hạch nấm có sức sống cao và dạng bảo tồn nguồn bệnh của nấm S. rolfsii (Agrios, 2004). Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng ức chế thời gian hình thành hạch nấm cũng như số lượng hạch nấm đóng vai trong quan trọng khi ứng dụng trong thực tiễn sản xuất. Ở công thức đối chứng thì thời gian hình thành hạch nấm rất sớm, chỉ sau 4,67 ngày. Còn ở các công thức khác có mặt của nấm Trichoderma thì thời gian hình thành hạch nấm kéo dài hơn 5,33 - 7,33 ngày. Sáu chủng nấm Trichoderma (ĐTO14, ĐLT15, ĐR16, ĐĐ19, ĐRN21, ĐTL25) ức chế sự hình thành hạch nấm đạt từ 0,00 - 1,91 hạch nấm/cm 2 tản nấm giảm đáng kể có ý nghĩa so với đối chứng (3,93 hạch nấm/cm 2 tản nấm). Đặc biệt chủng ĐR16 ức chế hoàn toàn khả năng hình thành hạch nấm (Bảng 3). Như vậy, khả năng ức chế hình thành hạch nấm tức là có thể hạn chế được sự tích lũy nguồn bệnh và lây lan của nguồn bệnh ngoài đồng ruộng. Khi có mặt của nấm Trichoderma, thì nấm Trichoderma phát triển nhanh hơn nấm bệnh S. rolfsii, chiếm vị trí, cạnh tranh thức ăn, tiết chất kháng sinh ức chế sự phát triển của nấm bệnh, từ đó ức chế sự hình thành của hạch nấm. Đặc biệt, chủng ĐR 1,6 cần được nghiên cứu tiếp tục để có cơ sở phát triển và sử dụng chủng nấm Trichoderma này trong sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng trong thực tiễn sản xuất. Bảng 3. Tác dụng ức chế của nấm Trichoderma đến tản nấm và hình thành hạch nấm S. rolfsii TT Chủng Trichoderma ĐK tản nấm S. rolfsii (cm) Hiệu lực ức chế (%) Hình thành hạch nấm (Ngày) Số hạch nấm/cm 2 tản nấm 1 Đối chứng 8,63 e 0,00 4,67 3,93 e 2 ĐP11 3,33 d 61,39 5,33 2,72 bcde TRẦN THỊ THU HÀ, PHẠM THANH HÒA 53 3 ĐTO14 3,10 bcd 64,09 5,33 1,65 abc 4 ĐLT15 3,33 d 61,39 7,67 1,65 abc 5 ĐLT214 3,30 d 61,78 5,67 2,49 bcde 6 ĐR16 1,03 a 88,06 0,00 0,00 a 7 ĐĐ19 2,73 bc 68,34 6,33 1,21 ab 8 ĐRN21 2,60 b 69,88 6,33 1,91 bcd 9 ĐV22 3,07 bcd 64,48 6,33 3,11 cde 10 ĐTL24 2,83 bcd 67,18 6,67 2,64 bcde 11 ĐTL25 2,73 bc 68,34 7,33 1,89 bcd 12 ĐTL26 3,33 d 61,39 6,33 3,27 cde Ghi chú: Trong một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa với p< 0,05; ĐK: Đường kính Hình 1. Khả năng ức chế của Trichoderma đối với nấm S. rolfsii H001 trên môi trường ½PDA. Chủng ĐR16 và chủng ĐRN21 4. Kết luận Đã phân lập được 40 chủng nấm Trichoderma để khảo nghiệm khả năng ức chế và đối kháng với nấm bệnh S. rolfsii, trong đó có 11 chủng có hiệu quả ức chế cao; 26 chủng đối kháng trung bình và 3 chủng có khả năng ức chế yếu. Tiếp tục đánh giá khả năng ức chế của 11 chủng đối kháng cao cho thấy mức độ ức chế của 11 chủng dao động từ 61,39 - 88,06%. Thời gian hình thành hạch nấm khi có mặt của nấm Trichoderma kéo dài hơn có ý nghĩa thống kê từ 5,33 - 7,67 ngày so với đối chứng (4,67 ngày). Sáu chủng nấm Trichoderma (ĐTO14, ĐLT15, ĐR16, ĐĐ19, ĐRN21, ĐTL25) có khả năng ức chế giảm số lượng hạch nấm hình thành 0,00 - 1,91 hạch nấm/cm 2 tản nấm so với đối chứng (3,93 hạch nấm/cm 2 tản nấm). Trong đó đáng chú ý chủng ĐR16 có khả năng ức chế 100% sự hình thành hạch nấm S.rolfsii. 54 Khả năng đối kháng của nấm trichoderma… TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Văn Đĩnh và cs, Giáo trình biện pháp sinh học bảo vệ thực vật, Nxb. Nông Nghiệp Hà Nội, 2007, 128-143. [2]. Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Kết quả nghiên cứu bệnh hại lạc ở Việt Nam, Tiến bộ kỹ thuật về trồng lạc và đậu đỗ ở Việt Nam, Nxb. Nông Nghiệp, Hà Nội, 1991, 111-120. [3]. Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero, Hien Thuy Phan, Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam, Nxb. Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR), 2008. [4]. Trần Kim Loang, Lê Đình Đôn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, Nguyễn Thị Tiến Sỹ, Trần Thị Xê, Phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora trên cây hồ tiêu bằng chế phẩm sinh học Trichoderma (Trico-VTN) tại Tây Nguyên, Tạp chí chuyên ngành bảo vệ thực vật, Số 2, (2009), 22-27. [5]. Mehan VK, Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Ly, Kết quả điều tra, xác định nguyên nhân gây hiện tượng chết yểu hại lạc ở miền Bắc Việt Nam, Tiến bộ kỹ thuật về trồng lạc và đậu đỗ ở Việt Nam, Chủ biên: Ngô Thế Dân và C,L,L, Gowda, Nxb. Nông Nghiệp Hà Nội, 1991, 105-109. [6]. Nguyễn Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, Kết quả nghiên cứu bước bầu về nấm đối kháng Trichoderma, Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1990- 1995, Nxb. Hà Nội, 1996. [7]. Trần Thị Thu Hà, Trương Thị Diệu Hạnh, Trần Thị Nga, Ảnh hưởng của chất hoạt hóa bề mặt từ các chủng vi khuẩn Pseudomonas đến nấm gây bệnh héo rũ lạc ở điều kiện in vitro, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 2, (2011), 30-34. [8]. Agrios GN., Plant pathology, 5 th edition. Elsevier Academic Press Publication, 2004. [9]. Askew DJ, Laing MD, An adapted selective medium for the quantitative isolation of Trichoderma species, Plant Pathol 42: (1993), 686-690. [10]. Elad Y, Chet I, Henis Y., A selective medium for improving qualitative isolation of Trichoderma spp. from soil, Phytoparasitica 9: (1981), 59-67. [11]. Kolte SJ., Annual oilseed crops in soilborne diseases of tropical crops. RJ Hillocks and JM Waller (eds) Soilborne Diseases of Tropical Crops, CAB International, (1997), 253-276. [12]. Middleton KJ., Groundnut production, utilization, research problem and further research needs in Australia. In: Proc. Int. Workshop on groundnuts, 13-17 October, 1980 Patancheru, Andhra Pradesh, India, 1980. TRẦN THỊ THU HÀ, PHẠM THANH HÒA 55 ANTAGONISTIC ACTIVITY OF Trichoderma ISOLATES AGAINST PLANT PATHOGENIC FUNGUS Sclerotium rolfsii Sacc IN THE IN VITRO CONDITION Tran Thi Thu Ha 1,2 , Pham Thanh Hoa 1 1 College of Agriculture and Forestry, Hue University 2 Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University Abstract. Scleroitum rolfsii is a soilborne fungus that attacks a wide range of host. There have been a lot of difficulties controlling the plant pathogenic disease caused by S. rolfsii. Antagonistic Trichoderma is a well-known potential biocontrol agent. Forty Trichoderma isolates were isolated from 8 soil samples from Thua Thien Hue and Quang Tri. The antagonism of 40 Trichoderma isolates with S. rolfsii was investigated by the dual culture asay in which 11 isolates were strong antagonists; 27 isolates were moderate and 3 isolates were weak. Elevent strong antagonist isolates were further charaterised and showed a S. rolfsii mycelial inhibition efficiency of 61,39 – 88,06%. The presence of Trichoderma in the dual culture asay also prolonged the length of time needed to produce sclerotia from 5,33 to 7,67 days in comparison with the control (4,.67 days). Six Trichoderma isolates significantly inhibited the formation of sclerotia from 0,00 to 1,91 sclerotia/cm 2 of mycelia, while the control produced 3,93 sclerotia/cm2 of mycelia. Noticeably, the isolate ĐR16 completely inhibited the formation of sclerotia; no sclerotia were formed. Keywords: Antagonistics, biocontrol, sclerotia, soilborne fungus, Trichoderma. . (2012), 49-55 49 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM Trichoderma VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Sclerotium rolfsii Sacc TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Trần Thị Thu. mẫu đối kháng yếu, chiếm 7,5%. 52 Khả năng đối kháng của nấm trichoderma Bảng 2. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm S. rolfsii H001 Mức đối