TCNCYH 23 (3) 2003 ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA TS. Bạch Khánh Hoà Labo trung tâm y sinh học, Đại học Y Hà Nội Phức hệ chủ yếu hoà hợp mô ở ngời chiếm một vùng khoảng từ 4 đến 5 megabaes (Mb) trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6. Trong lịch sử, kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA: Human leucocyt Antigen) đợc xác định bằng huyết thanh học, sau đó là kỹ thuật tế bào, kỹ thuật tính đa dạng các mảnh do men hạn chế(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP). Ngày nay, kỹ thuật đợc sử dụng nhiều và có độ tin cậy cao là oligonucleotid probe. Phân tử HLA rất đa dạng, các kháng nguyên này gây ra cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào. Trong bài này chúng tôi trình bày kỹ thuật: Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi có trình tự đặc hiệu (PCR- SSP: Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers) để định nhóm HLA nhằm mục đích sử dụng trong lâm sàng chọn hoà hợp ngời cho và ngời nhận tạng mà chúng tôi đã thực hiện ở Việt Nam từ 2000. 1. Mở đầu: kháng nguyên miễn dịch bạch cầu của ngời (human leucocyte antigen- HLA) nằm một phần quan trọng trong hệ thống di truyền, đợc gọi là hệ thống chủ yếu hoà hợp mô (complex major histocompatibilite CMH), hệ thống này nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 (đoạn 6p21.3). Lần đầu tiên hệ thống này đợc phát hiện bởi J.Dausset, 1958, và ông đã đợc nhận giải thởng Nobel về Y học năm 1980 [1]. HLA có vai trò chủ đạo trong đáp ứng miễn dịch. Tính đa dạng trong cấu trúc đã dẫn đến những khó khăn trong xác định kháng nguyên và hiểu biết về chức năng của nó ứng dụng trong lâm sàng. Vai trò của HLA trong sự nhận biết cái tôi và không phải tôi rất quan trọng trong ghép cơ quan, ghép tuỷ, cũng nh đáp ứng miễn dịch ở mức độ peptit. Nh vậy, với những cấu trúc và chức năng khác nhau phân tử HLA giúp cho chúng ta hiểu ngày càng rõ hơn cơ chế đáp ứng miễn dịch. 2. Kỹ thuật định nhóm HLA: trải qua nhiều giai đoạn kể từ khi phát minh ra hệ thống HLA cho đến nay có rất nhiều kỹ thuật đã đợc áp dụng trong việc xác định kháng nguyên của hệ thống này, ngời ta tạm chia nó ra làm hai nhóm: kỹ thuật huyết thanh học và kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định tính đa dạng của HLA bộc lộ trên bề mặt tế bào. 2.1.Kỹ thuật huyết thanh học: những năm 1954 là những năm đầu tìm hiểu về hệ thống HLA, ngời ta chỉ dùng phản ứng ngng kết bạch cầu sau đó tiến thêm một bớc, đó là kỹ thuật vi độc tế bào tiêu thụ bổ thể. Dùng tế bào bạch cầu sau khi tách qua Ficoll rồi nhỏ vào các giếng đã có những huyết thanh mang kháng thể đặc hiệu đợc biết trớc, sau đó nhỏ thêm bổ thể thỏ sẽ dẫn đến hiện tợng chết tế bào nếu có phản ứng kháng nguyên kháng thể và xác định hiện tợng này thông qua nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm, đọc kết quả dới kính hiển vi đảo ngợc. Cho đến nay kỹ thuật này vẫn đợc sử dụng ở nhiều phòng xét nghiệm. Trong bài này chúng tôi đề cập đến những kỹ thuật đang đợc sử dụng nhiều nhất, đó