TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA TH ỦY SẢN TRẦN THỊ ĐAN THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ ĐAN THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Trong năm tháng giảng đường đại học kiến thức tích lũy hành trang quý báu cho đường phát triển nghề nghiệp tương lai Vì thực luận văn tốt nghiệp lựa chọn tốt để tổng hợp kiến thức năm học nhiều sinh viên có cá nhân tơi Tuy nhiên để hồn thành luận văn ngồi phấn đấu thân cịn ủng hộ từ gia đình tận tâm hướng dẫn quý thầy cô Do muốn gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình động viên suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ truyền đạt kiến thức quý báu khoảng thời gian học tập Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Đặng Thị Hồng Oanh Đặng Thụy Mai Thy tận tình hướng dẫn suốt thời gian học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn Bùi Thị Bích Hằng, Trần Thị Tuyết Hoa quan tâm động viên thời gian qua Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Bệnh học thủy sản K31 giúp đỡ thời gian học tập trường i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Sau phục hồi từ nguồn vi khuẩn sưu tập 10 chủng 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223 kiểm tra kháng sinh đồ loại kháng sinh ampicillin chloramphenicol Đồng thời vi khuẩn dùng cho thí nghiệm MTT Kết thu phương pháp kháng sinh đồ MTT cho thấy tất chủng vi khuẩn nhạy với kháng sinh ngoại trừ chủng CAF258, E223 kháng ampicillin chủng T8 kháng chloramphenicol Đề tài tiến hành nghiên cứu thí nghiệm MTT mô thận tươi Kết thu cho thấy sau sử dụng chloramphenicol mật độ tế bào tồn giảm từ 1-10% so với sử dụng ampicillin Bên cạnh thực thí nghiệm MTT mơ giảm thời gian (còn 1,5 ngày) hạ giá thành từ 7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v Chương I: GIỚI THIỆU Chuơng II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh mủ gan cá tra 2.2 Bệnh mủ gan 2.2.1 Tác nhân gây bệnh 2.2.2 Đường lây truyền 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 2.3 Thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản 2.3.1 Định nghĩa 2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh điều trị 2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh 2.3.4 Cơ chế kháng thuốc 2.3.5 Những nghiên cứu kháng sinh E.ictaluri 2.4 Thí nghiệm MTT 2.4.1 Định nghĩa 2.4.2 Những điểm đặc trưng thí nghiệm MTT 10 2.4.3 Các nghiên cứu thí nghiệm MTT 10 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 3.2 Nội dung nghiên cứu 13 3.3 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 14 3.3.1 Đối tượng thí nghiệm 14 3.3.2 Vật liệu 14 3.3.3 Thiết bị 14 3.3.4 Hóa chất 15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 15 3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 15 3.4.2 Kháng sinh đồ 16 3.4.3 Thí nghiệm MTT 17 3.4.4 Xử lý số liệu 21 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết thí nghiệm vi khuẩn 22 4.1.1 Kết kháng sinh đồ 22 4.1.2 Kết thí nghiệm MTT vi khuẩn 24 4.1.3 So sánh số lượng vi khuẩn tồn sau sử dụng kháng sinh phương pháp kháng sinh đồ thí nghiệm MTT 29 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy kháng sinh thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 33 4.2 Kết thí nghiệm mô tươi 34 4.2.1 Sự sai khác mô bệnh mô bệnh sử dụng kháng sinh 34 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 5.1 Kết luận 41 5.1.1 Sự mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn theo kháng sinh đồ 41 5.1.2 Sự mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn theo thí nghiệm MTT 41 5.1.3 Sự mẫn cảm kháng sinh mơ theo thí nghiệm MTT 41 5.