là những kỹ thuật về sinh học phân tử. 2.2. Sự phát triển ngày càng gia tăng trong nuôi cấy dòng tế bào thì sự hiểu biết gen của lớp I (1980) và lớp II (1982) cũng ngày càng sâu sắc hơn giúp cho giải thích đợc ADN bổ sung và bộ gen (genomique) cho phép chúng ta sử dụng sonde thứ hai của HLA.Ngời ta có thể sử dụng sond này trong phản ứng lai với ADN của bộ gen để nghiên cứu tính đa dạng của loci Tiến sĩ, phó trởng Labo Trung tâm Y sinh học trờng Đại học Y Hà Nội. 130 TCNCYH 23 (3) 2003 hay của allen. Kỹ thuật sinh học phân tử đầu tiên đợc áp dụng trong định nhóm HLA dựa trên sự phân tích số lợng và kích thớc đoạn ADN lai với sond đặc hiệu của HLA sau khi nó bị cắt bởi enzym giới hạn. Kỹ thuật này gọi tên là " tính đa dạng các mảnh do men hạn chế (RFLP) [2]. Đây là kỹ thuật định nhóm HLA đợc sử dụng chủ yếu trong workshop-HLA 1997, và cho thấy có nhiều tiến bộ quan trọng, nhất là trong xác định và nghiên cứu tính đa dạng của lớp II, trong ghép cơ quan và tổ chức. Kỹ thuật RFLP cũng lần đầu tiên cho phép xác định HLA-DP mà không cần đến kỹ thuật tế bào và giải thích những hiện tợng không giống nhau của DP trong nuôi cấy hỗn hợp hai quần thể tế bào (culture mixte) [3]. Nó cũng còn là một cuộc cách mạng về mối liên quan giữa HLA và bệnh, miễn dịch kháng bạch cầu giữa mẹ và con [4] Kỹ thuật phản ứng chuỗi khuyếch đại gen (polymerase chain reaction - PCR) là một cuộc cách mạng cho mọi nghiên cứu về gen, giải trình tự gen, và nhất là nghiên cứu về tính đa dạng. Kỹ thuật này có độ nhạy cao, đặc hiệu và đơn giản trong những nghiên cứu về gen. Điều quan trọng trong là sự chọn lựa đoạn mồi sao cho đạt đợc những yêu cầu về tính đặc hiệu. Dựa trên những nguyên tắc chính mà ngời ta tạm chia nó làm 3 nhóm phơng pháp nh sau: Phản ứng chuỗi polymerase với những oligosondes đặc hiệu đánh dấu phóng xạ hoặc enzym của allele hay trình tự gen (PCR-SSO: Polymerase Chain Reaction -Sequence Specific Oligoprobes) Tính đa dạng các mảnh do men hạn chế (RFLP). Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi có trình tự đặc hiệu (PCR- SSP) Kỹ thuật PCR cho phép đánh dấu sự tiến bộ trong xác định tính đa dạng của gen HLA lớp II và nhận biết đợc chính xác những alleles khác nhau của DRB1 và DPB1. Tính đa dạng của lớp I cũng gặp những khó khăn khi sử dụng kỹ thuật PCR vì lý do giàu pseudogenes cùng khuyếch đại trong vùng của lớp I. 2.3. Kỹ thuật PCR-SSP: ngày nay trong nhiều phòng thí nghiệm hoà hợp mô trên thế giới ngời ta sử dụng kỹ thuật PCR là kỹ thuật thờng quy để định nhóm kháng nguyên bạch cầu, 1999 Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An và cộng sự của bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh trờng Đại học Y Hà Nội đã thực hiện kỹ thuật này để định nhóm DRB1 [2]. Từ tháng 10- 2000 tại phòng thí nghiệm Y Sinh học của trờng Đại học Y Hà Nội, chúng tôi cũng đa vào thực hiện kỹ thuật PCR-SSP để định nhóm cho HLA- A, B, DR, DQ. Loại kit chúng tôi sử dụng là Độ phân giải thấp (Low resolution) của Dynal, nó cho kết quả tơng đơng với kết quả làm huyết thanh