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 46 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Nguồn gốc chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 15 Bảng 3.2: Đường kính vịng trịn vơ trùng số thuốc kháng sinh 16 Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào hàng đầu đĩa 96 giếng 17 Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu mô vào đĩa 96 giếng 20 Bảng 4.1: Đường kính trung bình vịng vơ trùng 10 chủng vi khuẩn 22 Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn sau sử dụng kháng sinh qua phương pháp kháng sinh đồ 23 Bảng 4.3: Sự sai khác vi khuẩn vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT 26 Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn sau sử dụng kháng sinh thí nghiệm MTT vi khuẩn 27 Bảng 4.5: Sự sai khác mô bệnh mô bệnh sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT 36 Bảng 4.6: Số lượng tế bào tồn sau sử dụng kháng sinh thí nghiệm MTT mơ 37 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1: Mẫu vi khuẩn & MTT 25 Hình 4.2: Mẫu vi khuẩn & MTT sau ủ 25 Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 108 cfu/ml tồn sau sử dụng Ampicillin thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 29 Hình 4.4: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 108 cfu/ml tồn sau sử dụng Chloramphenicol thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 29 Hình 4.5: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 107 cfu/ml tồn sau sử dụng Ampicillin thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 30 Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 107 cfu/ml tồn sau sử dụng Chloramphenicol thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 30 Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 106 cfu/ml tồn sau sử dụng Ampicillin thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 31 Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 106 cfu/ml tồn sau sử dụng Chloramphenicol thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 31 Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 105 cfu/ml tồn sau sử dụng Ampicillin thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 32 Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 105 cfu/ml tồn sau sử dụng Chloramphenicol thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 32 Hình 4.11: Thời gian xác định tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 33 Hình 4.12: Mẫu mơ &MTT 35 Hình 4.13: Mẫu mơ & MTT sau ủ 35 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Nafiquaved MTT NCCLS ATCC E.ictaluri MIC MBC IC50 AM CH CK CB KS Đồng Bằng Sơng Cửu Long Cục Quản lý chất lượng, An tồn vệ sinh Thú y thủy sản (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) National Committee for Clinical Laboratory Standards American Type Culture Collection Edwardsiella ictaluri Minimum Inhibitory Concentration Minimum Bactericidal Concentration The half maximal inhibitory concentration Ampicillin Chloramphenicol Cá khỏe Cá bệnh Kháng sinh vii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU Trong trình hội nhập WTO đồng thời chịu ảnh hưởng tình hình kinh tế khó khăn chung giới xuất thủy sản Việt Nam có bước vững ổn định Tháng 7-2008, doanh nghiệp chế biến xuất 136.000 thủy sản loại, đạt kim ngạch gần 476 triệu USD Đây tháng có mức tăng trưởng cao năm qua sản lượng lẫn giá trị, tạo đà cho xuất thủy sản đích (www.atpvietnam.com, 18.11.2008) Theo Hiệp hội Chế biến Xuất thủy sản Việt Nam (VASEP), tháng đầu năm 2008 xuất thủy sản nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD, tăng 20% so kỳ năm ngối, đó, sản phẩm cá tra- ba sa chiếm 31,9% Riêng tháng 7- 2008, kim ngạch xuất cá tra, ba sa vào Nga tăng đến 64 lần so với tháng 7-2007 Song song với phát triển nghề ni vấn đề dịch bệnh ngày trở nên trầm trọng, tỉ lệ xuất bệnh mủ gan cá tra cao khoảng 61% (Trần Anh Dũng, 2005) có xu hướng ngày tăng Thiệt hại bệnh lớn, tỷ lệ cá chết lên đến 90% cá tra giống 50% cá nuôi thương phẩm (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007) Khi bệnh xảy ra, người dân thường sử dụng sản phẩm thuốc thú y- thủy sản chứa kháng sinh kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, không liều lượng, sử dụng với liều lượng thấp để phòng bệnh dẫn đến dịch bệnh ngày diễn biến phức tạp, khó điều trị hơn, tỷ lệ sống cá ngày thấp (Nguyễn Chính, 2005) Một phương pháp sử dụng phổ biến để xác định loại kháng sinh liều lượng thích hợp việc điều trị bệnh mủ gan cá tra phương pháp lập kháng sinh đồ Tuy nhiên phương pháp lập kháng sinh đồ truyền thống đòi hỏi nhiều thời gian để phân lập, ni cấy Vì đề tài “Nghiên cứu khả ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ quan bệnh phẩm mủ gan cá tra” nhằm đánh giá độ tin cậy biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ quan bệnh phẩm mủ gan cá tra Nhờ vào đề xuất việc sử dụng thuốc kháng sinh phù hợp, góp phần tăng suất sản lượng, hướng đến nghề nuôi cá tra thâm canh bền vững Nội dung: Dùng MTT để ước lượng mật độ vi khuẩn có dịch mơ bệnh phẩm dịch huyền phù từ khuẩn lạc Kiểm tra tính nhạy vi khuẩn biện pháp với số loại kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Qua biểu đồ Hình 4.7 4.8 nhận thấy chủng T8 A1 khơng có chêch lệch mật độ vi khuẩn tồn phương pháp MTT kháng sinh đồ Trong chủng cịn lại có phần trăm vi khuẩn thí nghiệm MTT thấp so với kháng sinh đồ Riêng chủng 3B3, E8 mật độ 107cfu/ml có giá trị tương đương sang mật độ 106 cfu/ml lại có lượng vi khuẩn sau sử dùng chloramphenicol phương pháp MTT cao so với kháng sinh đồ Mật độ vi khuẩn 105 cfu/ml 120,00 100,00 % 80,00 10^5+AM+MTT 60,00 10^5+AM+KSD 40,00 20,00 E8 3B E2 23 A1 CA F2 55 CA F2 58 T8 E3 CA F2 60 ST L3 03 0,00 Vi khuẩn Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 105 cfu/ml tồn sau sử dụng Ampicillin thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ Mật độ vi khuẩn 10 cfu/ml 120,00 100,00 % 80,00 10^5+CH+MTT 60,00 10^5+CH+KSD 40,00 20,00 E8 3B E2 23 CA F2 55 CA F2 58 A1 T8 E3 CA F2 60 ST L 30 0,00 Vi khuẩn Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn mật độ 105 cfu/ml cịn tồn sau sử dụng Chloramphenicol thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Tương tự thế, mật độ 105 cfu/ml chủng 3B3, E8, STL303 có lượng vi khuẩn sau dùng Chloramphenicol phương pháp MTT cao so với kháng sinh đồ; chủng T8 A1 khơng có chêch lệch mật độ vi khuẩn tồn phương pháp chủng cịn lại có phần trăm vi khuẩn thí nghiệm MTT thấp so với kháng sinh đồ Riêng với Ampicillin hầu hết chủng vi khuẩn có giá trị tương đương phương pháp ngoại trừ CAF258 E223 ngược lại Qua biểu đồ từ Hình 4.3-4.10 nhận thấy việc sử dụng MTT để xác định mật độ vi khuẩn tồn sau sử dụng thuốc kháng sinh gần tương đương với phương pháp kháng sinh đồ (T8, A1) Ở chủng cịn lại CAF255, CAF258, 3B3, E8 có chênh lệch mức độ không cao Bên cạnh với thí nghiệm MTT, hàm luợng vi khuẩn tồn tác dụng kháng sinh xác định thấp so với phương pháp kháng sinh đồ Mặt khác biểu đồ cho thấy hầu hết 10 chủng vi khuẩn thí ngiệm cịn nhạy cảm với loại kháng sinh, Chloramphenicol cịn mẫn cảm cao với vi khuẩn Ampicillin 4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy kháng sinh thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ Ngày KSĐ MTT E8 3B E2 23 CA F2 58 CA F2 55 A1 T8 CA F2 60 E3 ST L3 03 Vi khuẩn Hình 4.11: Thời gian xác định nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn thí nghiệm MTT phương pháp kháng sinh đồ Qua biểu đồ nhận thấy thời gian xác định mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn nhờ vào thí nghiệm MTT thấp so với phương pháp kháng sinh đồ (số liệu chi tiết xem Phụ lục II Bảng E) Thời gian tiến hành thí nghiệm kháng sinh đồ nhanh 3,5 ngày chậm ngày; với MTT thời gian giảm (chủng E3, T8) 33 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com nhiều 19 chủng vi khuẩn lại Nguyên nhân phương pháp