học. Kỹ thuật PCR-SSP đợc sử dụng để chọn lựa ngời cho và ngời nhận trong ghép tuỷ, ghép cơ quan, tìm mối liên quan giữa HLA với một số bệnh Đối với kít Độ phân giải cao (High resolution) xác định đợc allele có mặt trên nhiễm sắc thể sẽ cho kết quả có độ phân tích cao hơn nhng giá thành đắt. Vì vậy chúng tôi lựa chọn kỹ thuật PCR-SSP độ phân giải thấp dựa trên những điểm sau: - Chất lợng kỹ thuật: không cho hoặc rất ít hiện tợng dơng tính giả - Thời gian thực hiện kỹ thuật ngắn - Giá thành xét nghiệm không cao - Trang thiết bị trong phòng thí nghiệm của chúng tôi đảm bảo thực hiện đợc kỹ thuật này Không gây độc nhiều cho ngời thực hiện do hoá chất sử dụng gây ra. Vì vậy, chúng tôi nhận thấy kỹ thuật này phù hợp với tình hình thực tế ở Việt Nam Kỹ thuật PCR-SSP là kỹ thuật sử dụng những mồi đợc khuyếch đại từ phía đầu tận 3. Phản ứng chỉ bao gồm 2 giai đoạn chính là PCR và điện di trên gen agarose để đọc kết quả. Các bớc tiến hành nh sau: . Tách ADN từ máu toàn phần theo kỹ thuật perchlorate sodium (kỹ thuật S.A. Miller, D.D. Polesky- 1988). .Thực hiện phản ứng PCR bằng kit Dynal: trong mỗi tube đã có sẵn mồi đặc hiệu và nhỏ 131 TCNCYH 23 (3) 2003 thêm 10 àl bao gồm: 0.1 àl Amplitaq DNA polymerase, 8,9àl đệm SSP-PCR Maaster mix, 1àl DNA cần xác định, trộn kỹ và chạy trên máy khuyếch đại gen Gene Amp PCR system 9700 với chu kỳ: 96 o C trong 2 phút, tiếp đến 10 chu kỳ: 96 o C trong 15 giây, 65 o C trong 60 giây, và 20 chu kỳ: 96 o C trong 10 giây, 61 o C trong 50 giây, 72 o C trong 30 giây . Điện di trên gen agarose 2% trong đệm TAE 0.5M, 100vol trong 15phút . Chụp ảnh và phân tích kết quả bằng phần mềm của Dynal bán kèm theo kit. Chúng tôi cũng xin trình bày sơ lợc về quy định danh pháp quốc tế: do có sự tiến bộ trong kỹ thuật định nhóm HLA nên các quy định về danh pháp cũng thờng xuyên đợc thông qua ở các hội nghị quốc tế về HLA, nó cho phép phân biệt kỹ thuật sử dụng trong định nhóm HLA là huyết thanh học hay sinh học phân tử [4]. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử ngời ta quy định cách viết nh sau: HLA + locus + * + alen (2 hoặc 4 con số). Hình 1: Kết quả sản phẩm PCR-SSP sau điện di trên gen agarose 2% 2 con số đầu tơng ứng với tính đặc hiệu của kháng nguyên đợc xác định (A* 01 là kháng nguyên A1) điều này đôi khi không đúng với một số alen ví dụ trong nhóm alen B*15 thì B*1502 tơng ứng với kháng nguyên đợc xác định bằng huyết thanh học là B75, ngợc lại có trờng hợp có những alen đợc phát hiện bằng kỹ thụât sinh học phân tử mà kỹ thuật huyết thanh học không phát hiện đợc. Các áp dụng chính trong việc định nhóm HLA bằng kỹ thuật PCR-SSP: đối với kỹ thuật PCR-SSP chúng tôi đã ứng dụng trong lâm sàng với một số trờng hợp sau: HLA và bệnh: tuỳ thuộc vào lớp I hay lớp II mà ngời ta đã đa ra những mối liên quan giữa HLA và một số bệnh nh : viêm cột sống dính khớp, đái đờng không phụ thuộc insulin týp Ivà dựa vào mối liên quan này ngời ta đã đa ra những cơ chế mà trong đó peptid của phân tử HLA giữ vai trò chủ yếu. Định nhóm HLA trong ghép: dựa