kháng sinh đồ cần có thời gian để vi khuẩn phát triển sau đặt đĩa kháng sinh; riêng thí nghiệm MTT giảm khoảng thời gian Điều tương tự với thí nghiệm trước sử dụng MTT nghiên cứu sinh vật khác Mshana (1998) nghiên cứu khả đề kháng rifampin Mycobacterium tuberculosis cho sử dụng MTT thời gian phát nhạy cảm M tuberculosis với rifampin ngày, so với phương pháp đếm khuẩn lạc trước tốn 4-5 tuần 4.2 Kết thí nghiệm mơ tươi 4.2.1 Sự sai khác mô bệnh mô bệnh sử dụng kháng sinh Mô thận tươi cắt thành lát mỏng cho vào 1ml nước muối sinh lý Sau dung dịch mơ thực theo bước phương pháp nghiên cứu cho mẫu vào giếng 96 hướng dẫn Bảng 4.6 đo máy microplate reader bước sóng 570nm thu kết trình bày Bảng 4.7( số liệu chi tiết xem phụ lục II Bảng D) 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Hình 4.12: Mẫu mơ & MTT NB ck cb+CH cb cb+AM cb cb+AM cb+CH Hình 4.13: Mẫu mơ & MTT sau ủ Ghi chú: NB: mẫu đối chứng khơng có vi khuẩn Ck: cá khỏe Cb: cá bệnh AM: ampicillin CH: chloramphenicol 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.5: Sự sai khác mô bệnh mô bệnh sử dụng kháng sinh Nguồn gốc cá NB& ck NB& cb ck& cb ck& cb+AM ck& cb+CH cb& cb+AM cb& cb+CH C1 - + + C2 + + + - - + + + + + - - + + + + - - - + + + + + - - + + C6 + + + - + + - + + + + + + + C8 + + + + + + + C9 + + + + - + + C10 + + + - - + + C11 + + + + + + + C12 + + + + + + + C13 + + - + + + + C14 + + + + + + + C15 + + + + + + + C16 + + + + + + + C17 + + + + + + + C18 + + + + + + + C19 + + - + + + + C20 + + + - - + + C21 + + + - - + + C22 + + + + + + + C23 + + + + + + + C24 + + + - + + + C25 + + + - - + + C26 + + + + + + + C27 + + + + + + + C28 + + + - - + + C29 + + + + + + + C30 + + + + + + + C31 + + + + + + + C32 + + + 32+/32 29+/32 + 11-/32; 21+/32 + 32+/32 + 12-/32; 20+/32 + Tỉ lệ - C7 + C5 + C4 + C3 32+/32 31+/32 Ghi chú: 1,2 , tương ứng với cá lấy từ nguồn cá cảm nhiễm A1, T8, CAF258 (+): có ý nghĩa với p5% 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CH: chloramphenicol, AM: ampicillin NB: mẫu đối chứng khơng có vi khuẩn ck: cá khỏe, cb: cá bệnh Qua kết Bảng 4.7 thấy cá khỏe cá bệnh sai khác có ý nghĩa với NB nhiên so sánh cá khỏe cá bệnh nhận thấy 32 mẫu cá thí nghiệm có 29/32 mẫu có sai khác cá khỏe cá bệnh Điều giải thích mơ bệnh ngồi mơ cịn có vi khuẩn dẫn đến chêch lệch so sánh hai giá trị Bên cạnh đó, so sánh cá khỏe cá bệnh có kháng sinh nhận thấy khơng có sai khác với nghiệm thức chiếm tỉ lệ 12/32 (ampicillin), 11/32 (chloramphenicol) Qua cho thấy sau ủ với kháng sinh mật độ vi khuẩn mô giảm, dẫn đến giá trị mô khỏe mơ bệnh tương đương nhau; cịn lại sai khác có ý nghĩa nghiệm thức với tỉ lệ 20/32 (ampicillin), 21/32 (chloramphenicol) kháng sinh giúp mật độ vi khuẩn mơ giảm nhiều, dẫn đến sai khác lớn hai giá trị Ngồi kết Bảng 4.7 cịn thể sai khác cá bệnh cá bệnh sử dụng kháng sinh , 32 mẫu cá tất có sai khác cá bệnh có khơng sử dụng kháng sinh; ngoại trừ chloramphenicol 31/32 mẫu có sai khác nghiệm thức Điều cho thấy qua thí nghiệm MTT xác định ampicillin chloramphenicol nhạy cảm với hầu hết 32 mẫu cá Qua nhận xét thấy sử dụng MTT việc xác định mức độ nhạy kháng sinh vi khuẩn E.ictaluri Bên cạnh thực trực tiếp thí nghiệm MTT mơ tươi xác định mức độ nhạy kháng sinh vi khuẩn có mơ bệnh Bảng 4.6: Số lượng (%) tế bào tồn sau sử dụng kháng sinh thí nghiệm MTT mơ Cá bệnh+AM+MTT Cá bệnh+CH+MTT Cá 62,50 54,10 Cá 58,94 62,84 Cá 71,46 64,46 Cá 93,21 87,13 Cá 87,20 80,09 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Cá 88,41 98,02 Cá 91,54 87,82 Cá 91,61 82,84 Cá 96,02 90,27 Cá 10 93,21 87,13 Cá 11 85,69 75,73 Cá 12 114,33 112,64 Cá 13 90,63 85,64 Cá 14 89,27 86,54 Cá 15 83,00 82,23 Cá 16 88,27 85,59 Cá 17 83,78 76,24 Cá 18 83,96 82,08 Cá 19 77,70 68,92 Cá 20 76,03 75,32 Cá 21 81,48 83,85 Cá 22 65,59 77,93 Cá 23 85,54 79,79 Cá 24 78,31 88,32 Cá 25 86,07 81,31 Cá 26 83,96 82,99 Cá 27 76,95 68,65 Cá 28 85,00 88,77 Cá 29 64,68 75,79 Cá 30 74,64 69,35 38 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Cá 31 86,79 83,12 Cá 32 62,50 71,10 Dung dịch mơ cá bệnh có phần mô vi khuẩn gây bệnh Giả sử lượng mô tồn giếng tương đương (vì thí nghiệm 0,1g thận với mẫu cá) khả kháng sinh gây ảnh hưởng tế bào mô Nhờ vào điều qua kết Bảng 4.8 nhận thấy lượng tế bào( mô vi khuẩn) sau sử sụng kháng sinh giảm nhiều, 32 mẫu cá thí nghiệm có 31/32 mẫu thể mật độ tế bào giảm sau dùng kháng sinh dao động từ 54,1-98,02% Đối với cá bệnh sau sử dụng ampicillin, hàm lượng tế bào giảm thấp cá (58,94%) , cao cá (96,02%) phần lớn số mẫu cá lại dao động từ 75-93% Những mẫu cá lấy từ nguồn cá gây cảm nhiễm chủng A1, T8, CAF258 (xem phụ lục II bảng D) đối chiếu với kết phần trăm vi khuẩn tồn chủng theo phương pháp kháng sinh đồ (Bảng 4.2) kết MTT vi khuẩn (Bảng 4.5) thấy giá trị tương đương giá trị mô cá cịn cao (chẳng hạn thí nghiệm MTT cá lấy từ nguồn cá gây cảm nhiễm chủng CAF258 có mật độ vi khuẩn sau sử dụng kháng sinh 96,02%, so sánh với kết số lượng vi khuẩn Bảng 4.2 96% ) Nguyên nhân mô cá sử dụng trực tiếp q trình thực thí nghiệm cịn mơ lẫn dung dịch dẫn đến giá trị đo mơ thường cao Vì giá trị gần tương đương nên nhờ vào xác định cá nhạy hay kháng với ampicillin (như cá giá trị nêu xấp xỉ cho thấy cá nhạy với ampicillin mức độ thấp) Ngoài qua bảng kết cho thấy số lượng tế bào tồn sau sử dụng chloramphenicol thấp so với việc dùng ampicillin Trong 32 mẫu cá có 24/32 mẫu có phần trăm tế bào tồn (mơ vi khuẩn) sau dùng chloramphenicol thấp so với ampicillin chênh lệch số lượng tế bào tồn kháng sinh từ 1-10% (kết Bảng 4.8) Thơng qua thấy chloramphenicol phá hủy tế bào vi khuẩn tồn mơ bệnh nhiều so với ampicillin Qua nhận thấy sử dụng MTT không xác định xác mật số vi khuẩn trực tiếp mơ bệnh sau sử dụng kháng sinh so sánh mức độ nhạy loại kháng sinh với 39 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Bên cạnh việc xác định khả nhạy kháng sinh với vi khuẩn gần tuơng đương phương pháp kháng sinh đồ, thí nghiệm MTT giảm thời gian nhiều Nếu nghiên cứu này, thời gian làm kháng sinh đồ nhanh 3,5 ngày chậm ngày thí nghiệm MTT mơ tươi cịn 1,5 ngày Ngồi sử dụng MTT để xác định tính nhạy kháng sinh giảm giá thành từ 7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ 40 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận 5.1.1 Sự mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn theo kháng sinh đồ Các chủng vi khuẩn 3B3, E3, E8, CAF260, A1, CAF255, STL303 nh ạy cảm với ampicillin chloramphenicol Riêng T8 kháng chloramphenicol; CAF258, E223 kháng ampicillin Mức độ mẫn cảm vi khuẩn chloramphenicol cao so với ampicillin 5.1.2 Sự mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn theo thí nghiệm MTT Số lượng vi khuẩn tồn sau sử dụng kháng sinh thí nghiệm MTT kháng sinh đồ tương đuơng Phần trăm vi khuẩn tồn sau sử dụng chloramphenicol thấp vi khuẩn sử dụng ampicillin 5.1.3 Sự mẫn cảm kháng sinh mơ theo thí nghiệm MTT Lượng tế bào tồn mô cá bệnh (mô vi khuẩn) sử dụng chloramphenicol thấp so với ampicillin 5.2 Đề xuất Hạn chế tồn đọng mô dung dịch vi khuẩn lấy từ mô bệnh Thực thí nghiệm MTT: khoảng thời gian khác Nghiên cứu phát triển vi khuẩn nồng độ kháng sinh khác thuốc thử MTT 41 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Benbrook C 2002 Antibiotic Drug Use in U S Aquaculture IATP Report, 18pp Caviedes L., J Delgado., R H Gilman 2002 Tetrazolium Microplate Assay as a rapid and inexpensive Colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis 40(5): 1873-1874 Crumlish M., T T Dung., J F Turnbull., N T N Ngọc & H W Ferguson 2002 Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvagel), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Diseases 