trên nhóm HLA đợc xác định giữa ngời cho và ngời nhận để quyết định có ghép thận cho bệnh nhân hay không? Tóm lại: do chức năng trình diện đặc hiệu kháng nguyên peptid, do tính đa dạng của các phân tử đợc biểu lộ, vai trò phân định danh 132 TCNCYH 23 (3) 2003 mục của lymphô T nên hệ thống HLA đóng một vai trò chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch. Điều này giải thích những đóng góp của hệ thống này trong ghép , trong mối liên quan của nó với một số bệnh, trong cảnh giác với phát triển u, trong truyền máu và trong nghiên cứu quần thể hay trong pháp y. Nếu việc mô tả tính đa dạng của phân tử và gen học đã cho những thành công liên tục trong ghép (đặc biệt trong ghép tuỷ xơng). Những nghiên cứu về trình tự kháng nguyên và gen còn giải thích đợc ngày càng rõ hơn sự liên quan trong tính nhạy cảm hay đề kháng của một số bệnh (đặc biệt là bệnh tự miễn). Điều này đã giúp các thầy thuốc lâm sàng trong miễn dịch trị liệu nhằm khôi phục lại những hoạt động bình thờng của hệ thống miễn dịch. Tài liệu tham khảo 1. Vũ Triệu An, J.C.Homberg : Miễn dịch học. 1997, 105: 120-123. 2. S.A.Miller, D.D.Dykes and H.F. Polesky: A simple salting out procedure for extracting DNA from humain nucleated cells. Nucleic acids research. 1988, 16: 1215-1218. 3. Wake CT, Long EO, Mach B: Allelic polymorphism and complexity of the genes for HLA-DR chains direct analysis by DNA- DNA hybridization. Nature. 1982, 300: 372- 374. 4. Bignon JD, Semana G, Tiercy M et al: DNA- RFLP analysis: HLA-DR workshop report. In : Dupon B, ed. Immunology of HLA. Newyork: Springer-Verlag. 1989, 851-860. 5. Williams F et al.: Development of PCR SSOP for the identification of HLA-A* 02 subtypes and determination of HLA- A* 02 frequencies within different ethnic populations. TISSUE Antigens. 1997, 49: 129-133. 6. Bodmer JG et al: Nomenclature for factors of the HLA system 1998. Tissue Antigens. 1999, 53: 407- 446. Summary Genotyping for HLA The major histocompatibility complex in humans (MHC), located on the short arm of chromosome 6, spans a distance of approximately about 4 to 5 megabase (Mb). Historically, HLA antigens have been defined by serologic techniques, and cellular techniques, DNA analyses using restriction fragment length polymorphisme (RFLP) and now is oligonucleotid probe (used in conjunction with the polymerase chain reaction or another process that amplifies the relevant gene copy). HLA molecules contain multiple alloepitopes that are capable of inducing humoral and cellular responses during alloimmunization. This paper, we present the clinical HLA testing: HLA typing (PCR-SSP) to identify HLA specificities to determine compatibility between a specific donnor- recipient pair. 133 . hiện bằng kỹ thụât sinh học phân tử mà kỹ thuật huyết thanh học không phát hiện đợc. Các áp dụng chính trong việc định nhóm HLA bằng kỹ thuật PCR-SSP: . trong kỹ thuật định nhóm HLA nên các quy định về danh pháp cũng thờng xuyên đợc thông qua ở các hội nghị quốc tế về HLA, nó cho phép phân biệt kỹ thuật