25: 733-736 Dixon, B 2007 Antibiotic resistance of bacterial fish pathogens Journal of the World Aquaculure Society 25: 60-63 Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, T Somsiri, S Chinabut, F Yussoff, M Shariff, K Bartie, G Huys, M Giacomini, S Berton, J Swings & A Teale 2005 Xác định tính kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phâ lập từ hệ thống nuôi thủy sản Đồng sông Cửu Long, Việt Nam Tạp chí Nghiên cứu khoa học 2005:4 136-144 Đỗ Thị Hịa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội.2004 Bệnh học thủy sản Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội.423pp Ferguson H W, J F Turnbull, A Shin, K Thompson, T.T Dung and M Crumlish 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Disease 2001:509-513 Freimoser F M., C.A Jakob, M Aebi and U Tuor 1999 The MTT [3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities Applied and Environmental Microbiology 3727-3729 Gibbs S G., C.F Green, P.M Tarwater, L.C Mota, K.D Mena and P.V Scarpino 2006 Isolation of antibiotic resistant bacteria from the air plume downwind of a swine confined or concentrated animal feeding operation Environmental health Perspectives 114:1032–1037 Geert Huys, 2002 Antibiotic susceptibility testing of aquaculture associated bacteria with the dics diffusion method Ghent University Belgium Huỳnh Chí Thanh 2007 Xác định đặc điểm sinh hóa bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasius 42 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com hypophthalmus) kháng sinh Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Thủy Sản Đại học Cần Thơ Lê Thị Kim Liên Nguyễn Thị Như Ngọc 2002 Bài giảng thuốc & hóa chất dùng thủy sản Đại học Cần Thơ Lila R and Eleonor A T 2004 Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment Aquaculture Extension Manual 37, 35pp Mashhadian N V., M R Jaafari., A Nosrati 2007 Differential toxicity of Rifampin on HEPG2 and HELP2 cells using MTT test and Electron microscope Pharmacologyonline 3: 405-413 Mshana, R.N., G Tadesse, G Abate and H Miorner 1998 Use of 3-(4,5Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide for Rapid Detection of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Journal of Clinical Microbiology 36:1214-1219 Mosmann T.1983.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays Journal of Immunol Methods 65:55-63 National Animal Health Monitoring System (NAHMS) 1997 Catfish 97 Study APHIS/USDA Washington, D C NCCLS 2002 Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; Approved standardsecond edition NCCLS document M31- A2 (ISBN 1- 56238-461-9) Ngu yễn Chính 2005 Đánh giá tình hình sử dụng kháng sinh nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh An GiangCần Thơ Luận văn cao học, Khoa Th ủy Sản, Đại học Cần Thơ Nguyễn Hữu Thịnh Trương Thanh Loan 2007 Phân lập khảo sát đặc điểm kháng sinh Edwardsiela ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra, Pangasius hypophthalmus, ni thâm canh Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 1&2/2007 Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh, Từ Thanh Dung Lê Xuân Sinh 2005 Bacterial resistance to antimicrobials use in shrimp and fish farms in the Mekong Delta, Vietnam Proceeding of the international workshop on: Antibiotic Resistance in Asian Aquaculture Environments Nguyễn Thị Thúy Hằng 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila khoa Thủy sản Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Thủy Sản Đại học Cần Thơ 43 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Raut U., P Narang., DK Mendiratta., R Narang & V Deotale 2008 Evaluation of rapid MTT tube method for detection of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isonizad Indian Journal of Medical Microbiology 26(3): 222-27 Ribeiro, M O., M.D.S Gomes, S.G Senna, M.L.R Rossetti and L.D.S Fonseca 2004 Evaluation of rapid microplate assays using cellularviability indicators to determine patterns of susceptibility to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis strains.The Microbiology Institute Ricki L 1995 The rise of antibiotic- resistant infections FDA consumer magazine September 1995 Schrade K., Harries M D 2006 A rapid bioassay for bactericides against the catfish pathogens edwardsiella ictaluri and flavobacterium columnare Aquaculture Research 37(9): 928-937 Shotts, E.B., V.S Blazer & W.D Waltman 1986 Pathogenesis of expermental Edwardsiella ictaluri infections in channel catfish (Ictalurus punctatus) Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 43:36-42 Stock I., B Wiedemann 2001 Natural antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, E Ictaluri and E.hoshinae Antimicrobial Agents And Chemotherapy 45(8): 2245-2255 Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chun mơn bệnh học thủy sản 2008 Bộ môn Sinh học & Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần thơ Tiết Ngọc Trân 2007 So sánh khả gây bệnh hai dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasius hypophthalmus) cá nheo mỹ (ictalurus punctatus) Luận văn đại học Khoa Thủy Sản Trường Đại học Cần Thơ Trần Anh Dũng 2005 Khảo sát tác nhân gây bệnh ao nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh An Giang Cần Thơ Luận văn cao học Khoa Thủy Sản Trường Đại học Cần Thơ Trần Thị Thu Hằng 2006 Dược lực học Nhà xuất Phương Đông trang 629-699 Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142 44 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Valerie I., J.R Ronald and R.B Niall 1993 Bacterial diseases of fish Institute of aquaculture 312p Zorrilla I., M.C Balebona and M.A Morinigo 2001 Adaptation of an [3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyl tetrazolium bromide] assay to evaluate the cytotoxicity of the extracellular products of micro-organisms pathogenic to fish Letters in Applied Microbiology 33: 329-333 www.atpvietnam.com, 8/11/2008 www.nafiquaved.gov.vn, 14/11/2008 www.cimsi.org.vn, 18/11/2008 http://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay, 1/12/2008 http://agriviet.com/vlnews/vlkythuat/381/Xac_dinh_tac_nhan_gay_benh_trang _mang,_trang_gan_tren_ca_tra,_ca_ba_sa_nuoi_o_An_Giang.html , 1/12/2008 http://www.atcc.org/MTTCellProliferationAssay/tabid/569/Default.aspx, 1/12/2008 45 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC I A Môi trường Môi trường NA NA (nutrient agar) 20g Nước cất 1000ml Hịa tan mơi trường NA vào nước cất, sau tiệt trùng nhiệt độ 121oC 15 phút Để nhiệt độ hạ xuống khỏang 50oC tiến hành đổ môi trường đĩa với độ dày khoảng 4mm (khỏang 20ml/ đĩa Petri) Đặt đĩa vào tủ ấm 28-30oC 24 để kiểm tra nhiễm khuẩn giữ điều kiện nhiệt độ phịng sử dụng đĩa ngày B Nước muối sinh lý (0,85% NaCl) NaCl 8,5g Nước cất 1000ml Hòa tan 0,85g NaCl vào 100ml nước cất, cho 3ml nuớc muối sinh lý vào ống nghiệm trùng 121oC 15 phút C Ống chuẩn McFarland số (3 x 108 cfu/ml) Ống McFarland 1% H2SO4 (ml) 9,9 9,7 1% BaCl2 (ml) 0,1 0,3 Mật đổ vi khuẩn khoảng (x108cfu/ml D Dung dịch MTT 10 µl dung dịch MTT ( hòa tan 5mg/ml MTT phosphate buffered saline pH 7,2) 46 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ... kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ quan bệnh phẩm mủ gan cá tra? ?? nhằm đánh giá độ tin cậy biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ quan bệnh phẩm mủ gan cá tra Nhờ vào đề xuất việc sử dụng. .. THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC... bệnh mủ gan cá tra phương pháp lập kháng sinh đồ Tuy nhiên phương pháp lập kháng sinh đồ truyền thống đòi hỏi nhiều thời gian để phân lập, ni cấy Vì đề tài ? ?Nghiên cứu khả ứng dụng biện pháp kiểm